專利名稱:一種煙草煙堿轉化株苗期的分子生物學鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種煙草煙堿轉化株的鑒定方法，特別是涉及一種煙草煙堿轉化株苗期的分子生物學鑒定方法。
背景技術：
目前研究結果表明，煙草中的生物堿主要有四種煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿四種。普通煙草屬煙堿積累型，以煙堿為主，其含量占總生物堿的90%以上，降煙堿是第二大生物堿，含量一般只占總生物堿的3-5%，另外兩種生物堿僅占很少部分。煙堿含量的高低是決定煙葉感官品質的重要因素，一般要求煙堿含量適宜，以達到生理強度適中、吃味醇和、刺激性小的目的。降煙堿亦稱去甲基煙堿，主要由煙堿在去甲基酶的作用下脫甲基形成。由于降煙堿易于在煙葉調制和陳化過程中發生一系列亞硝化和酰化等生化反應，形成具有致癌作用的煙草特有亞硝胺(TSNAs)的主要成分N-亞硝基降煙堿(NNN)及麥斯明、 甲酰降煙堿、乙酰降煙堿等酰化產物，導致煙葉有害成分增加和香味品質下降，直接影響著吸煙者的身體健康。因此，煙葉減害、降低煙草特有的亞硝胺含量成為目前國際煙草界的共識和主攻方向，一直是研究的重點和熱點。
我國對煙堿轉化的研究起于世紀90年代末期，研究結果表明，中國白肋煙、馬里蘭煙和香料煙均不同程度的存在煙堿轉化株比例、降煙堿含量和煙堿轉化率過高的問題。 目前，美國已將降煙堿含量作為考核新品種的主要指標，制定了降煙堿(區域試驗和小區試驗)不超過被測樣品總生物堿13%的最高限額，超限品種不得種植(王曉云，鄧云龍，李紅鶯.國外烤煙育種概況.云南農業科技，1999，4 :16-19)。
群體中的轉化株必須在煙葉生長的早期甚至苗期階段被鑒定和清除，以保證品種群體材料非轉化株的高度純合性，由于在外觀形態上無法區分非轉化株和轉化株，因此，需要通過化學或者生物技術手段來加以鑒定區分。中國煙草總公司鄭州煙草研究院申請的專利號“ZL2007100M0^8”，公開號“CN 101070535A”的發明專利一種誘導煙草煙堿提前轉化方法及其應用，是在團棵期取8-12葉位(自下而上)的煙葉1片，噴施誘導煙堿轉化性狀在綠葉中早期表達的藥品3，5-二硝基水楊酸，濃度為0. 1%，然后進行調制處理后測定煙堿和降煙堿含量，以此判斷煙株的煙堿轉化高低屬性，再進行田間轉化株剔除。本方法雖然有效，但存在以下不足1、取樣時期在移栽后的團棵期，仍然偏遲，剔除轉化株后浪費了田地，且難以保證目標群體大小；2、需化學藥品誘導方可；3、鑒定結果受環境因素影響比如藥品濃度、調制溫度和時間、化學檢測的影響因子等。因此，雖有較好的借鑒作用，但仍不夠高效與及時，無法滿足現實的需求。
發明內容
本發明的為解決現有技術的不足提供一種苗期鑒定和純化非轉化品種群體的方法，具體是一種煙草煙堿轉化株苗期的分子生物學鑒定方法，將鑒定時期從團棵期提前至苗期，而且鑒定手段簡單、準確性高，試驗效果只決定于其內在的遺傳物質而不受外部環境條件的影響，這為提高煙葉安全性和改善煙葉品質，為低危害煙葉開發奠定了堅實的理論與技術基礎。
所述一種煙草煙堿轉化株苗期的分子生物學鑒定方法，其特征在于具體步驟依次如下
A、對需鑒定的煙苗逐個掛牌以標識，然后于苗期對每個被標識的煙苗進行鮮葉取樣，每個煙苗取樣量為1-2個葉片，取好的鮮葉樣品用密封袋裝好，并做好與原煙苗一致的標識，迅速放入冰盒或超低溫冰箱中保存；
B、提取基因組DNA 取出每個密封袋中的鮮葉樣品，采用CTAB法提取各樣品煙苗基因組DNA，純化后保存備用；
C、對基因組DNA進行PCR反應用紫外分光光度計測定B步驟中提取的煙苗基因組DNA的濃度，然后取各樣品煙苗基因組DNA溶液少許，將其濃度稀釋成50ng/ μ L作為反應模板進行PCR反應，PCR反應中的特異引物序列
正向引物5，-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3，，
反向引物5，-TCGAGGTCGACGGTATC-3，；
D、PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳及電泳結果的讀取將步驟C中所獲得的PCR產物與溴酚藍-甘油溶液以4 1的體積比混合，注入樣品槽，同時注入對照ladder進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后取出凝膠，清除表面的溴化乙錠溶液，然后將膠板放入凝膠成像儀的觀察板上，利用電腦成像系統在波長254nm紫外燈下進行觀察，拍照記錄下電泳圖譜，并保存以進行比較分析；
E、轉化株的鑒定與淘汰將通過PCR特異引物擴增已知高轉化株所獲得的分子帶譜數值作為比較分析的參照數據，其具體數值的大小介于1700-1800bp之間；將步驟D中樣品PCR擴增所得的分子帶譜與兩邊對照ladder帶譜進行對比，其中能擴增出分子帶譜且帶譜數值大小介于1700-1800bp之間的樣品為高轉化株，有分子帶譜但大小小于1700bp的樣品為中等轉化株，淘汰高轉化株和中等轉化株；無法擴增出分子帶譜或者帶譜信號微弱的樣品為非轉化株煙苗，保留備用。
在步驟A摘取的鮮葉樣品，需要馬上提取DNA就迅速用冰盒保存，若不立即提取 DNA則應置于超低溫冰箱長期保存待用。
在步驟C中PCR反應在PTC-225型熱循環儀上進行，其反應體系為2. 5 μ L帶 (NH4)2SO4 的 IOX 反應緩沖液，MgCl22. Ommol/L，dNTPs 200 μ mol/L，1. 2U Tag 酶，50ng 模板 DNA，正向和反向引物各0.45μπιΟ1/1，不足部分用dd H2O補足，總體積為25 μ L ；反應程序為第一階段在94°C環境下反應％iin，第二階段在94°C的環境下反應30sec，第三階段先在 55°C環境下反應35sec，然后在72°C的環境下反應90sec，第二和第三階段共循環觀次；第四階段在72°C環境下反應％iin，并在4°C的環境下保存。
PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳過程中，在樣品進膠前可用6.5V/cm的電壓，防止樣品擴散，樣品進膠后，應控制電壓不高于5V/cm。
本發明所涉及的一種煙草煙堿轉化株苗期的分子生物學鑒定方法，具有精準高效、操作簡便、易于推廣，可用于苗期鑒定和剔除煙草煙堿轉化株、保留非煙堿轉化株、極大提高目標品種群體尤其是親本群體的非轉化株比例、煙草親本種子提純，種子煙堿轉化性狀鑒定，可降低平均煙堿轉化率，提高煙葉質量，為早期鑒定和篩選低有害物質特有亞硝胺CN 102230011 A
說明書
3/6頁
(TSNAs)煙株開辟了一條新的高效途徑。本發明適用范圍于白肋煙、馬里蘭煙、香料煙、烤煙和其它地方晾曬煙的常規種和雄性不育雜交種的品種選育和原種提純，還適用于減少煙葉中有害成分TSNAs為目標的非煙堿轉化株的早期鑒定和篩選。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明。
實施例1、白肋煙煙堿轉化株的苗期分子生物學鑒定，其具體步驟依次如下
A、煙苗標識與鮮葉樣品獲取對需鑒定的白肋煙煙苗逐個掛牌以標識，然后于苗期(只要可以取到1個葉片的生長時期均可)對每個被標識煙苗進行鮮葉取樣，每個煙苗取樣量為1個葉片，取好的鮮葉樣用密封袋裝好，并做好與原煙苗一致的標識，迅速放入冰盒中保存；
B、煙苗基因組DNA提取取出每個封口袋中的鮮葉樣品，采用CTAB法提取各樣品煙苗基因組DNA，具體提取方法依次如下
a、將濃度為2%的CTAB抽提緩沖液65°C水浴預熱；
b、從其中一個密封袋中取出1片白肋煙鮮葉樣置于小研缽中，用液氮磨至粉狀， 將磨好的樣品粉末裝入1. 5ml的滅菌離心管中，并迅速加入約650 μ L的2% CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動混合，其混合液的量為管高的2/3 ；
C、然后將裝有混合液的離心管進行65°C水浴，每IOmin輕輕搖動一次，30-60min 后取出；
d、冷卻2. 5min后，在離心管中加入氯仿-異戊醇04:1)至滿管，輕微上下振蕩 2. 5min，使兩者混合均勻，放入離心機中，IOOOOrpm離心IOmin ；與此同時，將650 μ L的異丙醇裝入一支新的離心管中；
e、當混合液在離心機中IOOOOrpm離心Imin后，使用移液器輕輕地吸取上清夜，轉入裝有異丙醇的離心管內，將離心管慢慢上下搖動40seC，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物，再在IOOOOrpm的條件下離心Imin后，立即倒掉液體，保留白色DNA沉淀，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；
f Jmin后，直立離心管，加入650 μ L的75%乙醇及90 μ L濃度為5Μ的醋酸鈉，輕輕轉動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中，放置40min，使DNA塊狀物的不純物溶解；
g、然后再放入離心機中，IOOOOrpm離心Imin后，倒掉液體，再加入800 μ L 75 %的乙醇，將DNA放置40min以溶解，放入離心機，IOOOOrpm離心40sec后，立即倒掉液體，再將離心管倒立于鋪開的紙巾上，數分鐘后，直立離心管，干燥DNA ；
h、在干燥的DNA中加入50 μ L濃度為0. 5 X TE (含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37°C恒溫箱約18h，使RNA消解。
C、基因組DNA的PCR反應用紫外分光光度計測定B步驟中提取的煙苗基因組DNA 的濃度，取各樣品煙苗基因組DNA少許，將其濃度稀釋調成50ng/ μ L作為反應模板進行PCR 反應，PCR反應中的特異引物序列
正向引物5，-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3，，反向引物5，-TCGAGGTCGACGGTATC-3，；[0033]PCR反應體系為2· 5μ L帶(NH4)2504 的 IOX 反應緩沖液，2. Ommol/L MgCl2, dNTPs 200ymol/L, Tag酶1.2U (購自MBI公司)，模板DNA 50ng，正向和反向引物各0. 45 μ mol/ L,不足部分用dd H2O補足，總體積為25 μ L0
PCR反應程序為第一階段在94°C環境下反應％iin，第二階段在94°C的環境下反應30sec，第三階段先在55°C環境下反應35sec，然后在72°C的環境下反應90sec，第二和第三階段共循環觀次；第四階段在72°C環境下反應-in，并在4°C的環境下保存。
D、PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳及電泳結果的讀取，其具體步驟如下
a、瓊脂糖膠液的制備稱取0. 7g瓊脂糖，置于三角燒瓶中，加入100ml pH為8. 3 的Tris-硼酸EDTA緩沖液，加熱配制成為0. 7%瓊脂，加入溴化乙錠(EB) 2 μ L ；
b、凝膠板的制備將熱的處于液體狀態的瓊脂糖膠液倒入預先制作好的凝膠模板槽中，插上樣品梳，四周用膠液封口，冷卻待用；
c、上樣用pH為8. 3的Tris-硼酸-EDTA緩沖液先填滿加樣槽，接著再倒入大量緩沖液直至浸沒過凝膠面2mm，將C步驟中獲得的PCR產物與溴酚藍-甘油溶液以4 1的體積比混合，用加樣槍將PCR產物注入樣品槽中，每個樣品加入量一般不超過20 μ L，最后在第一個和最后一個加樣孔加入對照ladder λ DNA/HindIII ；
d、電泳加樣完畢，將靠近樣品槽一端連接負極.另一端連接正極，接通電源，開始電泳。在樣品進膠前可用6. 5V/cm電壓，防止樣品擴散，樣品進膠后，應控制電壓不高于 5V/cm(電壓值V/電泳板兩極之間距離比)，當染料條帶移動到距離凝膠前沿約Icm時，停止電泳；
e.觀察記錄電泳結果小心地取出凝膠置托盤上，并用水輕輕沖洗膠表面的溴化乙錠溶液，然后再將膠板小心放置入凝膠成像儀的觀察板上，關上門，利用電腦成像系統在波長254nm紫外燈下進行觀察DNA存在的位置呈現橘紅色熒光，肉眼可觀察到清晰的條帶， 初步觀察后，應立即拍照記錄下電泳圖譜，并編號保存在電腦中以作后續分析判斷。
E、轉化株的鑒定與淘汰將通過PCR特異引物擴增已知高轉化株所獲得的分子帶譜作為比較分析的參照數據，大小數值介于1700-1800bp之間；將樣品PCR擴增所得的分子帶譜與兩邊對照ladder帶譜進行對比，將能擴增出分子帶譜且大小介于1700_1800bp之間的樣品確定為高轉化株，有分子帶譜但大小小于1700bp的樣品確定為中等轉化株，淘汰高和中等轉化株；將無法擴增出分子帶譜或者帶譜信號微弱的樣品確定為非轉化株煙苗，保留備用；由此獲得高度純合的非轉化株品種群體。
為驗證本發明鑒定的準確性，隨機選擇通過以上步驟鑒定為高轉化株和非轉化株的白肋煙煙苗各20株，于團棵期測定其煙堿和降煙堿含量(參照煙草行業標準YC/T 383-2010，煙草及煙草制品煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明和假木賊堿的測定-氣相色譜-質譜聯用法)，以此計算其煙堿轉化率，一般按煙堿轉化率大小對煙株進行分級(1)非轉化株煙堿轉化率低于5%的煙株；(2)低轉化株煙堿轉化率低于5%至20%的煙株；(3) 中轉化株煙堿轉化率低于20%至50%的煙株；(4)高轉化率煙堿轉化率大于50% ；結果顯示，本發明鑒定的20株高轉化株經過化學檢測確認全部為高轉化株，平均轉化率為 95.5%，而本發明鑒定的20株非轉化株經過化學檢測確認全部為非煙堿轉化株，平均轉化率為2. 1%，由此可見，本發明所提供的方法具有高度的準確性，與實際情況完全吻合。
實例2、馬里蘭煙煙堿轉化株的苗期分子生物學鑒定，其具體步驟依次如下[0044]A、煙苗標識與鮮葉樣品獲取對需鑒定的馬里蘭煙苗逐個掛牌以標識，然后于苗期(只要可以取到2個葉片的生長時期均可)對每個被標識煙苗進行鮮葉取樣，每個煙苗取樣量為2個葉片，取好的鮮葉樣用密封袋裝好，并做好與原煙苗一致的標識，迅速放入冰盒中保存，回實驗后將鮮葉樣放入超低溫冰箱中保存20天后再取出提取基因組DNA ；
B、煙苗基因組DNA提取取出每個封口袋中的鮮葉樣品，采用CTAB法提取煙苗基因組DNA，具體提取方法依次如下
a、將濃度為2 %的CTAB抽提緩沖液65°C水浴預熱；
b、從其中一個封口袋中取出2片馬里蘭煙鮮葉樣置于小研缽中，用液氮磨至粉狀，用2ml的滅菌離心管收集磨好的樣品粉末，并立即加入約700μ L的2% CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動混合，混合液的量約為管高的2/3 ；
C、然后將裝有混合液的離心管進行65°C水浴，每IOmin輕輕搖動一次，30-60min 后取出；
d、冷卻^iin后，在離心管中加入氯仿-異戊醇04:1)至滿管，輕微上下振蕩 3min，使兩者混合均勻，放入離心機中，IOOOOrpm離心IOmin ；與此同時，將750 μ L的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中；
e、當混合液在離心機中IOOOOrpm離心Imin后，使用移液器輕輕地吸取上清夜，轉入裝有異丙醇的離心管內，將離心管慢慢上下搖動50seC，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物，再在IOOOOrpm的條件下離心Imin后，立即倒掉液體，保留白色DNA沉淀，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；
f Jmin后，直立離心管，加入700 μ L的75%乙醇及100 μ L濃度為5Μ的醋酸鈉， 輕輕轉動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中，放置50min，使DNA塊狀物的不純物溶解；
g、然后再放入離心機中，IOOOOrpm離心Imin后，倒掉液體，再加入800 μ L 75 %的乙醇，將DNA放置50min，然后放入離心機，IOOOOrpm離心50sec后，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上，數分鐘后，直立離心管，干燥DNA ；
h、在干燥的DNA中加入50 μ L 0. 5 X TE (含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37°C 恒溫箱約20h，使RNA消解。
C、基因組DNA的PCR反應用紫外分光光度計測定B步驟中提取的煙苗基因組DNA 的濃度，取各種樣品煙苗基因組DNA溶液少許，將其濃度稀釋成50ng/ μ L作為反應模板進行PCR反應，PCR反應中的特異引物序列
正向引物5，-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3，，
反向引物5，-TCGAGGTCGACGGTATC-3，；
PCR反應體系為2· 5μ L帶(NH4)2504 的 IOX 反應緩沖液，2. Ommol/L MgCl2, dNTPs 200ymol/L, Tag酶1.2U (購自MBI公司)，模板DNA 50ng，正向和反向引物各0. 45 μ mol/ L,不足部分用dd H2O補足，總體積為25 μ L0
PCR反應程序為第一階段在94°C環境下反應％iin，第二階段在94°C的環境下反應30sec，第三階段先在55°C環境下反應35sec，然后在72°C的環境下反應90sec，第二和第三階段共循環觀次；第四階段在72°C環境下反應-in，并在4°C的環境下保存。
D、PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳及電泳結果的讀取，其具體步驟如下[0060]a、瓊脂糖膠液的制備稱取Ig瓊脂糖，置于三角燒瓶中，加入100ml pH為8. 3的 Tris-硼酸EDTA緩沖液，加熱配制成為1 %瓊脂，加入溴化乙錠(EB) 2. 5 μ L ；
b、凝膠板的制備將熱的處于液體狀態的瓊脂糖膠液倒入預先制作好的凝膠模板槽中，插上樣品梳，四周用膠液封口，冷卻待用；
c、上樣用pH為8. 3的Tris-硼酸-EDTA緩沖液先填滿加樣槽，接著再倒入大量緩沖液直至浸沒過凝膠面3mm，將C步驟中獲得的PCR產物與溴酚藍-甘油溶液以4 1的體積比混合，用加樣槍將PCR產物注入樣品槽中，每個樣品加入量一般不超過20 μ L，最后在第一個和最后一個加樣孔加入對照ladder λ DNA/HindIII ；
d、電泳加樣完畢，將靠近樣品槽一端連接負極.另一端連接正極，接通電源，開始電泳。在樣品進膠前可用6.5V/cm電壓.防止樣品擴散，樣品進膠后，應控制電壓5V/ cm(電壓值V/電泳板兩極之間距離比)，當染料條帶移動到距離凝膠前沿約Icm時，停止電泳；
e.觀察記錄電泳結果小心地取出凝膠置托盤上，并用水輕輕沖洗膠表面的溴化乙錠溶液，然后再將膠板小心放置入凝膠成像儀的觀察板上，關上門，利用電腦成像系統在波長254nm紫外燈下進行觀察DNA存在的位置呈現橘紅色熒光，肉眼可觀察到清晰的條帶， 初步觀察后，應立即拍照記錄下電泳圖譜，并編號保存在電腦中以作后續分析判斷。
E、轉化株的鑒定與淘汰將通過PCR特異引物擴增已知高轉化株所獲得的分子帶譜大小數值作為比較分析的參照數據，數值大小介于1700-1800bp之間。將樣品PCR 擴增所得的分子帶譜與兩邊對照ladder帶譜進行對比，將能擴增出分子帶譜且大小介于 1700-1800bp之間的樣品確定為高轉化株，有分子帶譜但大小小于1700bp的樣品確定為中等轉化株，淘汰高和中等轉化株；將無法擴增出分子帶譜或者帶譜信號微弱的樣品確定為非轉化株煙苗，保留備用。由此獲得了高度純合的非轉化株品種群體。
同樣，為驗證本發明所提供技術的準確性，采用同實例1的方法進行了結果驗證， 結果顯示，本發明鑒定的20株馬里蘭煙高轉化株經過化學檢測確認全部為高煙堿轉化株， 平均轉化率為93. 6%，而本發明鑒定的20株馬里蘭煙非轉化株經過化學檢測確認全部為非煙堿轉化株，平均轉化率為3. 3%，由此可見，本發明所提供的方法具有高度的準確性，與實際情況完全吻合。
8
權利要求
1.一種煙草煙堿轉化株苗期的分子生物學鑒定方法，其特征在于具體步驟依次如下A、對需鑒定的煙苗逐個掛牌以標識，然后于苗期對每個被標識的煙苗進行鮮葉取樣， 每個煙苗取樣量為1-2個葉片，取好的鮮葉樣品用密封袋裝好，并做好與原煙苗一致的標識，迅速放入冰盒或超低溫冰箱中保存；B、提取基因組DNA取出每個密封袋中的鮮葉樣品，采用CTAB法提取各樣品煙苗基因組DNA，純化后保存備用；C、對基因組DNA進行PCR反應用紫外分光光度計測定B步驟中提取的煙苗基因組DNA 的濃度，然后取各樣品煙苗基因組DNA溶液，將其濃度稀釋成50ng/ μ L作為反應模板進行 PCR反應，PCR反應中的特異引物序列正向引物5’ -ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3，，反向引物5，-TCGAGGTCGACGGTATC-3，；D、PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳及電泳結果的讀取將步驟C中所獲得的PCR產物與溴酚藍-甘油溶液以4 1的體積比混合，注入樣品槽，同時注入對照ladder進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后取出凝膠，清除表面的溴化乙錠溶液，然后將膠板放入凝膠成像儀的觀察板上，利用電腦成像系統在波長254nm紫外燈下進行觀察，拍照記錄下電泳圖譜，并保存以進行比較分析；E、轉化株的鑒定與淘汰將通過PCR特異引物擴增已知高轉化株所獲得的分子帶譜數值作為比較分析的參照數據，其具體數值的大小介于1700-1800bp之間；將步驟D中樣品 PCR擴增所得的分子帶譜與兩邊對照ladder帶譜進行對比，其中能擴增出分子帶譜且帶譜數值大小介于1700-1800bp之間的樣品為高轉化株，有分子帶譜但大小小于1700bp的樣品為中等轉化株，淘汰高轉化株和中等轉化株；無法擴增出分子帶譜或者帶譜信號微弱的樣品為非轉化株煙苗，保留備用。
2.根據權利要求
1所述的一種煙草煙堿轉化株苗期的分子生物學鑒定方法，其特征在于在步驟A摘取的鮮葉樣品，需要馬上提取DNA就迅速用冰盒保存，若不立即提取DNA則應置于超低溫冰箱長期保存待用。
3.根據權利要求
1所述的一種煙草煙堿轉化株苗期的分子生物學鑒定方法，其特征在于在步驟C中PCR反應在PTC-225型熱循環儀上進行，其反應體系為2.5yL帶(NH4)2SO4 的 IOX 反應緩沖液，MgCl22. Ommol/L，dNTPs 200 μ mol/L，1. 2U Tag 酶，50ng 模板 DNA，正向和反向引物各0.45 4!1101/1，不足部分用(1(1 H2O補足，總體積為25 μ L ；反應程序為第一階段在94°C環境下反應％iin，第二階段在94°C的環境下反應30sec，第三階段先在55°C環境下反應35sec，然后在72°C的環境下反應90seC，第二和第三階段共循環觀次；第四階段在72°C環境下反應％iin，并在4°C的環境下保存。
4.根據權利要求
1所述的一種煙草煙堿轉化株苗期的分子生物學鑒定方法，其特征在于PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳過程中，在樣品進膠前可用6. 5V/cm的電壓，防止樣品擴散， 樣品進膠后，應控制電壓不高于5V/cm。
專利摘要
本發明涉及一種煙草煙堿轉化株苗期的分子生物學鑒定方法。該方法主要步驟是取苗期鮮葉樣采用CTAB法提取基因組DNA，以基因組DNA作為擴增模板結合特異引物進行PCR反應，然后將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統中觀察、讀取分子標記帶譜，再與目標帶譜進行對比來判定樣品的轉化特性。本發明所述的方法不受環境因素影響，也無需人工化學誘導煙堿轉化，苗期即可取樣操作，將轉化株的鑒定與篩選提前到煙苗移栽前，大大節省了時間，而且精準高效、操作簡便、易于推廣，可用于煙草親本種子提純，種子煙堿轉化性狀鑒定，也可適應于其他煙草類型煙堿轉化株的鑒定與剔除。
文檔編號C12Q1/68GKCN102230011SQ201110161870
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月16日
發明者朱天, 李宗平, 李進平, 楊春雷, 楊樹, 林國平, 羅曉敏, 蔡長春 申請人:湖北省煙草科研所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan