專利名稱:一種單條線蟲dna的快速提取方法
技術領域：
本發明涉及線蟲DNA的提取，具體涉及一種單條線蟲DNA的快速提取方法。
背景技術：
線蟲是動物界中數量最豐富者之一，寄生于動、植物，或自有生活于土壤、淡水和海水環境中。其中松材線蟲Bursaphelenchus xylophiIus、椰子紅環腐線蟲漢cocophilus、菊花滑刃線蟲 Aphelenchoides ri tzemabosi > 馬鈴薯金線蟲 Globoderarostochiensis等線蟲，由于對農業、林業等經濟生產生活都具有嚴重的危害，易造成巨大經濟損失，是我國重要的檢疫性線蟲。由于線蟲體形較小，形態學鑒定十分困難，分子生物學方法已成為十分有效的鑒定手段。線蟲的分子生物學鑒定需要制備用于PCR反應的DNA模板，早期方法用SDS破壁結合氯仿去除蛋白及其他雜質，提取線蟲DNA。如公開號為CN101580830的發明專利申請，就公開了裂解液凍融、蛋白酶K消化、氯仿提取等技 術，但提取時間長、操作繁瑣，所用試劑多、價格貴，不利于快速檢測。所以部分學者尋求簡捷的方法包括微型攪拌器破碎法、研磨法、手工切斷法、超聲波勻漿法等，如公開號為CN100487435的發明專利，就公開了線蟲用雙蒸水清洗后，直接機械破碎于檢測試劑中，通過濾紙吸附后，95°C加熱，離心，再PCR反應和檢測，該方法雖然快速，操作方便；但該方法需提取與檢測一起完成，非獨立快速提取DNA，所以DNA模板無法備份，且僅對松樹萎蔫病原線蟲有效，也無法通用；該方法提取時樣品損失較大，只是在破碎壓制時少量吸附于濾紙的DNA和引物進行PCR反應和檢測，DNA提取效率低，手工破碎也易造成污染；也未降解蛋白質和酶類等雜質，所以會影響檢測的準確性。綜上所述，目前還未公開一種快速、高效、純度高、污染少、通用的單條線蟲DNA的提取方法。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種通用、雜質少、純度高、污染少、快速、高效、DNA模板備份量較多的單條線蟲DNA的快速提取方法。
本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種單條線蟲DNA的快速提取方法，包括下述步驟
a、線蟲洗滌在滅菌的潔凈載玻片上滴加滅菌的雙蒸水，用滅菌的O號針將單條線蟲挑入所述雙蒸水中洗滌；
b、線蟲轉移上述單條線蟲洗滌后，再將線蟲挑入滅菌的200 UL PCR管中，所述PCR管內含8 μ L雙蒸水和I yL的10XPCR Buffer溶液，然后13000 rpm離心I min ;10XPCR Buffer 溶液(Mg2+ free):包括 ρΗ8· 3 的 Tris-HCl 溶液 100 mM, KCl 溶液 500mM :購于TaKaRa公司；
C、破壞線蟲表皮細胞離心后，將所述PCR管置于液氮中速冷I min，取出后立即在85 °C條件下恒溫2 min，再立即將PCR管的溫度速降至56 °C，恒溫30 sec ;此變溫過程需在PCR儀中設置程序，并按照程序操作完成，在冷熱劇烈變化下使線蟲體壁細胞破裂，效果明顯；
d、DNA釋放在上述56°C恒溫后的PCR管中加入濃度為I mg/mL的蛋白酶K(購自TaKaRa公司)1 μ L，先在56°C下恒溫15 min，再在95°C條件下恒溫10 min，得到DNA提取液，-20°C保存備用。蛋白酶K可以消化線蟲細胞，釋放DNA，56°C為其最適作用溫度，95°C為了使蛋白酶K失活以免影響之后的PCR擴增反應，效果很好。
與現有技術相比，本發明的優點在于一種快速、高效、適用范圍廣的單條線蟲DNA提取方法，使用PCR Buffer溶液代替WLB裂解液和SDS裂解液，減少了溶液配置的不確定性和外來離子的影響；通過冷熱劇烈變化使線蟲體壁細胞破裂；用蛋白酶K消化線蟲細胞，釋放DNA ;整個提取過程在一個PCR管中完成，并可直接用于PCR擴增，沒有溶液的轉移和過多的溶質添加，減少污染及對后續PCR的影響；本發明使用變溫處理代替其他手工破碎方法，不需要操作技巧，減少了外界污染物的摻入，使用液氮處理，縮短了處理時間；可以對 單條線蟲提取的DNA稀釋32倍進行PCR擴增反應檢測，通過對16種不同種線蟲進行DNA提取，PCR擴增反應檢測，結果穩定。該方法可通用于對單條線蟲進行提取和鑒定，及進一步的序列分析。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
實施例I
一種單條松材線蟲DNA的快速提取方法，在滅菌的潔凈載玻片上滴加適量滅菌的雙蒸水，用滅菌的O號針將單條松材線蟲挑入雙蒸水中洗滌；該松材線蟲洗滌后，再將松材線蟲挑入滅菌的200 μ L PCR管中，PCR管內預裝有8 μ L雙蒸水和I yL的10XPCRBuffer溶液(Mg2+ free),然后13000 rpm離心I min ;離心后,將PCR管置于液氮中速冷Imin,取出，立即在85°C條件下恒溫2 min,再將PCR管的溫度速降至56°C,恒溫30 sec ;在上述56°C恒溫后的PCR管中加入濃度為I mg/mL的蛋白酶K溶液I μ L，先在56°C下恒溫15 min，再在95°C條件下恒溫10 min，得到松材線蟲DNA提取液，_20°C保存備用。
實施例2
與實施例I基本相同，所不同的只是松材線蟲由椰子紅環腐線蟲替代，得到的是椰子紅環腐線蟲DNA提取液。
實施例3
與實施例I基本相同，所不同的只是松材線蟲由馬鈴薯金線蟲替代，得到的是馬鈴薯金線蟲DNA提取液。
實施例4
與實施例I基本相同，所不同的只是松材線蟲由菊花滑刃線蟲替代，得到的是菊花滑刃線蟲DNA提取液。
上述實施例只是對本明的說明，其它線蟲的DNA提取方法同上都可實現，在此不一一列舉，本明的的方法對線蟲具有通用性，我們共對16種不同種線蟲進行DNA提取，都具有雜質少、純度高、污染少、快速、高效的優點，并對各種的DNA提取液32倍稀釋進行PCR擴增反應檢測驗證，結果都穩定，靈敏。
權利要求
1.一種單條線蟲DNA的快速提取方法，其特征在于包括下述步驟a線蟲洗滌在滅菌的潔凈載玻片上滴加滅菌的雙蒸水，用滅菌的O號針將單條線蟲挑入所述雙蒸水中洗滌； b線蟲轉移上述單條線蟲洗滌后，再將線蟲挑入滅菌的200 uL PCR管中，所述PCR管內含8 μ 雙蒸水和I yL 10XPCR Buffer溶液，然后13000 rpm離心I min，所述10XPCRBuffer 溶液為無 Mg2+ 的 10XPCR Buffer 溶液，其含有 pH8. 3 的 Tris-HCl 溶液 100 mM,KCl 溶液 500 mM ； c破壞線蟲表皮細胞離心后，將所述PCR管置于液氮中速冷I min，取出后立即在85°C條件下恒溫2 min,再立即將PCR管的溫度速降至56°C,恒溫30 sec ； d DNA釋放在上述56°C恒溫后的PCR管中加入I μ L濃度為I mg/mL的蛋白酶K，先在56°C下恒溫15 min，再在95°C條件下恒溫10 min，得到DNA提取液，_20°C保存備用。
專利摘要
本發明公開了一種快速、高效、適用范圍廣的單條線蟲DNA提取方法，使用PCRBuffer溶液代替WLB裂解液和SDS裂解液，減少了溶液配置的不確定性和外來離子的影響；通過冷熱劇烈變化使線蟲體壁細胞破裂；用蛋白酶K消化線蟲細胞，釋放DNA；整個提取過程在一個PCR管中完成，并可直接用于PCR擴增，沒有溶液的轉移和過多的溶質添加，減少污染及對后續PCR的影響；本發明使用變溫處理代替其他手工破碎方法，不需要操作技巧，減少了外界污染物的摻入，使用液氮處理，縮短了處理時間；可以對單條線蟲提取的DNA稀釋32倍進行PCR擴增反應檢測。
文檔編號C12N15/10GKCN102161989 B發布類型授權 專利申請號CN 201110049172
公開日2013年1月16日 申請日期2011年3月2日
發明者顧建鋒, 王江嶺, 張建成 申請人:寧波檢驗檢疫科學技術研究院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (3),