專利名稱:一種利用尿素作為氮源提高發酵法生產丙酮酸產量的方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用尿素作為氮源提高發酵法生產丙酮酸產量的方法，屬于發酵工程技術領域：
。本發明還涉及上述方法在發酵法生產丙酮酸的應用，屬于發酵工程領域。
背景技術：
丙酮酸又稱2-氧代丙酸O-Oxopropanic acid)、α -酮基丙酸 (a -Ketopropionic acid)或乙酰基甲酸(Acetylformic acid)，為無色至淡黃色液體，呈醋酸香氣和愉快的酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不僅在生物能量代謝中具有十分重要的作用，而且是合成多巴胺、L-酪氨酸等多種有用化合物的前體。因此，它在制藥、日用化工、農用化學品等工業及科學研究中有著廣泛的用途。
自從20世紀50年代開始發酵法生產丙酮酸以來，國內外研究人員對丙酮酸生物合成的研究越來越深入，涉及菌種選育、營養條件、維生素、溶氧水平、溫度控制、耐高滲和耐酸性等各個方面。為了達到丙酮酸高產量、高產率和高生產強度的相對統一，研究者又通過分子手段引入外源代謝途徑，從輔因子工程方面入手研究了丙酮酸生物合成中的能量代謝，并對糖酵解作用作了一些有益的研究，研究者還在菌株耐高滲和耐酸方面也作了一些探索。但是在不同氮源的利用水平尤其是尿素對丙酮酸生產的影響方面鮮有報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用尿素作為氮源提高發酵法生產丙酮酸產量的方法和本方法在工業生產中的應用。利用本發明能夠提高丙酮酸發酵的產量和發酵生產強度。
本發明的技術方案一種利用尿素作為氮源提高發酵法生產丙酮酸產量的方法和應用，以多重維生素營養缺陷型的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019為生產菌株，利用尿素代替氯化銨作為唯一氮源，初始添加量為7g/L，在實驗室規模7L發酵罐分批發酵培養，且在30L發酵罐上進行了中試。
菌種光滑球擬酵母(T. glabrata)CCTCC M202019，硫胺素、煙酸、生物素和吡哆醇四重維生素營養缺陷型，且丙酮酸脫羧酶活性組成型降低，為本研究室選育，主要用來發酵生產丙酮酸，該菌種已申請中國專利，申請號為02113142. 2，公開號為CN1392M6A。
本發明的有益效果利用本發明能夠有效提高丙酮酸的產量及生產強度，大幅縮短發酵周期丙酮酸產量由79. 7g/L提高至88. 7g/L，提高幅度為11.3%，發酵周期由8 縮短至72h，幅度為15. 3%，從而發酵生產強度由0. 94g/(L-h)提高至1. 23g/(L *h)，幅度為30.9%。優化后的結果在30L規模發酵罐得到驗證。
本發明通過提供一種利用尿素作為氮源的策略，提高發酵法生產丙酮酸產量和生產強度。這對發酵法生產其他產品具有一定的指導意義。
具體實施方式
[0009]對照實施例本發明所用菌種為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019。
先轉接斜面在培養箱中30°C培養Mh，每只搖瓶(50/500mL)接一環斜面菌種，在溫度30°C，轉速200rpm條件下培養Mh ；最后在7L發酵罐中發酵，發酵條件為pH 5. 5，攪拌轉速400rpm，通氣2. Ovvm。
斜面種子固體培養基(g/L)
葡萄糖30，大豆蛋白胨 10，KH2PO4 1，MgSO4 · 7H20 0. 5，瓊脂粉 20g，用 6mol/L HCl 調節培養基初始PH為5. 5。自來水定容。于121°C滅菌15min。
種子培養基(g/L)
葡萄糖30，大豆蛋白胨 10，KH2PO4 1，MgSO4 · 7H20 0. 5，用 6mol/L HCl 調節培養基初始PH為5. 5。自來水定容。
發酵培養基(g/L)
葡萄糖120，尿素 7，CH3COONa 3，KH2PO4 3，MgSO4 · 7H20 0. 8，L-谷氨酸 0. 8，微量元素液10mL，維生素液10mL，pH5. 5。自來水定容。
微量元素液MnCl2· 4H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 2g, CaCl2 · 2H20 2g, CuSO4 · 5H20 0. 05g，ZnCl2 0. 5g，溶解后定容至 IL0
維生素液鹽酸硫胺素1. 5mg, D-生物素0. 004g，鹽酸吡哆醇0. 04g，煙酸0. 8g， 6mol/LHCl溶解后定容至1L。
實施例1 發酵條件同對照例，將發酵培養基中氮源改為氯化銨和尿素兩種復合氮源，氯化銨尿素(1 1)為6.2 3.5g/L，復合氮源中含氮量與7g/L尿素含氮量相當。
發現①菌體生長加快，發酵7 時菌體干重為16. 5g/L ；提高了(15. 9g/L) 2. 5%； ②發酵進行到72h時，菌體耗糖速度提高了 13. 1 % ；③發酵周期從8 縮短至79h，幅度為 7. 1%;④發酵結束時，最高丙酮酸濃度為82. lg/L，提高3. 0%;⑤丙酮酸發酵生產強度提高 10. 6%。
實施例2 發酵條件同對照例，將發酵培養基中氮源改為尿素，尿素添加量為7g/ L0
發現①菌體生長加快，發酵72h時菌體干重為17.8g/L;提高了(15. 9g/ L)11.9% ；②發酵進行到72h時，菌體耗糖速度提高了 20.2% ；③發酵周期從8 縮短至 72h，幅度為15. 3% ；④發酵結束時，最高丙酮酸濃度為88. 7g/L，提高11. 3% ；⑤發酵結束時丙酮酸生產強度提高30. 9 %。
權利要求
1.一種利用尿素作為氮源提高發酵法生產丙酮酸產量的方法，其特征是以多重維生素營養缺陷型的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019為生產菌株，利用尿素代替氯化銨作為唯一氮源，在實驗室規模7L發酵罐進行分批發酵培養60h，并在30L發酵罐中進行中試；發酵培養基(g/L)葡萄糖 120，尿素 7，CH3COONa 3，KH2PO4 3，MgSO4 · 7H20 0. 8，L-谷氨酸 0. 8，微量元素液10mL，維生素液IOmL, pH 5. 5，自來水定容；微量元素液=MnCl2 · 4H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 2g, CaCl2 · 2H20 2g, CuSO4 · 5H20 0. 05g, ZnCl2O. 5g，溶解后定容至IL ；維生素液鹽酸硫胺素1. 5mg, D-生物素0. 004g，鹽酸吡哆醇0. 04g，煙酸0. 8g，6mol/ LHCl溶解后定容至1L。
2.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于控制尿素初始添加量為7g/L，通氣量為 2vvm，硫胺素添加量為15 μ g/L，最大菌體濃度OD66tl達到61。
專利摘要
本發明公布了一種利用尿素作為氮源提高發酵法生產丙酮酸產量的方法，屬于發酵工程技術領域：
。本發明通過以多重維生素營養缺陷型的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019為生產菌株，利用尿素代替氯化銨作為唯一氮源，初始添加量為7g/L，在實驗室規模7L發酵罐分批發酵培養。本發明有效提高丙酮酸的產量(11.9％)及生產強度(30.9％)，大幅縮短發酵周期(20.6％)，上述成果在30L規模發酵罐中成功進行了中試，具有廣闊的工業化應用前景。
文檔編號C12P7/40GKCN102286550SQ201110166742
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月21日
發明者劉立明, 楊松鑫, 汪軍, 陳修來, 陳堅 申請人:江南大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan