專利名稱:一種木瓜蛋白酶的提取方法
技術領域：
本發明涉及酶的提取及提純，具體地說，本發明涉及一種木瓜蛋白酶的提取方法。
技術背景
木瓜蛋白酶(Papain)簡稱木瓜酶，又稱為木瓜酵素，是利用未成熟的番木瓜果實 中的乳汁，采用現代生物工程技術提煉而成的純天然生物酶制品。它是一種含疏基(-SH) 肽鏈內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺 等有較強的水解能力，同時，還具有合成功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質。它所應用 的行業領域比較廣泛，包括醫藥工業、食品工業、美容化妝品工業、飼料工業、皮革工業、紡 織工業等領域。由于木瓜蛋白酶涉及領域的廣泛，人們對它的認識越來越深刻，其應用價值 和領域也越來越大。現在國內已有一部分企業開始生產木瓜蛋白酶，但大部分產品仍屬于 粗加工產品，應用領域有限。
木瓜蛋白酶主要存在于未成熟番木瓜果實的乳汁中，它能有效地分解明膠、酪蛋 白、谷蛋白、彈性蛋白、球蛋白和肌纖維蛋白等常用蛋白質，被廣泛應用于肉類嫩化、啤酒澄 清、明膠制造、蠶繭脫膠、皮革脫毛等工業，在醫療衛生方面用途更廣，但因番木瓜種植區主 要分布在經濟不發選地區.所以蛋白酶生產工藝相對落后，很多地區仍采用太陽暴曬的方 式生產木瓜蛋白酶。按此法生產的產品質量不穩定，多數產品達不到質量要求，因此，如何 改進生產工藝、提高產品質量已成為當前急需解決的課題。
木瓜蛋白酶的提取、提純方法很多，其分離提取方法主要有親和層析分離法、超 濾膜分離法、沉淀分離法、萃取分離法以及絮凝法等。如CN1908164公開了一種木瓜蛋白 酶的制備方法，包括離心、微濾、三級超濾；CN1944640也公開了一種木瓜蛋白酶的物理提 取方法，它包括以下步驟木瓜漿、冷凍、預處理、粗過濾、精過濾、兩級超濾，采用超濾技術 純化木瓜蛋白酶，操作條件溫和，不易引起生化物質破壞，但由于木瓜蛋白酶屬于大分子物 質，在超濾過程中會在膜表面聚積而產生濃差極化現象，使超濾速率逐漸下降，且存在有機 溶劑的殘留等問題；公開號為CN 1597946A的專利申請公開了一種木瓜蛋白酶的制備方 法，它采用鹽析法進行粗酶及精酶制備，精酶活力200萬單位/克，采用鹽析法提取的木瓜 蛋白酶活性較低，與藥用要求相差較遠，且由于用了大量的鹽，使酶中灰分增加，同時降低 了每克木瓜蛋白酶活性，利用有機溶劑提取木瓜蛋白酶，程序復雜，提取率較低，存在有機 溶劑的殘留等問題；絮凝法提取專一性不強，制得的木瓜蛋白酶純度不高，雜質含量較高。 親和層析分離法提取的木瓜蛋白酶雖然純度較高，但操作復雜，不易工業上的放大生產，且 用于親和層析的前處理液需是經過初步純化的酶液。
上述提取方法大多需經過各種分級沉淀、鹽析、結晶、洗滌、層析等過程，這些方法 提取成本高，產量低，操作較繁瑣，而且經割采乳汁后的番木瓜果實未能得到充分的利用， 從而造成浪費。
目前，雙水相萃取已被廣泛用于蛋白質、酶、核酸、病毒、細胞、細胞器等生物產品 的分離和純化。由于雙水相萃取具有兩相界面張力低、有助于保持生物活性和強化相際間的質量傳遞、易于連續化操作等優點，其在木瓜蛋白酶的制備中應有一席之地，但這方面的 報道非常有限。
隨著木瓜蛋白酶應用的不斷開發，傳統的萃取分離技術所提取的木瓜蛋白酶的純 度，已經不能滿足工業上的要求，特別是對于醫藥行業，含雜蛋白的木瓜蛋白酶會對人體引 起過敏反應，對木瓜蛋白酶的純度求也越來越高，因此迫切需要特異性更大的制備木瓜蛋 白酶的方法，開發新型的親和雙水相萃取技術，作為有效的高純度木瓜蛋白酶的分離提取 方法是很有意義的。因此，親和雙水相萃取是一種理想的提取木瓜蛋白酶的新方法。在雙 水相萃取操作過程中，對溶液的PH值及兩相的質量分數比要求非常高，因此確定兩相物質 的質量分數比成為一項關鍵的技術，這關系到能否成功地提純木瓜蛋白酶。
發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明者在生產工藝上作了改進，改變了傳統的加工 工藝，設計出了一種木瓜蛋白酶的提取方法，該方法具有目標產物有較高收率、不存在有機 溶劑殘留、分離過程經濟等優點。
本發明的目的在于提供所述木瓜蛋白酶的提取方法。
根據本發明提供的一種木瓜蛋白酶的提取方法，所述方法包括以下步驟
1)利用超聲波粉碎番木瓜；
2)用kphadex GlOO凝膠層析進行粗酶分離；
3)利用聚乙二醇和磷酸鉀或甲基纖維素和葡聚糖進行雙水相萃取，提純精酶。
根據本發明所述的提取方法，在步驟1)中，料液溫度控制在2 15°C之間。
根據本發明所述的提取方法，在步驟1)中，番木瓜果漿在40 59KHz的超聲波下 處理0. 5 1. 5小時。
根據本發明所述的提取方法，聚乙二醇和磷酸鉀的質量分數比為2.2 3 1。
根據本發明所述的提取方法，甲基纖維素和葡聚糖的質量分數比為1.6 2. 1 1。
根據本發明所述的提取方法，在步驟3)中，溶液pH值為3.3 3.8。
本發明對木瓜蛋白酶的生產工藝進行了突破性的改進，不僅有效降低了產能消 耗，而且大幅度提升了產品的質量，在酶的活性、純度、溶解性、有效成分保護技術等方面有 著出色的表現，與市場現有的木瓜蛋白酶產品比較，具有如下特點
1、酶加工技術先進改變了傳統的加工工藝。利用超聲波粉碎番木瓜，釋放果漿中 的木瓜蛋白酶，提高酶的提取率，減少了加工過程中酶活力的損失，并具有分離效率高、產 品純度高、不存在載體對樣品的吸附和污染、制備量大等優點。
2、酶活性高粗制酶活力高達100萬u/g以上，精制酶280 350萬u/g，甚至可 以達到400萬u/g。(200萬u/g相當于國際市場上的1000TU/mg或者6000USP/g)
3、酶純度高采用雙水相萃取技術，提純精酶，此操作具有目標產物有較高的收 率，不存在有機溶劑殘留，分離過程經濟的優點，使酶純度高達99%以上。
4、酶活回收率高用kphadex GlOO凝膠層析，進行粗酶的分離，省去了反復沉淀 步驟，使活力回收大大提高，達到117%以上(國內目前最高只能達到約106% )。由于原料 本身不含有害物質，在操作過程中也沒有引人有害雜質，因此.得到的木瓜酶制品可以直接用于食品的深加工等。
具體實施方式
以下用實施例對本發明作更詳細的描述。這些實施例僅僅是對本發明最佳實施方 式的描述，并不對本發明的范圍有任何限制。
實施例1
1)超聲波粉碎
選擇新鮮的番木瓜，清洗去皮、籽、瓤后，切塊破碎，稱取果肉，加入一定量的蒸餾 水進行打漿，配成漿溶液。果漿在40 59KHz的超聲波下處理0. 5 1. 5小時，離心，除雜 過濾后，進行超濾濃縮，收集酶液樣品，備用。整個過程中料液的溫度控制2°C。
2)層析(粗酶)
將酶液取出進行風干處理，稱取IOOg木瓜粉，充分研磨至粉狀，加入蒸餾水，用G5 熔砂漏斗抽濾，得到的濾液用kphadex GlOO層析柱進行分離，收集酶液。
3)雙水相萃取(精酶)
采用聚乙二醇和磷酸鉀雙水相體系，兩者質量分數比為2. 3 1，將確定好的雙水 相物質調整PH值至3. 4后，加入到木瓜乳汁中，混合，離心，洗脫后，得到制品木瓜蛋白酶。
實施例2
在步驟1)中，料液的溫度控制5°C，在步驟幻中，采用甲基纖維素和葡聚糖雙水相 體系，兩者質量分數比為1.8 1，？!1值為3.5。其余步驟同實施例1。
實施例3
在步驟1)中，料液的溫度控制13°C，在步驟幻中，采用聚乙二醇和磷酸鉀雙水相 體系，兩者質量分數比為2. 8 1，？!1值為3.6。其余步驟同實施例1。
實施例4
在步驟1)中，料液的溫度控制5°C，在步驟幻中，采用甲基纖維素和葡聚糖雙水相 體系，兩者質量分數比為2.1 1，？!1值為3.8。其余步驟同實施例1。
實施例5
在步驟1)中，料液的溫度控制10°C，在步驟幻中，采用聚乙二醇和磷酸鉀雙水相 體系，兩者質量分數比為2. 5 1，？!1值為3.7。其余步驟同實施例1。
試驗例
1、木瓜蛋白酶酶活力的測定
在每支試管中加入250酪蛋白(1.0mg/ml)，37°C保溫lOmin，各試管中加入適量的 實施例3得到的木瓜蛋白酶，37°C精確保溫lOmin，之后加入5ml考馬斯亮藍溶液(IOOmg 考馬斯亮藍，50ml 95%乙醇，IOOml 85%磷酸，定容至IOOOml)，混勻，室溫放置20min，測 595nm的光吸收，對照蛋白濃度標準曲線查出相應的蛋白濃度，并計算酶活力平均值為320 萬u/g。一個酶活力單位定義為37°C，Imin內水解Img酪蛋白所需酶量。
2、測量木瓜蛋白酶純度
FPLC中的離子交換層析可計算木瓜蛋白酶的純度。25ul的純化木瓜蛋白酶05G 蛋白)在PH為10. 6的20ml甘氨酸-氫氧化鈉緩沖區緩沖，木瓜蛋白酶和其他蛋白隨后洗 脫后，使用編程線性梯度氯化鈉從O至0. 5米(總量約2細1)在液相色譜中的流速為1. Oml/min。記錄色譜小塊A280和梯度組成與洗脫量，計算得出蛋白酶純度為99. 58%。
根據本發明的木瓜蛋白酶的生產工藝，不僅有效降低了產能消耗，而且大幅度提 升了產品的質量，在酶的活性、純度、溶解性、有效成分保護技術等方面有著出色的表現，與 市場現有的木瓜蛋白酶產品比較，具有如下特點
1、提高酶的提取率，減少了加工過程中酶活力的損失，并具有分離效率高、產品純 度高、不存在載體對樣品的吸附和污染、制備量大等優點。
2、酶活性高粗制酶活力高達100萬u/g以上，精制酶280 350萬u/g，甚至可 以達到400萬u/g。(200萬u/g相當于國際市場上的1000TU/mg或者6000USP/g)
3、酶純度高達99%以上。
4、酶活回收率高用kphadex GlOO凝膠層析，進行粗酶的分離，省去了反復沉淀 步驟，使活力回收大大提高，達到117%以上(國內目前最高只能達到約106% )。由于原料 本身不含有害物質，在操作過程中也沒有引人有害雜質，因此.得到的木瓜酶制品可以直 接用于食品的深加工等。
權利要求
1.一種木瓜蛋白酶的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步驟1)利用超聲波粉碎番木瓜；2)用kphadexGlOO凝膠層析進行粗酶分離；3)利用聚乙二醇和磷酸鉀或甲基纖維素和葡聚糖進行雙水相萃取，提純精酶。
2.根據權利要求
1所述的提取方法，其特征在于，在步驟1)中，料液溫度控制在2 15°C之間。
3.據權利要求
1所述的提取方法，其特征在于，在步驟1)中，番木瓜果漿在40 59KHz 的超聲波下處理0. 5 1. 5小時。
4.根據權利要求
1所述的提取方法，其特征在于，聚乙二醇和磷酸鉀的質量分數比為 2 · 2 3 · 1 ο
5.根據權利要求
1所述的提取方法，其特征在于，甲基纖維素和葡聚糖的質量分數比 為 1. 6 2. 1 1。
6.根據權利要求
1所述的提取方法，其特征在于，在步驟3)中，溶液pH值為3.3 3.8。
專利摘要
本發明提供了一種木瓜蛋白酶的提取方法。所述方法包括以下步驟1)利用超聲波粉碎番木瓜；2)用Sephadex G100凝膠層析進行粗酶分離；3)利用雙水相萃取，提純精酶。采用本發明提取方法得到的粗制酶活力高達100萬u/g以上，精制酶活力為280～350萬u/g，酶純度高達99％以上，酶回收率達到117％以上，具有目標產物有較高收率、不存在有機溶劑殘留、分離過程經濟等優點。
文檔編號C12N9/50GKCN102108348SQ200910200749
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月25日
發明者羌利民 申請人:南通遠大生物科技發展有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan