一種產耐有機溶劑脂肪酶的菌株、耐有機溶劑脂肪酶及其制備方法

專利名稱：:一種產耐有機溶劑脂肪酶的菌株、耐有機溶劑脂肪酶及其制備方法一種產耐有機溶劑脂肪酶的菌株、耐有機溶劑脂肪酶及其制備方法
技術領域：
：[0001]本發明屬于生物
技術領域：
：，具體的涉及一種能產耐有機溶劑脂肪酶的枝孢霉屬菌株(Cladosporiumsp.)WBRD3.10062425，保藏編號為:CGMCCN0.4962，以及該菌株所產的耐有機溶劑脂肪酶以及該脂肪酶的制備方法。
背景技術：
：[0002]脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一類特殊的酯鍵水解酶，廣泛存在于動物組織、植物和微生物體中。脂肪酶可以催化酯類化合物的水解、醇解、酯化、酯交換以及化合物的合成等反應，因而可應用于多種工業中，如食品工業、乳制品工業、醫藥工業、洗滌劑工業、紡織工業、生物柴油、造紙、皮革、化妝品、材料合成和環境工業等(HasanF，AliSA,HameedA.1ndustrialapplicationsofmicrobiallipases.EnzymeMicrobTechnol，2006，39:235-251.)o[0003]脂肪酶同蛋白酶等其它工業酶制劑品種一樣，在不同的應用領域內其性質要求多種多樣。如食品工業上可以用脂肪來來生產改性芝士、結構脂肪、類可可脂以及產生特殊風味等(IwasakiY.,YamaneT.Enzymaticsynthesisofstructuredlipids.J.MolecularCatalysisB:Enzymatic.2000,10:129-140.；HasanF.,ShahA.A.,HameedA.1ndustrialapplicationsofmicrobiallipases.EnzymeandMicrobialTechnology2006,39:235-251.)，這樣就對脂肪酶在脂肪酸選擇性、甘油三酯的位置選擇性、底物選擇性、熱穩定性等方面提出了不同的要求。[0004]在醫藥工業上，可以用脂肪酶來催化有機合成反應，如合成手性胺、硫氮酮等(JaegerK.E.,ReetzΜ.T.Microbiallipasesfromversatiletoolsforbiotechnology.TrendsinBiotechnology.1998,16:396-403.),如此就要求脂肪酶具有較強的有機溶劑耐受性、較強的催化活性等。[0005]在洗滌劑工業上脂肪酶是僅次于蛋白酶、淀粉酶之外的第三大酶種，洗滌劑脂肪酶主要是利用脂肪酶的水解去污特性。但是因為洗滌劑配方的復雜性以及反應條件的苛刻性，故要求脂肪酶具有較高的熱穩定性、`表面活性劑耐受性、較強的抗氧化性、低溫活性等(HasanF.,ShahA.A.,JavedS.,etal.Enzymesusedindetergents:Lipases.Afric.J.Biotechn.2010,9(31):4836-4844.;陳貴元，魏云林.低溫脂肪酶的研究現狀與應用前景.生物技術通報2006，(2):29-32.)。[0006]在生物柴油工業中，脂肪酶催化法較化學堿法而言對原料的選擇性低，可利用酸值較高的廢油及工業下腳料。另外脂肪酶酶法還具有反應條件溫和、能耗低、醇用量小、產物及副產物較易分離且無污染排放等許多優點。該方法克服了堿催化法的嚴重缺陷，是一種更理想的節能、環保型工藝。酶法加工是生物柴油今后發展的一個趨勢，但是脂肪酶的成本以及酶的穩定性主要是指脂肪酶對甲醇的耐受性是該技術的瓶頸問題(吳義真，鄒有土，林琳.脂肪酶催化合成生物柴油的瓶頸問題及其對策.中國生物工程雜志.2008，28(2):117-123.)。總之，因為各個工業環節對脂肪酶的具體性質要求多種多樣，沒有一種脂肪酶產品能夠適合所有的工業環節應用，因而尋找和開發不同性質的脂肪酶產品則成為了共識。因為微生物具有培養簡單、周期短、產量大等特點，工業用途的酶制劑基本上都來源于微生物。脂肪酶也不例外，目前已知大約有2%的微生物產脂肪酶，至少包括65個屬，其中細菌28個屬、放線菌4個屬、酵母菌10個屬、其它真菌23個屬(汪小鋒，王俊，楊江科等.微生物發酵生產脂肪酶的研究進展.生物技術通報.2008，(4):47-53.)。這些微生物中關注比較多的有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、地霉屬(Geotrichum)、假絲酵母屬(Candida)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)和毛霉屬(Mucor)等。涉及脂肪酶產生菌的專利(申請)主要有:1、中國專利ZL200610106574.2，發明名稱為“一種低溫脂肪酶菌株、低溫脂肪酶及其生產方法”，授權公告號為CN101130757B，公開了一株出芽絲孢酵母(Trichosporonpullulans),該酵母所產脂肪酶為低溫脂肪酶,最適作用溫度在25-30°C，在5-45°C范圍內均有酶活性，在30°C下保溫80min，其酶活性仍可保持80%左右，最適作用pH在6.5左右，在pH5-8范圍內可保持較高的酶活性等；2、中國專利ZL200810233626.1，發明名稱為“耶爾森氏菌屬菌株KMl和由其制備的低溫堿性脂肪酶及其純化方法”，授權公告號為CN101486979B，公開了一種來源于耶爾森氏菌屬(Yersiniasp.)菌株KMl的低溫脂肪酶及其生產菌株，該菌株所產低溫脂肪酶的分子量為34.3kDa，最適作用溫度為37°C，最適作用pH為9.0，在pH7.2-10.0內穩定，能耐受50-80%的部分有機溶劑如甲醇、乙醇和DMSO;3、中國專利ZL200410096668.7，發明名稱為“一種新型低溫堿性脂肪酶和產生該酶的適冷性海洋酵母”，授權公告號為CN1301326C，公開了一株適冷性海洋酵母菌株Bohaisea-9145，該菌株所產脂肪酶的分子量為38kDa，最適作用溫度在35°C，最適pH為8.5;4、中國專利ZLCN94193220.6，發明名稱“新穎的脂肪酶、產生該脂肪酶的微生物、該脂肪酶的制造方法及用途”，授權公告號為CN1072718C，公開了一種假單胞菌屬細菌脂肪酶及其產生菌，該脂肪酶分子量為31kDa左右，在pH3.5-12范圍內有作用，最適pH在10-12，30-80°C范圍內均有作用，最佳反應溫度為55-65°C;5、中國ZL03113274.X，發明名稱為“一種脂肪酶產生菌及其篩選方法和產業化應用”，授權公告號為CN1181187C，公開了一種華根霉(Rhizopuschinensis)及其產生的一種可用于有機相中催化芳香酯合成的脂肪酶。雖然關于脂肪酶的研究較多，但是關于耐有機溶劑的野生脂肪酶的報道卻不多。前述中國專利CN101486979B報道的耶爾森氏菌脂肪酶對甲醇、乙醇有一定耐受性；歐洲專利申請EP2360178報道的表皮葡萄球菌StaphylococcusepidermidisAT2的脂肪酶能耐受25%(v/v)的DMS0、甲苯，但是甲醇、乙醇等則是其基本全部失活；司圣乾等報道了一種含有25%(v/v)的正己烷和氯仿假單胞菌脂肪酶在4°C放置24h后活力沒有損失(司圣乾，陳彥，劉燕雅等.Pseudomonassp.RTI低溫脂肪酶的純化及酶學特性.生物加工過程.2010,8(6):52-56.);美國專利申請US20050260737報道了一種球形芽孢桿菌Bacillussphaericus205y脂肪酶，該脂肪酶在含有25%(v/v)的正己烷情況下脂肪酶活力有一定提高；中國專利申請201110126164.5，發明名稱為“一種耐有機溶劑的脂肪酶高產菌株及其應用，公開號為CN102220268A報道了一種耐有機溶劑的熒光假單胞菌PseudomonasfluorescensCl可用于制備耐有機溶劑的脂肪酶。湯彥柳等人報道了一種來自于腐生葡萄球菌StaphylococcussaprophyticusM36的脂肪酶在含有25%(v/v)的部分有機溶劑中仍能保持一定的活性(湯彥柳，盧亞萍，呂鳳霞等.腐生葡萄球菌M36耐有機溶劑脂肪酶基因的克隆與原核表達.生物工程學報.2009，25(12):1989-1995.)。袁紅玲等通過添加甲苯作為唯一碳源進行預培養，然后以透明圈平板篩選法從土壤樣品中成功地篩選到了I株耐有機溶劑的產脂肪酶的酵母菌，初步鑒定為耶羅威亞酵母(Yairowiasp.)(袁紅玲，湯魯宏，許正宏，等.產有機相催化酯合成活性的脂肪酶菌株的篩選.微生物學通報，2007,34(1):19-23.)。除此之外還有來源于皺褶假絲酵母、南極假絲酵母、地芽孢桿菌、不動桿菌等的脂肪酶具有耐有機溶劑性質的報道(彭仁，魏東芝.耐有機溶劑脂肪酶的研究進展.生物技術.2008,18(5):92-95.；EbrahimpourA,RahmanRN,BasriM,etal.Highlevelexpressionandcharacterizationofanovelthermostable,organicsolventtolerant,1,3-regioselectivelipasefromGeobacillussp.strainARM.BioresourTechnol.2011,102(13):6972-6981.；UttatreeS,WinayanuwattikunP,CharoenpanichJ.1solationandcharacterizationofanovelthermophilic-organicsolventstablelipasefromAcinetobacterbayly1.ApplBiochemBiotechnol.2010Nov；162(5):1362-76.；AhmedEH,RaghavendraT,MadamwarD.AnalkalinelipasefromorganicsolventtolerantAcinetobactersp.EH28!Applicationforethylcaprylatesynthesis.BioresourTechnol.20IOMay；101(10):3628-34.)。但以上這些專利文獻、科技文獻報道的耐有機溶劑脂肪酶的來源微生物基本上是細菌和酵母。關于枝孢霉屬(Cladosporium)產出脂肪酶的報道只有Fapohunda在2006年報道的Cladosporiumcladosporioides脂肪酶的產出條件研究(Fapohunda,S.0.ProductionoflipaseandtoxicmetabolitesbyCladosporiumcladosporioidesundervariedconditions.MycologiaBalcanica2006,3:89-93.)。目前尚無來源于枝孢霉屬(Cladosporium)產出耐有機溶劑特別是甲醇、乙醇等的脂肪酶的相關報道。
發明內容本發明目的在于提供一種能夠生產耐有機溶劑脂肪酶的枝孢霉屬的絲狀真菌，本發明的另一目的是提供該菌株生產的耐有機溶劑脂肪酶及其制備方法。本發明提供一種能產耐有機溶劑脂肪酶的絲狀真菌，該絲狀真菌分離自西藏地區傳統食品——天然藏酥油的枝孢霉屬(Cladosporiumsp.)菌株WBRD3.10062425。本發明提供了一種脂肪酶產生菌，分類命名為枝孢霉(Cladosporiumsp.),保藏編號為CGMCCN0.4962。本發明還提供了一種生產脂肪酶的方法，包括以下步驟:在適合生產的情況下，于250C_32°C培養上述的脂肪酶產生菌，從而使該菌株產生脂肪酶；從培養基中分離出脂肪酶。較佳地，28°C培養上述的脂肪酶產生菌。所述的脂肪酶，分子量為40_52kDa，為耐有機溶劑脂肪酶，對甲醇、乙醇和丙酮具有很強的耐受性。[0018]所述的脂肪酶，最適反應溫度在45°C附近，最適反應pH范圍在pH9.5-10.0;該脂肪酶具有較強的熱穩定性，TritonX-100可以大大提高該脂肪酶的活力。上述的生產脂肪酶的方法，以本發明的枝孢霉屬(Cladosporiumsp.)WBRD3.10062425菌株為原料，由以下步驟組成:(A)菌株于25-32°C，120-250rpm下于發酵培養基中培養64-72小時，發酵培養基的配方如下:蔗糖0.1-5%、蛋白胨0-10%、玉米粉0-5%、酵母浸出粉0-5%、吐溫-800-3%、滑石粉0-2%、NaNO3O-1%、KH2PO40.7%,Na2HPO4.12H200.25%,MgSO4.12H200.1CaCl20.05%,橄欖油0-5%,pH6.5；(B)發酵液過濾除去菌絲體，濾液采用5_30kDa的膜進行超濾濃縮，對濃縮液進行硫酸銨鹽析，收集30-60%飽和度的鹽析沉淀物；(C)用疏水層析柱對鹽析產物進行層析純化，先用濃度為20-100mM的，ρΗ6.0-8.5緩沖液進行洗脫，再用蒸餾水洗脫，最后用10-70%的乙醇水溶液洗脫并收集該洗脫組分；經過緩沖液置換后用離子交換層析純化，收集主要的脂肪酶活性峰經過緩沖液置換后即可。優選地，上述的生產脂肪酶的方法，以本發明的枝孢霉屬(Cladosporiumsp.)WBRD3.10062425菌株為原料，由以下步驟組成:(A)25-320C，120250rpm下于發酵培養基中培養64-72小時，發酵培養基的配方如下:蔗糖2%、蛋白胨3%、玉米粉0.5%、酵母浸出粉1%、吐溫-800.5%、滑石粉0.1%,NaNO30.3%,KH2PO40.7%,Na2HPO4.12H200.25%,MgSO4.12H200.1%、CaCl20.05%、橄欖油0.5%,pH6.5；較佳地，菌株于28°C，200rpm下于發酵培養基中培養64_72小時。(B)發酵液過濾除去菌絲體，濾液采用530kDa的膜進行超濾濃縮，對濃縮液進行硫酸銨鹽析，收集30-60%飽和度的鹽析沉淀物；較佳地，發酵液收集后用濾紙進行過濾，收集的清液經過0.22μm的微孔濾膜過濾進一步澄清后，再用IOkDa的超濾膜進行超濾以濃縮；(C)用HiTrapphenylHP的苯基疏水層析柱對鹽析產物進行層析純化，先用20mMIOOmM濃度的pH6.0-8.5的緩沖液進行洗脫，再用蒸餾水洗脫，最后用10-70%的乙醇水溶液洗脫并收集該洗脫組分；經過緩沖液置換后用MonoQ層析柱進行離子交換層析純化，收集主要的脂肪酶活性峰經過緩沖液置換后即可。本發明的具體技術方案如下:1、菌株篩選及鑒定本發明所提供的菌株Cladosporiumsp.WBRD3.10062425分離自中國西藏、甘肅等地區的藏族傳統食品——天然藏酥油。將新鮮的酥油樣品通過富集培養或稀釋涂布于羅丹明B平板上篩選得到一株可產大量胞外脂肪酶的菌株。該菌株經過形態學和18SrDNA鑒定屬于枝抱霉(Cladosporium)屬，命名為Cladosporiumsp.WBRD3.10062425。該菌株已于申請日前保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。該保藏單位的地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編是100101。該菌株的保藏日期是2011年6月17日，保藏號是CGMCCN0.4962，分類命名為:枝孢霉Cladosporiumsp.。[0033]上述的脂肪酶的篩選方法為羅丹明B平板法，將待考察菌株或菌體懸浮液點種或稀釋涂布于羅丹明B平板上，按照菌株相適應的生長條件進行培養，本發明的菌株培養溫度在25-32°C。生長3-6天時在波長為365nm的紫外燈下觀察菌落周圍是否形成橙色的熒光圈，根據熒光圈的有無、強弱來判斷該菌產生胞外脂肪酶的能力。熒光強烈或熒光圈直徑比較大可一定程度上說明胞外脂肪酶的分泌能力強。該方法的篩選平板制備方法如下:配方甲液(硫酸銨0.1%，酵母浸出汁0.5%，胰蛋白胨0.5%，K2HPO40.1%,KC10.5%,七水合硫酸鎂0.05%，七水合硫酸亞鐵0.01%，瓊脂2.0%)115°C滅菌30min后加入同樣方式滅菌的配方乙液(橄欖油與2%聚乙烯醇以1:3比例混合，IOOOOrpm攪拌乳化)，充分混合后按照I%(v/v)的量加入過濾除菌的0.1%的羅丹明B溶液。充分混勻后制備得到篩選平板。根據羅丹明B平板法篩選得到一株在365nm紫外燈下具有顯著熒光圈的菌株(如圖1所示)即WBRD3.10062425菌株。經過對絲狀真菌WBRD3.10062425在不同培養基上生長的菌落形態和顯微形態觀察參考《真菌鑒定手冊》(魏景超遺著.真菌鑒定手冊.上海科學技術出版社.1979年9月第一版)、《真菌的形態和分類》(戴芳瀾遺著.真菌的形態和分類.科學出版社.1987年3月第一版)以及《中國真菌志》(張中義主編.中國真菌志第十四卷枝孢屬黑星孢屬梨孢屬.科學出版社.2003年4月第一版)等判斷其與枝孢霉(Cladosporium)屬菌最相似。對該菌的18SrDNA測序，其DNA序列如SEQIDNO:1所示，進行比對后發現該菌與Cladosporiumcladosporioides,Cladosporiumbruhnei,Cladosporiumuredinicola以及Cladosporiumcellare具最高同源性超過99%。2、耐有機溶劑脂肪酶的制備取一支新鮮培養的枝孢霉Cladosporiumsp.WBRD3.10062425斜面(PDA培養基25-32°C培養120h)，用無菌水洗滌制成孢子懸浮液，按照0.l-lXlOW1的量接種至種子搖瓶中，25-320C、120-250rpm培養24h左右。而后以5_10%的接種量接種至發酵培養基中，25-32°C、120-250rpm搖床培養64-72h。培養液過濾除去菌絲體，濾液采用5_30kDa的膜進行超濾濃縮。而后對濃縮液進行硫酸銨鹽析，收集30-60%飽和度的鹽析沉淀物。再用HitrapphenylHP色譜柱對該鹽析蛋白樣品進行疏水層析純化，先用無鹽緩沖液洗脫，再用蒸餾水洗脫，最后用10-70%的乙醇水溶液進行洗脫。收集乙醇溶液洗脫組份，超濾置換緩沖液后再經過MonoQ(GEHealthcare)色譜柱純化后收集活性組分即制備得到本發明所述的脂肪酶。上述枝孢霉培養的種子培養基組成為(單位g.!/1):葡萄糖30，蛋白胨3，玉米粉5，NaH2PO4.12H202，MgSO4.Iffi2O1，CaCl20.5，pH6.5。上述的枝孢霉產脂肪酶的發酵培養基組成(單位g.!/1):蔗糖20，蛋白胨30，玉米粉5，酵母浸出粉10，吐溫-805，滑石粉l，NaN033，KH2P047，Na2HP04.12Η202.5，MgS04.12Η201，CaCl20.5，橄欖油5,pH6.5；上述的脂肪酶的疏水層析純化過程所采用的起始緩沖液為20_100mM濃度，PH6.0-8.5的含有0.1-0.8M(NH4)2SO4的緩沖液；洗脫緩沖液與起始緩沖液不同的是其中不含有硫酸銨。[0044]上述的離子交換層析過程所采用的起始緩沖液為20_50mM濃度pH7.0-8.5的Tris.HCl緩沖液，洗脫緩沖液為含2MNaCl的20_50mM濃度ρΗ7.0-8.5的Tris.HCl緩沖液，洗脫過程采用線性梯度洗脫法。以上所有層析過程均在室溫下進行，上述最終制備所得的枝孢霉脂肪酶的溶液體系為20-50mM濃度ρΗ7.0-8.5的Tris.HCl緩沖液。本發明采用對硝基苯棕櫚酸酯(ρ-ΝΡΡ)法來測定脂肪酶的活力大小，該方法以對硝基苯棕櫚酸酯為反應底物，通過脂肪酶的催化產生有色產物對硝基苯酚(P-NP)，該產物在405-410nm波長下具有強烈吸收。酶活力單位定義為:I個單位即指在標準實驗條件下每分鐘催化釋放Ιμπιο的P-NP所需的酶量。該方法是國內外測定脂肪酶活力的常用方法，操作簡便，反應快且靈敏度高，是一種精確而高效的活力測定方法。3、Cladosporiumsp.WBRD3.10062425所產肪酶的部分酶學性質本發明所制備而得的脂肪酶具有如下性質，除特別說明外脂肪酶活力的檢測均采用pNPP法。部分有機溶劑耐受性，見圖2。該酶對甲醇、乙醇以及丙酮的耐受性很高，在50%以上的有機溶劑中4°C放置24h后仍有較強的活力。枝孢霉脂肪酶對甲醇的耐受性尤為突出，在4°C溫度下50%的甲醇中放置24h后活性幾乎沒有損失，這一性質大大拓寬了該酶的應用領域特別是諸如酶法生物柴油或有機合成等領域。該酶的有機溶劑耐受性能檢測的方法是取一定體積的待測酶液加入相應比例的待檢測有機溶劑，4°C下放置24h后取出樣品進行脂肪酶活力檢測。該酶最適反應溫度為45°C，見圖3。該酶的最適反應pH在ρΗ9.5-10.0，該酶的pH穩定范圍在ρΗ5.5-9.5，見圖4。最適反應PH的酶活力測定方法采用中華人民共和國國家標準GB/T23535-2009的方法進行檢測，酶活力單位定義為每分鐘催化產生Iymol的脂肪酸所需的酶量定義為I個單位。該酶具有很高的熱穩定性，60V保溫90min后仍有75%以上的活力，75°C保溫90min后仍有近50%的活力，見圖5。EDTA對該酶的活力影響很小，TritonX-1OO可以大大提高該酶的活力，0.5_1%的TritonX-1OO可以使得酶活力單位提高I倍以上，見圖6。本發明提供了一種產耐有機溶劑脂肪酶的絲狀真菌-枝孢霉Cladosporiumsp.WBRD3.10062425，填補了現有技術中尚無枝孢霉屬生產耐有機溶劑脂肪酶的空缺；本發明所制備的來源于枝孢霉屬菌株Cladosporiumsp.WBRD3.10062425的脂肪酶具有較強的甲醇、乙醇和丙酮耐受性，這種特性在現有技術報道的野生的耐有機溶劑脂肪酶中也是非常突出的。本發明制備得到的脂肪酶將具有生物柴油、醫藥工業、食品、油脂化工、環境保護、洗滌劑、紡織、造紙等多個工業領域的應用價值。(應用方面的具體實驗目前沒有開展，可以后續單獨保護)圖1:Cladosporiumsp.WBRD3.10062425在羅丹明B平板上生長的圖片，其中A為可見光下菌落圖片，B為365nm紫外燈下菌落圖片；[0057]圖2=Cladosporiumsp.肪酶對部分有機溶劑的耐受性；圖3:Cladosporiumsp.肪酶反應溫度和相對酶活關系曲線；圖4:Cladosporiumsp.脂肪酶反應pH和酶活關系曲線及pH穩定曲線；圖5:Cladosporiumsp.脂肪酶的熱穩定性曲線；圖6:EDTA和TritonX-100對Cladosporiumsp.月旨肪酶活性的影響;圖7=Cladosporiumsp.脂肪酶SDS-PAGE及酶譜圖，其中I為SDS-PAGE圖，2為365nm下觀察到活性酶譜圖，箭頭處為橙色熒光條帶。微生物保藏信息:保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101保藏日期:2011年6月17日保藏編號:CGMCCN0.4962分類命名:枝孢霉Cladosporiumsp.。具體實施方式現結合附圖與實施例對本發明作詳細描述，但本發明的實施不僅限于此。實施例1:產脂肪酶絲狀真菌Cladosporiumsp.WBRD3.10062425的分離篩選及鑒定取一塊盡可能新鮮的藏酥油樣品，去除約Icm厚度表層后，切取約IOg左右的藏酥油樣品直于IOOmL含1.0%Tween80的無囷水中。振湯30min后按照傳統的稀釋涂布的方法稀釋成不同的稀釋度，并將各個稀釋度的樣品涂布于羅丹明B平板上置于28°C生化培養箱中培養。羅丹明B的平板的制作方法是:配方甲液(硫酸銨0.1%，酵母浸出汁0.5%，胰蛋白胨0.5%，K2HPO40.1%,KCl0.5%,七水合硫酸鎂0.05%,七水合硫酸亞鐵0.01%,瓊脂2.0%)115°C滅菌30min后加入同樣方式滅菌的配方乙液(橄欖油與2%聚乙烯醇以1:3比例混合，IOOOOrpm攪拌乳化)，充分混合后按照I%(v/v)的量加入過濾除菌的0.1%的羅丹明B溶液。充分混勻后制備得到篩選平板。每24h在紫外燈下觀察羅丹明B平板上是否有熒光圈出現，產脂肪酶的絲狀真菌的生長速度較慢往往需要96h后才能觀察到。挑取熒光圈較大的微生物進行進一步的稀釋涂布分離以獲得純種菌株，而后再次用羅丹明B平板對這些純種菌株進行脂肪酶檢測，結果發現有一株熒光圈十分顯著的菌株標記為WBRD3.10062425，其脂肪酶平板檢測結果如圖1所示。該菌的生長狀態和形態學特征如下:該菌在察氏培養基上25°C溫度下生長速度極慢，培養7天時菌落直徑為10mm，菌絲呈絨狀、暗黃綠色、質地致密、背面呈黑綠色；該菌在麥芽汁培養基上25°C溫度下生長7天時達菌落直徑可達30mm，菌絲厚絨狀，灰色、質地致密、背面墨黑色；在查氏酵母膏瓊脂培養基上25°C溫度下生長7天時的菌落直徑約20mm，菌絲絨狀，形成同心環紋，中間橄欖色，外圍暗黃綠色，質地致密，背面黃綠至褐色；該菌在PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養基上25°C溫度下培養7天時的菌落直徑約15mm，菌絲絨狀或絮狀，黃綠色，質地致密，背面綠黑色邊緣白色。在顯微鏡下觀察，分生孢子梗單生、叢生、直立或曲屈狀，偶有分枝，具隔膜；枝孢0-3個，隔膜，平；分生孢子橢圓形近球形，孢臍明顯，褐色，頂生。根據以上形態特征以及顯微形態特征觀察結果，參考《真菌鑒定手冊》(魏景超遺著.真菌鑒定手冊.上海科學技術出版社.1979年9月第一版)、《真菌的形態和分類》(戴芳瀾遺著.真菌的形態和分類.科學出版社.1987年3月第一版)以及《中國真菌志》(張中義主編.中國真菌志第十四卷枝孢屬黑星孢屬梨孢屬.科學出版社.2003年4月第一版)等判斷其與枝孢霉(Cladosporium)屬菌最相似。根據有關微生物鑒定方法，對該菌的18SrDNA測序結果(如SEQIDNO:1)進行比對后發現該菌與Cladosporiumcladosporioides(GENBANK號AY251093.2),Cladosporiumbruhnei(GENBANK號AY251096.2),Cladosporiumuredinicola(GENBANK號AY251097.2)以及Cladosporiumcellare(GENBANK號NG016540.1)具最高同源性超過99%。該菌株已于2011年6月17日在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”(CGMCC)保藏，保藏號是CGMCCN0.4962。實施例2:來源于枝孢霉的耐有機溶劑脂肪酶的制備(I)枝孢霉脂肪酶的發酵加入IOmL左右的無菌生理鹽水至一支新鮮培養好的枝孢霉WBRD3.10062425斜面以制備孢子懸浮液，而后取ImL的懸浮液接種至裝液量為30mL的250mL容積的種子培養基中于28°C、200rpm培養24h(培養基組成為:葡萄糖3%、蛋白胨0.3%、玉米粉0.5%、NaH2PO4.12H200.2%,MgSO4.12H200.1CaCl20.05%,pH6.5)。種子培養好后，取3mL的種子培養液接種至多個250mL容積的發酵搖瓶中，搖瓶裝液量為30mL。發酵培養基組成是:蔗糖2%、蛋白胨3%、玉米粉0.5%、酵母浸出粉1%、吐溫-800.5%、滑石粉0.1NaNO30.3%,KH2PO40.7%,Na2HPO4.12H200.25%,MgSO4.12H200.1%、CaCl20.05%、橄欖油0.5%，pH6.5。發酵條件為:培養溫度28°C，搖床轉速為200rpmo搖瓶發酵67h左右，取出發酵搖瓶進行胞外脂肪酶活力的檢測(pNPP法)，經檢測此時的發酵清液中的脂肪酶活力達到13.63units/mL。(2)枝孢霉脂肪酶粗酶液的濃縮和鹽析收集所有發酵搖瓶的發酵液，用雙層濾紙進行過濾以除去菌絲體，此時可以獲得約410mL的清液。將此清液用0.22μm的微孔濾膜過濾進一步澄清后，用IOkDa的超濾膜(Omega10K,美國PALL公司)進行超濾,最后得到約40mL的濃縮液。在冰浴狀態下緩慢加入硫酸銨粉末至枝孢霉超濾濃縮液中直至飽和度達到30%，冰浴靜置2h后，15000rpm離心25min(高速冷凍離心機CR22GIII，日本日立公司)收集離心上清液。再次緩慢加入硫酸銨粉末直至飽和度達到60%，此鹽析步驟一直在冰浴下完成。鹽析樣品4°C靜置過夜后，離心收集鹽析沉淀。(3)層析法純化和制備枝孢霉脂肪酶室溫下用約20mL的起始緩沖液(50mM濃度含(λ4M(NH4)2SO4的ρΗ7.5的Tris.HCl緩沖液)溶解60%飽和度的鹽析沉淀樣品，經過0.22μm的微孔濾膜過濾后粗酶液用HiTrapphenylHP5mL(GEHealthcare)苯基疏水層析柱進行純化,收集活性組分。疏水層析過程的洗脫液有:洗脫緩沖液(不含硫酸銨的起始緩沖液)、蒸餾水和70%的乙醇水溶液。層析過程流速為3mL/min。洗脫過程是先用100%的洗脫緩沖液進行洗脫至基線穩定，而后再用蒸餾水洗脫至基線穩定，最后用70%的乙醇溶液進行洗脫。經過疏水層析純化的脂肪酶樣品再經緩沖液置換后，用MonoQ4.6/100PE(GEHealthcare)強陰離子層析柱進行純化并收集活性組分。離子交換層析過程所使用的緩沖液有兩種，一種是濃度為20mM，pH值為7.5的Tris.HCl起始緩沖液，另一種為含有2MNaCl的濃度20mM，pH值為7.5的Tris.HCl洗脫緩沖液。洗脫過程的流速為lmL/min，采用線性梯度洗脫的方式進行洗脫。以上過程均在室溫下完成，層析過程使用的設備為GE公司的kTAExplorer100。層析純化后的樣品經過緩沖液置換后保存于濃度為20mM，pH值為7.5的Tris.HCl緩沖液中，4°C儲存。實施例3:枝孢霉屬脂肪酶的酶學性質(I)脂肪酶對甲醇等有機溶劑的耐受性考察將實施例2純化得到的枝孢霉屬脂肪酶與甲醇、乙醇等有機溶劑按照一定的比例(0-90%,v/v)進行配比，于4°C放置24h后用pNPP法檢測脂肪酶的活性大小，以不加有機溶劑的樣品為對照，結果見圖2。枝孢霉脂肪酶對甲醇、乙醇和丙酮等均有較強的耐受性，特別是對甲醇的耐受性更好，50%的甲醇24h處理后幾乎沒有活性損失。(2)脂肪酶的溫度與酶活力關系曲線以及熱穩定性曲線測定:在一系列的不同溫度的水浴中，采用pNPP法進行枝孢霉脂肪酶的活力進行檢測，酶作用溫度曲線結果見圖3。熱穩定性檢測時是將樣品放置于不同溫度的水浴中進行保溫，每隔15min取樣品進采用pNPP法進行活力檢`測，檢測至保溫90min為止，熱穩定性結果見圖5。該酶的最適反應溫度為45°C，該酶具有`較強的熱穩定性，60°C保溫90min后仍有超過75%的殘余活力，75°C保溫90min后仍有超過45%的殘余脂肪酶活力。(3)枝孢霉脂肪酶的最適反應pH和pH穩定性的檢測配制一系列濃度為0.1M的不同pH值的緩沖液，其中pH3.0采用甘氨酸-鹽酸緩沖系統，PH4.0采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖系統，pH5.0采用醋酸-醋酸鈉緩沖系統，ρΗ5.5-6.5采用MES-NaOH緩沖系統，ρΗ7.0采用MOPS-NaOH緩沖系統，ρΗ7.5-8.5采用Tris-HCl緩沖系統，ρΗ9.0-9.5采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖系統，ρΗΙΟ.0采用碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖系統，pHl1.0采用磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖系統。最適反應pH測定中的酶活力檢測方法采用中華人民共和國國家標準GB/T23535-2009的方法進行活力檢測，酶活力單位定義為每分鐘催化產生Iμmol的脂肪酸所需的酶量定義為I個單位，結果見圖4。酶反應的最適pH范圍在pH9.5-10.0,該酶的pH穩定范圍在pH5.5-9.5。(4)EDTA和表面活性劑TritonX-1OO的影響在酶液中加入不同量的EDTA，結果發現含有IOmM的EDTA仍能有超過80%的脂肪酶活力，見圖6。在研究不同濃度的TritonX-1OO的影響時發現，添加0.5_1%的TritonX-100可以使得酶活力單位提高I倍以上，見圖6。(5)枝孢霉脂肪酶的SDS-PAGE及活性酶譜檢測通過酶譜法和SDS-PAGE相結合確定該酶的表觀分子量在40_52kDa，見圖7。本發明所采用的脂肪酶活性酶譜檢測方法是在參考Cadirci(CadirciB.H.,Yasa1.AnorganicsolventstolerantandthermotolerantlipasefromPseudomonasfluorescensP21.J.Mol.Catal.B:Enzym.2010,64:155-161),Yadav(YadavR.P.,SaxenaR.K.,GuptaR.,etal.Rapidzymogramforlipase.BioTechniquesl998,24(5):754-756),Masayama(MasayamaA.,KuwanaR.,TakamatsuH.,etal.ANovelLipolyticEnzyme,YcsK(LipC),LocatedintheSporeCoatofBacillussubtilis,IsInvolvedinSporeGermination.J.Bacteriol.2007，189(6):2369-2375)等人脂肪酶酶譜檢測方法基礎上建立的。該檢測方法與普通SDS-PAGE在凝膠準備、上樣和電泳過程等都基本相同。不同的是該方法在電泳樣品準備階段使用的上樣緩沖液中不含有DTT或2-巰基乙醇等還原劑，另外電泳樣品只是室溫放置不能加熱或煮沸變性；酶譜檢測方法在電泳時與普通SDS-PAGE不同的是要使得電泳過程盡可能產熱少，因此可以在90V或更低的電壓下電泳。在電泳結束后將含有待檢測樣品的凝膠放置于0.5-2.5%的TritonX-100緩沖液中進行兩次室溫振蕩，每次30min。而后取出凝膠用20mMpH7.5的Tris-HCl緩沖液洗滌3次每次IOmin以除去殘余的TritonX-100并實現脂肪酶的復性。而后將該凝膠置于含0.02%的羅丹明B的瓊脂平板上，37°C放置過夜后即可于365nm紫外燈下觀察到脂肪酶的熒光條帶。權利要求1.一種脂肪酶產生菌，分類命名為枝孢霉(Cladosporiumsp.)，保藏編號為CGMCCN0.4962。2.—種生產脂肪酶的方法，其特征在于該方法包括以下步驟:在適合生產的情況下，于25-32°C培養如權利要求1所述的脂肪酶產生菌，從而使該菌株產生脂肪酶；從培養基中分離出脂肪酶。3.根據權利要求2所述的一種生產脂肪酶的方法，其特征在于28°C培養如權利要求1所述的脂肪酶產生菌。4.根據權利要求2所述的一種生產脂肪酶的方法，其特征在于該方法以如權利要求1所述的脂肪酶產生菌為原料，由以下步驟組成:(A)菌株于25-32°C，120-250rpm下于發酵培養基中培養64-72小時，發酵培養基的配方如下:蔗糖0.1-5%、蛋白胨0-10%、玉米粉0-5%、酵母浸出粉0-5%、吐溫-800-3%、滑石粉0-2%、NaNO3O-1%、KH2PO40.7%、Na2HPO4.12H200.25%,MgSO4.12H200.1CaCl20.05%、橄欖油0-5%,pH6.5；(B)發酵液過濾除去菌絲體，濾液采用5-30kDa的膜進行超濾濃縮，對濃縮液進行硫酸銨鹽析，收集30-60%飽和度的鹽析沉淀物；(C)用疏水層析柱對鹽析產物進行層析純化，先用濃度為20-100mM的，pH6.0-8.5緩沖液進行洗脫，再用蒸餾水洗脫，最后用10-70%的乙醇水溶液洗脫并收集該洗脫組分；經過緩沖液置換后用離子交換層析純化，收集主要的脂肪酶活性峰經過緩沖液置換后即可。5.根據權利要求4所述的一種生產脂肪酶的方法，其特征在于，步驟(A)為25-32°C，120250rpm下于發酵培養基中培養64-72小時，發酵培養基的配方如下:蔗糖2%、蛋白胨3%、玉米粉0.5%、酵母浸出粉1%、吐溫-800.5%、滑石粉0.1%,NaNO30.3%,KH2PO40.7%,Na2HPO4.12H200.25%,MgSO4.12H200.1%、CaCl20.05%、橄欖油0.5%,pH6.5o6.根據權利要求4或5所述的一種生產脂肪酶的方法，其特征在于，步驟(A)中菌株于280C，200rpm下于發酵培養基中培養64-72小時。7.根據權利要求4或5所述的一種生產脂肪酶的方法，其特征在于，步驟(B)中發酵液收集后用濾紙進行過濾，收集的清液經過0.22μm的微孔濾膜過濾進一步澄清后，再用IOkDa的超濾膜進行超濾以濃縮。8.—種如權利要求2-7任一方法制備得到的脂肪酶，其特征在于該脂肪酶分子量為40-60kDa，對甲醇、乙醇或丙酮具有耐受性。專利摘要本發明屬于生物
技術領域：
：。脂肪酶廣泛存在于動物組織、植物和微生物體中，可以催化酯類化合物的水解、醇解、酯化、酯交換以及化合物的合成等。本發明目的在于提供一種能夠生產耐有機溶劑脂肪酶的枝孢霉屬，該菌株為枝孢霉屬菌株(Cladosporiumsp.)WBRD3.10062425，保藏編號為CGMCCNo.4962。本發明的另一目的是提供該菌株生產的耐有機溶劑脂肪酶及其制備方法，本發明菌株生產的脂肪酶為耐有機溶劑脂肪酶，對甲醇、乙醇和丙酮具有很強的耐受性，在生物柴油、醫藥工業、食品、油脂化工、環境保護、洗滌劑、紡織、造紙等多個工業領域中有廣泛的應用價值。文檔編號C12R1/645GKCN103184160SQ201110458959公開日2013年7月3日申請日期2011年12月30日發明者徐正軍,顧思天,周美鳳,陳苗苗,戴小軍,常桂芳申請人:豐益(上海)生物技術研發中心有限公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan