專利名稱:一種多重pcr擴增方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因檢測領域，具體涉及一種多重PCR擴增方法以及用于多重PCR擴增的試劑盒。
背景技術：
多重PCR (multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一 PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同。
多重PCR反應中，一般包括以下試劑:兩對以上引物對、dNTP、MgCl2、PCR緩沖液、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及其他佐劑(DMS0、甘油、BSA)，通常為了獲得比較好的擴增結果，會對試劑的使用量、PCR擴增的反應條件，例如延伸溫度、延伸時間、退火時間、退火溫度、PCR循環數等，進行優化。
現有技術中，通常引物的選擇遵從簡單的規則:引物長度為18_24bp或更長，GC含量為35%-60%，退火溫度55°C-58°C或更高。長些的引物(如DMD基因的引物，28_30bp)使反應在更高的退火溫度下進行并產生較少的非特異性產物。使用軟件Primers來計算熔點并檢測可能的引物間的相互作用。使用BLAST工具在NCBI序列數據庫中對多對引物進行比對，以檢測可能的重復序列。
作為PCR重要衍生技術之一，多重PCR有著諸多優勢:(I)高效性，減少操作流程，可同時檢測多個基因或片段；(2)經濟簡便性，可大大節約時間和試劑成本。目前該技術已廣泛應用于生物技術、檢疫和醫學檢測等領域。然而，由于多重PCR工作原理是在同一 PCR反應體系里加入多對引物同時擴增多個DNA片段的PCR反應，因此同一反應體系中的多對引物易發生相互作用，如 形成發卡結構，二聚體結構等。通常，多重PCR反應體系中多重引物濃度為5-12pmol，引物對和引物量越多，引物之間的相互作用越明顯，從而影響PCR擴增效率。
例如，申請號為201010153921.3，公開號為101824489A的中國發明專利申請公布說明書公開了一種能同時鑒別內源性和外源性禽白血病病毒的三重PCR試劑盒，其組成包括:DNA聚合酶、dNTP、引物、PCR緩沖液、雙蒸水，所述的引物由3對引物組成；具體地，所述三重PCR反應體系，在25 ii L的PCR反應體系中，含有rTaq DNA聚合酶2.0u ； dNTP (2.5mmol/L)2u L ；PCR緩沖液2.5 ii L ;引物P-F和P-R各12pmol、弓丨物A-R和A-F各5pmol、弓丨物E-R和 E-F 各 2.5pmol ;模板 IOOngo 反應程序為:95°C IOmin ；94°C lmin，50°C lmin，72°C 40s,30個循環；72°C IOmin0 (lmol大概為6.02 X IO23個拷貝，lpmol大約為6.02 X IO11個拷貝)
另外，白血病患者的遺傳學特征異常復雜多變，包括染色體的易位、缺失、突變、倒位和擴增等。多重RT-PCR技術可在一次實驗中同時檢測多種常見白血病融合基因，有力地彌補了染色體核型分析的不足，提高了隱匿性易位染色體的檢出率。目前，臨床常用白血病分子診斷方法主要以Poul Jorgensen為代表的逆轉錄多重PCR檢測方法，此類方法可對臨床常見29種融合基因進行檢測，一般將反應體系分成八管，每管檢測不同類型的融合基因且產物片段大小存在明顯差異，依據擴增產物所在反應管位置及片段大小判斷融合基因類型。由于在同一反應體系中多對引物易發生相互作用，如形成發卡結構、二聚體結構等，從而影響擴增效率，這是分為八管進行檢測的主要原因，但這亦同時導致了該類檢測方法復雜、繁瑣，對操作人員相關專業要求較高，難以推廣。
發明內容
本發明的發明目的是提供一種多重PCR擴增方法以及用于多重PCR擴增的試劑盒，降低多重PCR反應體系中多重引物的濃度，使引物間的相互作用降低，同時為更多引物對在同一反應體系內工作而不影響擴增效率創造條件。
為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是:一種多重PCR擴增方法，包括以下步驟:
(A)、以目的基因或目的基因的cDNA為模板，設計公共引物對；以目的基因或目的基因的cDNA為模板，根據所需擴增的片段設計多重引物，所述多重引物包括兩對以上特異性引物對；在每一對特異性引物對中的正義引物的5'端連接公共引物對中的正義引物的
端，在每一對特異性引物對中的反義引物的Y端連接公共引物對中的反義引物的Y端，得到帶有公共引物的特異性引物對，所有帶有公共引物對的特異性引物對構成帶有公共引物的多重引物；
所述公共引物設計應遵循兩條原則:(I)任何優化的擴增條件下，公共引物與待測模板進行擴增時無特異性產物；(2)當帶有公共引物的多重引物擴增得到特異性產物時，公共引物對具有擴增所述特異性產物的能力；
(B)、配置多重PCR反應體系，所述多重PCR反應體系包括:dNTP、MgCl2, PCR緩沖液、模板DNA、Taq DNA聚合酶，所述多重PCR反應體系還包括:公共引物對、帶有公共引物的多重引物，其中，公共引物對的濃度為0.25 0.6 μ mol/L，每一條帶有公共引物的特異性引物的濃度 5Χ1(Γ8 5Xl(T1Qy mol/L ；
(C)、按照現有技術，對多重PCR反應進行優化，按照優化后的條件進行PCR擴增。
進一步的技術方案中，對上述擴增產物進行鑒定。
本發明同時要求保護一種檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒，所述多重PCR試劑盒包括:常規多重PCR組件，針對常見白血病融合基因的多重引物；還包括公共引物對，所述公共引物對包括以下核苷酸序列:SEQ ID N0.1:公共引物對中的正義引物5’ -GCATGTATAGAACATAAGGTGTCTC-3’；SEQ ID N0.2:公共引物對中的反義引物 5’ -GAGACACCTTATGTTCTATACATGC-3’。
上述技術方案中，所述常規多重PCR組件包括:cDNA模板、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR緩沖液、雙蒸水。
上述技術方案中，所述針對常見白血病融合基因的多重引物為分別針對E2A/PBX1、TEL/AML1、SIL/TAL1、TLS/ERG、HOXll常規白血病融合基因的特異性引物對。優選的
技術方案中，所述針對常見白血病融合基因的多重引物具體如以下核苷酸序列所示:
權利要求
1.一種檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒，所述多重PCR試劑盒包括:常規多重PCR組件，針對常見白血病融合基因的多重引物；其特征在于，還包括公共引物對，所述公共引物對包括以下核苷酸序列: SEQ ID N0.1:公共引物對中的正義引物 5’-GCATGTATAGAACATAAGG TGTCTC-3’；SEQ IDN0.2:公共引物對中的反義引物 5’ -GAGACACCTTA TGTTCTATACATGC-3’ ； 所述常規多重PCR組件包括:cDNA模板、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR緩沖液、雙蒸水；所述針對常見白血病融合基因的多重引物為分別針對E2A/PBX1、TEL/AML1、SIL/TAL1、TLS/ERG、HOXll常規白血病融合基因的特異性引物對，所述針對常見白血病融合基因的多重引物具體如以下核苷酸序列所示:
2.根據權利要求
1所述一種檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒，其特征在于，每20yL的PCR反應體系中公共引物的量為5 12pmol。
3.根據權利要求
2所述一種檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒，其特征在于，每20μ L的PCR反應體系中每一條帶有公共引物的特異性引物的量為1Χ10_6 1Χ10_8pmol ο
專利摘要
本發明公開了一種多重PCR擴增方法以及用于多重PCR擴增的試劑盒；所述多重PCR擴增方法包括了設計公共引物以及帶有公共引物的多重引物的步驟，所述公共引物設計應遵循兩條原則(1)任何優化的擴增條件下，公共引物與待測模板進行擴增時無特異性產物；(2)當帶有公共引物的多重引物擴增得到特異性產物時，公共引物對具有擴增所述特異性產物的能力；然后配置多重PCR體系進行擴增。本發明由于公共引物的引入，使反應體系內的序列特異性引物對濃度下降4個以上對數級別，如此低濃度的多重引物在同一個反應體系中出現相互作用的幾率將大大降低，不僅可解決不同引物對相互干擾這一多重PCR中的技術瓶頸，亦為加入新的引物對、增加檢測基因數量創造前提條件。
文檔編號C12Q1/68GKCN102352411 B發布類型授權 專利申請號CN 201110298119
公開日2013年6月12日 申請日期2011年9月29日
發明者孫萬平, 王偉大, 姚利, 陳燕, 李凱, 陳子興 申請人:蘇州大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (2),