專利名稱:快速鑒定抗青枯病花生種質的方法
技術領域：
本發明涉及植物種質鑒定技術，具體涉及一種獲得抗青枯病花生種質的方法。
背景技術：
花生是世界五種最重要的油料作物之一，也是許多發展中國家植物油和蛋白質的重要來源。我國是世界上最大的花生生產、消費和出口國。由Ralstonia solanacearum引起的細菌性萎蔫病(青枯病)是花生生產中重要的病害之一，常導致大面積減產甚至絕產。作為土傳病害，花生青枯病很難用化學方法防治，較長周期的輪作有一定效果，但其受耕地面積限制。生物防治也是一種重要的方法，并取得一定效果，如2004年7月28日公開的中國專利申請，其公開號為CN1515666A，公開了一種用于防治青枯病假單胞菌的篩選方法，但由于花生青枯病在花生各個時期(苗期、初花期、盛花期等)均有發生，造成生物防治費用較高，于是培育和種植 抗病品種是防治這一病害較為經濟有效的途徑。
花生種質青枯病抗性可于田間和室內鑒定。田間自然鑒定法需地力均勻、地勢平坦、病害壓力一致的自然病地，只能在花生生長季節進行，周期較長，收獲時統計植株存活率，難以確定個體(單粒種子或單個植株)的抗病性。人工接種鑒定法，可將種子浸泡于菌液中而后播種于田間，其它步驟與田間自然鑒定法相同；或在水培花生生長至3-4葉齡時，采用傷根浸根法對花生進行青枯菌接種處理，10-15天后調查植株發病情況；亦可在花盆內栽培的植株上進行剪葉接種:在花生6葉期，從上向下第二、三葉頂端兩片小葉1/4處剪切葉片，每蘸I次菌液剪2片葉。剪葉植株置于26°C培養箱中，濕度保持為75%，4d后記錄發病情況。其中后兩種方法可用于確定單個植株的抗性。但仍然存在占用較大空間、難以與遺傳育種實踐結合的問題。因此，迫切需要一種受時間，空間限制較少，能夠在實驗室中快速鑒定獲得抗青枯菌花生種質的方法。
發明內容
本發明的技術效果能夠克服上述缺陷，提供一種快速鑒定抗青枯病花生種質的方法，其在田間植株生長過程中進行，能夠在實驗室內操作的快速鑒定抗青枯病花生種質的技術。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:其包括如下步驟:
(I)培養花生青枯菌，制備IO8個/ml或IO9個/ml濃度的菌懸液；
(2)從播后55-65天的健康花生植株第2對側枝頂端切取長有葉片的莖枝，置于上述菌懸液中培養；
(3)培養3天后，從受測莖枝的枯萎程度來判斷該株花生是否抗青枯病，在濃度為IO8個/ml的菌液中，沒有出現顯著枯萎癥狀的即為抗青枯病花生種質；在濃度為IO9個/ml的菌液中，沒有出現顯著枯萎癥狀的即為高抗青枯病花生種質。
本發明的內容是在花生生長時期，從花生植株上第2對側枝頂端取部分莖枝，置于濃度為IO8個/ml或IO9個/ml的花生青枯菌菌懸液中共培養，經過一段時間培養后，從莖枝葉片的變化來判斷其青枯病抗性。
步驟(I)中的青枯菌在NA固體培養基上劃線培養。NA固體培養基組分為每升培養基中含葡萄糖log、蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母粉0.5g、瓊脂20g，pH值為7.0-7.2。此培養基為已公開的青枯菌基本培養基。
步驟(I)中的青枯菌培養方式為:挑取單菌落懸浮后，均勻涂布在NA固體培養基上，待菌苔長滿培養基表面后，用雙蒸水將其沖洗下來，用血球計數板計算其濃度，將菌液濃度調整到IO8個/ml或IO9個/ml。
步驟(2 )中切取時刀片與莖枝成垂直方向切下，使截面積最小化，減少對被切取枝條的損害，可使被截處組織均勻的與菌液接觸，提高實驗準確性。
步驟(2)中的培養步驟置于光照培養箱中，28°C按光周期和暗周期各12小時交替培養。此條件模仿田間花生在青枯病發病時期的自然生長環境，且此溫度為青枯菌的最適生長溫度，有利于在菌液一莖枝共培養條件下準確測得待測花生是否具有青枯病抗性。
本發明技術彌補了現行的花生青枯病抗性鑒定方法周期長、操作繁瑣、難以鑒定分離世代材料抗性同時不影響其它農藝性狀選擇而與遺傳育種實踐脫節的不足。
具體實施方式
本發明快速鑒定抗青枯病花生種質的方法，包括如下步驟:
(I)將保存的青枯菌在NA培養基上劃線培養，挑取單菌落懸浮后，涂布NA培養基，待菌苔長滿培養基表面后，用雙蒸水將其沖洗下來。用血球計數板計算其濃度，將菌液濃度調整到IO8個/ml或IO9個/ml。
(2)于上午10時之前，切取播種后60天左右健康花生植株第2對側枝的頂芽，切取時刀片與莖成垂直方向，迅速切下，立即置于上述菌懸液中，置28°C光照培養箱中，按光周期和暗周期各12小時培養。
(3)培養3天后，觀察莖枝枯萎情況，在濃度為IO8個/ml的菌液中，沒有出現顯著枯萎癥狀的即為抗青枯病花生種質(包括高抗和中抗);在濃度為IO9個/ml的菌液中，沒有出現顯著枯萎癥狀的即為高抗青枯病花生種質。
我們用本發明的方法鑒定了山東省花生研究所生物技術實驗室保存的40份花生樣品，該批樣品之前已通過田間實驗得知其抗青枯病特性。將這40份樣品播種，待其長出第2對側枝時切取健壯莖枝，按本發明的方法置于制備好的菌懸液中共培養，實驗結束后統計，所有40份花生樣品的青枯病抗性鑒定結果與田間實驗得出的結果完全一致。抗病種質與易感種質的枯萎程度呈現顯著差別。
權利要求
1.一種快速鑒定抗青枯病花生種質的方法，其特征在于，包括如下步驟: (O培養花生青枯菌，制備IO8個/ml或IO9個/ml濃度的菌懸液； (2)從播后55-65天的健康花生植株第2對側枝頂端切取長有葉片的莖枝，置于上述菌懸液中培養； (3)培養3天后，從受測莖枝的枯萎程度來判斷該株花生是否抗青枯病，在濃度為IO8個/ml的菌液中，沒有出現顯著枯萎癥狀的即為抗青枯病花生種質；在濃度為IO9個/ml的菌液中，沒有出現顯著枯萎癥狀的即為高抗青枯病花生種質。
2.根據權利要求
1所述的快速鑒定抗青枯病花生種質的方法，其特征在于，步驟(I)中的青枯菌在NA固體培養基上劃線培養。
3.根據權利要求
2所述的快速鑒定抗青枯病花生種質的方法，其特征在于，NA固體培養基組分為每升培養基中含葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母粉0.5g、瓊脂20g，pH值為 7.0-7.2。
4.根據權利要求
2所述的快速鑒定抗青枯病花生種質的方法，其特征在于，步驟(I)中的青枯菌培養方式為:挑取單菌落懸浮后，均勻涂布在NA固體培養基上，待菌苔長滿培養基表面后，用雙蒸水將其沖洗下來，用血球計數板計算其濃度，將菌液濃度調整到IO8個/ml或 IO9 個/ml。
5.根據權利要求
1所述的快速鑒定抗青枯病花生種質的方法，其特征在于，步驟(2)中切取時刀片與莖枝成 垂直方向切下。
6.根據權利要求
1或5所述的快速鑒定抗青枯病花生種質的方法，其特征在于，步驟(2)中的培養步驟置于光照培養箱中，28°C按光周期和暗周期各12小時交替培養。
專利摘要
本發明涉及植物種質鑒定技術，本發明的快速鑒定抗青枯病花生種質的方法，包括如下步驟(1)培養花生青枯菌，制備108個/ml或109個/ml濃度的菌懸液；(2)從播后55-65天的健康花生植株第2對側枝頂端切取長有葉片的莖枝，置于上述菌懸液中培養；(3)培養3天后，從受測莖枝的枯萎程度來判斷該株花生是否抗青枯病，在濃度為108個/ml的菌液中，沒有出現顯著枯萎癥狀的即為抗青枯病花生種質；在濃度為109個/ml的菌液中，沒有出現顯著枯萎癥狀的即為高抗青枯病花生種質。本發明彌補了現行的花生青枯病抗性鑒定方法周期長、操作繁瑣、難以鑒定分離世代材料抗性，不影響其它農藝性狀選擇而與遺傳育種實踐脫節的不足。
文檔編號C12Q1/18GKCN103194524SQ201310116635
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月3日
發明者王傳堂, 于洪濤, 唐月異, 王秀貞, 吳琪, 張建成, 崔鳳高 申請人:山東省花生研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan