專利名稱:一種自誘導培養基及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物發酵技術領域：
，尤其涉及一種自誘導培養基及其應用。
背景技術：
青霉索G酰胺酶(EC3.5.1.11)是半合成β-內酰胺類抗生素工業的重要酶,主要用于水解青霉素或頭孢菌素分別生成母核6-ΑΡΑ (6-氨綦青霉靛酸)或7-ADCA (7-氨基頭孢烷酸)。
此酶屬于水解酶家族，作用于肽鍵以外的碳-氮鍵，特別是在直鏈酰胺鍵。系統的名字是青霉素水解酶，其他共同的使用的名字包括青霉素酰化酶，脂肪酶Novozym217，α-酰基-β-內酰胺水解酶，氨芐青霉素酰化酶。目前該酶已大規模應用于工業生產內酰胺類抗生素的關鍵中間體和半合成內酰胺類抗生素。
在基因工程菌中表達青霉素酰胺酶時，常選用基于強啟動子Τ7的表達系統。這類表達系統中，T7RNA聚合酶能特異識別Τ7啟動子，從而開啟下游基因的大量轉錄，有效地啟動目的蛋白的表達。
但是基于Τ7啟動子的表達系統也有其不足之處。蛋白的表達需要用IPTG誘導，步驟比較繁瑣。而且，一定濃度的IPTG會對細菌產生毒性，直接影響蛋白的表達效率。另夕卜，由于lac mRNA本底水平的組成型合成，可導致目的蛋白的少量表達。研究表明，非目的性表達出的目的蛋白可能會導致目的蛋白的不穩定、甚至不表達。此外，目前培養大腸桿菌一般使用LB培養基，其組分之一是胰蛋白胨，由于胰蛋白胨是使用胰酶消化酪蛋白后的產物，而酪蛋白一般是從牛奶或大豆中提取的，因此，胰蛋白胨中存在的微量乳糖成分會促進細菌產生非目的性表達，從而影響表達量。
利用自誘導培養基培養細菌使之表達外源蛋白的方法解決了上述技術問題。公開號為CN101235362B的中國專利文獻公開了一種用于原核表達系統表達外源蛋白的復合自動誘導培養基，每升培養基中含有以下重量的各組分:胰蛋白胨10 40g，酵母提取物5 20g,六水琥拍酸鈉O 8.1g, 二水朽1檬酸鈉O 1.5g,甘油15 50g,葡萄糖0.5g,乳糖2g，磷酸二氫鈉3.55g，磷酸二氫鉀3.40g，氯化銨2.68g，硫酸鈉0.71g，七水硫酸鎂0.50g，六水氯化鐵0.03go
在培養基中同時加入葡萄糖和乳糖，大腸桿菌會優先利用葡萄糖，在葡萄糖耗盡前不會誘發Iac啟動子；當葡萄糖耗盡時，乳糖發揮作用，開啟Iac啟動子誘導外源蛋白表達，而乳糖的代謝產物也同時作為細菌生長的碳源。自誘導的方法省去了監測培養基的菌密度和添加IPTG誘導蛋白表達的步驟，一方面使得實驗操作更加簡潔，另一方面避免了IPTG對細菌的毒害作用。
但現有的自誘導培養基的配方仍可繼續完善，以提高目的蛋白的表達量。
發明內容
本發明提供了一種用于原核表達系統的自誘導培養基，該培養基能高效誘導表達外源蛋白。
一種用于原核表達系統的自誘導培養基，配方為:阿拉伯糖2 10g/L，葡萄糖
0.5 2.5g/L，甘油5 25g/L，蛋白胨8 12g/L，磷酸鹽6.5 7.4g/L，硫酸鹽1.1
1.3g/L，NH4Cl2.6 2.7g/L，痕量元素溶液適量。
更優選地,配方為:阿拉伯糖2 5g/L,葡萄糖0.5 lg/L,甘油5 15g/L,蛋白胨9 118/1，磷酸鹽6.7 7.lg/L，硫酸鹽 1.15 1.25g/L，NH4C12.65 2.7g/L，痕量元
素溶液適量。
所述自誘導培養基中添加有磷酸鹽，用于保持自誘導培養基的pH，避免pH太低影響細胞生長。所述磷酸鹽優選為KH2PO4和Na2HPO4中的至少一種。當同時選用KH2PO4和Na2HPO4時，KH2PO4的添加量優選為3.3 3.5g/L，Na2HPO4的添加量優選為3.4 3.6g/L。
所述硫酸鹽優選為MgSO4和Na2SO4中的至少一種。當同時選用MgSO4和Na2SO4時，MgSO4的添加量優選為0.45 0.50g/L, Na2SO4的添加量優選為0.70 0.75g/L。
痕量元素溶液給菌株生長提供微量元素,促進其生長,優選的,所述痕量元素溶液為 195 205 μ L/L,包含 48 52 μ M 的 Fe3+，8 12 μ M 的 Mn2+、Zn2+，1.8 2.2 μ M 的 Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O242' SeO32' B4O廣。
本發明還提供了所述自誘導培養基在生產青霉素酰胺酶中的應用，具體包括:
將含青霉素酰胺酶基因的原核表達菌株接種到所述自誘導培養基中，發酵，提取青霉素酰胺酶。
所述的原核表達菌株包含有T7/lac啟動子。
當將該原核表達菌株置于本發明的自誘導培養基中培養時，葡萄糖促使細胞的高密度生長，在葡萄糖耗盡前不會誘發啟動子，有效阻止泄漏表達；當葡萄糖被利用完全、細胞密度達到飽和時，啟動子可打開，并開啟下游基因的大量轉錄，誘導目的蛋白的表達；甘油作為誘導后期良好的碳源，促進細胞生長，增加蛋白表達量。
原核表達菌株在表達青霉素酰胺酶的過程中，要對前體蛋白進行翻譯后修飾。與乳糖相比，阿拉伯糖的誘導能力相對較弱，能夠避免前體蛋白在細胞質中的過度積累，給翻譯后修飾過程以充足的時間，從而減少包涵體的形成，最終提高青霉素酰胺酶的表達量。
所述原核表達菌株的宿主細胞優選為大腸桿菌(E.coli)，大腸桿菌是表達外源蛋白的常用工程菌，適于大規模工業生產。
為使誘導初期菌株的生長狀態達到最佳，接種前，需先對菌株進行活化，取對數生長期的菌株進行接種，接種量優選為0.1% 5%，更優選為1%。發酵溫度為25 27°C，發酵時間為48 72小時，轉速為180 220r/min。
發酵完成后，收集菌體，于預冷的無菌水中重懸浮后采用超聲波、高壓或凍融等方法破碎細胞，離心收集上清液即為初酶液。
與現有技術相比，本發明的有益效果為:
本發明的自誘導培養基利用阿拉伯糖作為底物誘導目的蛋白表達，可調控性強，蛋白表達量高；在一個具體實施方式
中，青霉素酰胺酶酶活達6U/mL，遠遠高于使用乳糖誘導的蛋白表達量，對開發生產青霉素酰胺酶的新工藝具有重要的指導意義。
具體實施方式
[0025]下面以含青霉素酰胺酶編碼基因和T7/lac啟動子的重組大腸桿菌(以下簡稱重組大腸桿菌)為例，詳細說明本發明自誘導培養基在生產青霉素酰胺酶中的應用。
重組大腸桿菌的構建方法與文獻(Expressionand purification of penicillinG acylase enzymes from four different micro-organisms, and a comparativeevaluation of their synthesis/hydrolysis ratios for cephalexin.ProteinExpression and Purifi cation.2006，46 (I) 107實施例1LB培養基IPTG誘導
(I)LB培養基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，NaC110g/L,超純水配制，ρΗ7.0 ；
(2)挑取重組大腸桿菌，按1:100的比例接種于5mL含卡那霉素(50μ g/mL)LB液體培養基中，于37°C，200rpm振蕩培養過夜；
(3)取0.5mL培養液轉接于50mL含氨芐青霉素(50 μ g/mL)的LB液體培養基中，于37°C、200rpm振蕩培養2 4小時，至0D600約為0.6 ；
(4)向培養物中加入誘導物IPTG至終濃度0.lmmol/L,20 30°C下誘導培養12小時；
(5)將發酵液于IOOOOrpm離心lOmin，收集菌體細胞，將菌體細胞重懸浮于預冷的磷酸緩沖液中進行超聲破碎，離心收集上清液，檢測酶活。
具體步驟為:
取上清液20 μ L加入980μ L50mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.5)中，37°C保溫；再加入ImL已在37°C下預熱的0.9mg/mL NIPAB溶液，精確反應4min，加入ImL乙醇終止反應；取反應液在分光光度計下 波長檢測405nm處的吸光值。
酶活力定義:在上述反應條件下，Imin水解I μ mo I的NIPAB所需要青霉素酰胺酶的量為I個酶活力單位U。
酶活力計算公式如下:
酶活力(U/mL)=103*A405*V0/t/p/Vl ；
其中:
t:反應時間(min) ；p:標準曲線的斜率；V0:反應體系總體積；A405:樣品光密度讀數與空白樣品光密度讀數差；V1:酶液體積(mL);比色皿厚度默認為1，單位為Cm。
利用LB培養基和IPTG誘導方式，獲得發酵液的青霉素酰胺酶酶活力為0.5U/mL。
實施例2乳糖自誘導
(I)自誘導培養基:α -乳糖 2g/L,葡萄糖 0.5g/L,甘油 5g/L, KH2P043.4g/L,MgSO40.49g/L，蛋白胨 10g/L，Na2HP043.55g/L，Na2SO40.71g/L，NH4Cl2.67g/L，痕量元素溶液200 μ L/L，用超純水配制；
其中，痕量元素溶液為:50μ M FeC13,20yM CaCl2.2Η20，10 μ MMnCl2.4Η20，10 μ MZnSO4.7Η20, 2 μ M CoCl2.6Η20, 2 μ M CuCl2, 2 μ MNiCl2, 2 μ M Na2Mo7O24, 2 μ M Na2SeO3, 2 μ MH3B4O7,用超純水配制；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養，至0D600達到2.0 3.0左右；
(3)將(2)中的種子培養液以1%的接種量接種于裝有50mL自誘導培養基的250mL三角瓶中，于25°C培養40小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達到 2.955U/mL。
實施例3乳糖、阿拉伯糖共同自誘導
(I)自誘導培養基:α-乳糖2g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，阿拉伯糖2g/L，ΚΗ2Ρ043.4g/L, MgSO40.49g/L，蛋白胨 10g/L，Na2HP043.55g/L，Na2SO40.71g/L, NH4C12.67g/L,痕量元素溶液200 μ L/L，用超純水配制；
痕量元素溶液組成如實施例2步驟(I)所示；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養，至0D600達到2.0 3.0左右；
(3)將此種子培養液以1%的接種量接種于裝有50mL步驟(I)的自誘導培養基的250mL三角瓶中，于25°C培養40小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達到 3.375U/mL。
實施例4乳糖、阿拉伯糖共同自誘導，無蛋白胨
(I)自誘導培養基:α -乳糖2g/L,葡萄糖0.5g/L,甘油5g/L,阿拉伯糖2g/L,KH2P043.4g/L，MgSO40.49g/L，Na2HP043.55g/L，Na2SO40.71g/L，NH4Cl2.67g/L，痕量元素溶液200 μ L/L，用超純 水配制；
痕量元素溶液組成如實施例2步驟(I)所示；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養，至0D600達到2.0 3.0左右；
(3)將此種子培養液以1%的接種量接種于裝有50mL步驟(I)的自誘導培養基的250mL三角瓶中，于25°C培養40小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達到 2.955U/mL。
實施例5阿拉伯糖自誘導
(I)自誘導培養基:葡萄糖lg/L，甘油15g/L，阿拉伯糖5g/L，KH2P043.5g/L，MgSO40.5g/L，蛋白胨 llg/L，Na2HP043.6g/L，Na2SO40.75g/L，NH4Cl2.7g/L，痕量元素溶液195 μ L/L，用超純水配制；
痕量元素溶液組成如實施例2步驟(I)所示；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養，至0D600達到2.0 3.0左右；
(3)將此種子培養液以1%的接種量接種于裝有50mL步驟(I)的自誘導培養基的250mL三角瓶中，于25°C培養40小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達到 3.735U/mL。
實施例6阿拉伯糖自誘導500mL發酵
(I)自誘導培養基:葡萄糖0.8g/L,甘油10g/L,阿拉伯糖3g/L, KH2P043.3g/L,MgSO40.45g/L，蛋白胨 9g/L，Na2HP043.4g/L，Na2SO40.70g/L，NH4Cl2.65g/L，痕量元素溶液200 μ L/L，用超純水配制；
痕量元素溶液組成如實施例2步驟(I)所示；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養，至0D600達到2.0 3.0左右；
(3)將此種子培養液以1%的接種量接種于裝有500mL步驟(I)的自誘導培養基的2L三角瓶中，于25°C培養60小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達到 5.250U/mL。
實施例7阿拉伯糖自誘導3.5L發酵
(I)自誘導培養基:葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，阿拉伯糖2g/L，KH2P043.4g/L，MgSO40.49g/L，蛋白胨 10g/L，Na2HP043.55g/L，Na2SO40.71g/L，NH4Cl2.67g/L，痕量元素溶液205 μ L/L，用超純水配制；
痕量元素溶液組成如實施例2步驟(I)所示；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養，至0D600達到2.0 3.0左右；
(3)將此種子培養液以0.1%的接種量接種于裝有3.5L步驟(I)的自誘導培養基的5L三角瓶中，于25°C培養72小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達到 6.0U/mL。
表I不同誘導物存在下青霉素酰胺酶的表達量
權利要求
1.一種自誘導培養基，其特征在于，配方為:阿拉伯糖2 10g/L,葡萄糖0.5 2.5g/L，甘油5 25g/L，蛋白胨8 12g/L，磷酸鹽6.5 7.4g/L，硫酸鹽1.1 1.3g/L，NH4Cl2.6 2.7g/L，痕量元素溶液適量。
2.如權利要求
1所述的自誘導培養基，其特征在于，配方為:阿拉伯糖2 5g/L，葡萄糖0.5 lg/L,甘油5 15g/L,蛋白胨9 llg/L,磷酸鹽6.7 7.lg/L,硫酸鹽1.15 1.25g/L，NH4Cl2.65 2.7g/L，痕量元素溶液適量。
3.如權利要求
2所述的自誘導培養基，其特征在于，所述磷酸鹽為KH2PO4和Na2HPO4中的至少一種。
4.如權利要求
2所述的自誘導培養基，其特征在于，所述硫酸鹽為MgSO4和Na2SO4中的至少一種。
5.如權利要求
1所述的自誘導培養基，其特征在于，所述痕量元素溶液為195 205 μ L/L,包含 48 52 μ M 的 Fe3+，8 12 μ M 的 Mn2+、Zn2+，L 8 2.2 μ M 的 Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O242、SeO32、B4O73。
6.如權利要求
1 5任一所述的自誘導培養基在生產青霉素酰胺酶中的應用。
7.如權利要求
6所述的應用，其特征在于，包括:將含青霉素酰胺酶基因的原核表達菌株接種到如權利要求
1 5任一所述的自誘導培養基中，發酵，提取青霉素酰胺酶。
8.如權利要求
7所述的應用，其特征在于，所述原核表達菌株包含有T7/lac啟動子。
9.如權利要求
7所述的應用，其特征在于，所述原核表達菌株的接種量為0.1% 5%。
10.如權利要求
7所述的應用，其特征在于，發酵溫度為25 27°C，發酵時間為48 72小時。
專利摘要
本發明公開了一種自誘導培養基及其應用。所述自誘導培養基的配方為阿拉伯糖2～10g/L，葡萄糖0.5～2.5g/L，甘油5～25g/L，蛋白胨8～12g/L，磷酸鹽6.5～7.4g/L，硫酸鹽1.1～1.3g/L，NH4Cl2.6～2.7g/L，痕量元素溶液適量。所述應用為該自誘導培養基在生產青霉素酰胺酶中的應用。與現有技術相比，本發明的自誘導培養基利用阿拉伯糖作為底物誘導目的蛋白表達，可調控性強，蛋白表達量高；在一個具體實施方式
中，青霉素酰胺酶酶活達6U/mL，遠遠高于使用乳糖誘導的蛋白表達量，對開發生產青霉素酰胺酶的新工藝具有重要的指導意義。
文檔編號C12R1/19GKCN103146669SQ201310074573
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月8日
發明者陳振明, 周碩, 賴敦岳, 李蘭杰, 陳亮 申請人:浙江普洛得邦制藥有限公司, 杭州師范大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan