專利名稱:一種制備重組人pdcd5的方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥領域，具體涉及一種制備具有促進細胞凋亡活性的重組人 PDCD5(programmed cell death 5)的方法。
背景技術：
PDCD5是北京大學醫學部在國際上首先發現的新的程序性細胞死亡相關基因， 編碼125個氨基酸的蛋白質。1999年在國際雜志發表論文時曾命名為TFAR19 (TF-1 cell apoptosis related gene 19)， 2002年國際人類基因命名委員會將其統一命 名為PDCD5。研究證明，PDCD5是一個新的抑癌基因，在多種腫瘤中表達下調，通 過結合組蛋白乙酰轉移酶Tip60發揮促進腫瘤細胞凋亡的作用。動物實驗證明重組 人PDCD5蛋白對腫瘤的的化療具有明顯的增敏效應，其本身未發現毒副作用。
中國專利公開號CN1218833A公開的發明專利申請"具 有細胞凋亡促進活性的 多肽"，涉及PDCD5的制備，重組PDCD5為包涵體形式的原核融合表達，通過變性 溶解和稀釋復性后，酶解釋放出目的蛋白，再用陰離子交換柱DEAE分離純化。中 國專利公開號CN101214371A公開的"人重組蛋白PDCD5在制備腫瘤化療增敏藥中 的應用"，重組PDCD5為原核可溶性表達，目的蛋白PDCD5的表達量僅占菌體可溶 性蛋白的8%，在小試水平經離子交換和疏水2步層析，目的蛋白龜泳純度大于95%。 上述2個專利中均未涉及重要純化參數如pH、離子強度和純化評價指標如收率等的 描述。大腸桿菌采用可溶性表達形式表達重組蛋白可以避免目的蛋白的變復性過 程，但菌體破碎液中目的蛋白混雜了大量的可溶性菌體蛋白，給后續目的蛋白的分 離純化帶來了很大的困難，特別在工業化高密度發酵純化生產時。本發明主要體現 在，宿主細胞經流加-批式高密度發酵，菌體密度和目的蛋白表達量提高；通過調 節菌液或細胞破碎液的pH至酸性，可以沉淀大部分的雜蛋白，方便了后續的層析 分離，而不影響目的蛋白的活性和收率；在層析分離精制時選用陰離子、陽離子或 疏水作用介質的任意2種介質組合，目的蛋白的純度和收率可分別達到99%和70% 以上；且本工藝可放大至中試生產。
發明內容
本發明的目的是，提供一種制備基因重組人PDCD5的方法，該方法不僅使重組 人PDCD5的表達量高，而且產率和純度高，并可放大中試生產。
本發明的技術方案是表達重組人PDCD5的基因工程菌流加-批式高密度發酵、 工程菌破碎、目的蛋白粗提、層析分離精制。
重組人PDCD5工程菌流加-批式高密度發酵的方法為
將表達重組人PDCD5的工程菌接種于搖瓶中的LB、 2XYT、 S0B或S0C培養基， 置30-37t振搖過夜。將菌液接種于發酵罐中繼續培養。自動控制溫度于37'C，用 氨水自動流加控制pH于6.8-7.1。發酵初期通過增加通氣量、通氧量和逐漸增加轉 速維持溶氧飽和度于20%-50%。至溶氧明顯上升時開始流加氮元和碳元，氮元包括 酵母提取物、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白水解物等，碳元包括葡萄糖、蔗糖等，流加 速度參考溶氧、菌體密度OD6oo值和尾氣分析。至OD6oo達70-90時加入誘導劑IPTG ， 終濃度控制在0. 05-0. 35mmol/L。繼續流加培養3-6小時，至0D開始下降、溶氧上 升、OUR和CER下降時結束發酵，此時菌體密度0D6(X)平均達120左右。離心發酵液 收集菌體。
表達重組人PDCD5工程菌的破碎和重組人PDCD5粗提的方法為
用1:2至1:10 (體積比，如無特殊說明，以下同)的去離子水重懸離心沉淀的 菌體，用鹽酸、硫酸或磷酸調節菌液pH至1.5-5.0，優選pH 1.5-4.0，首選pH 2.0-3.0， 勻質機破碎。先在30-50Mpa壓力下預破碎菌體一次，然后在100 130Mpa壓力下 破碎2-3次。離心，10000rpm， 20 min，收集含重組人PDCD5的上清液。
或用1:2至1:10的去離子水重懸離心沉淀的菌體，勻質機破碎。先在30-50Mpa 壓力下預破碎菌體一次，然后在100-130Mpa壓力下破碎2-3次。用鹽酸、硫酸或 磷酸調節菌體破碎液pH至1.5-5.0，優選pH 1.5-4.0，首選pH 2.0-3.0，離心，10000rpm， 20 min，收集含重組人PDCD5的上清液。
將離心收集的含重組人PDCD5上清液的pH調至6.0-8.0，優選6.5-7.5，首選 6.8-7.2，進一步沉淀部分雜蛋白，上清液SDS-PAGE電泳重組人PDCD5的含量為 50-60%。
重組人PDCD5層析分離的方法為
陰離子層析介質如 Q-s印harose 、 DEAE-s印harose 、 C即toQ-s印harose 、 Toyopearl GigaCap Q-650或Toyopearl DEAE-650， 優選Q-sepharose、 DEAE-sepharose、 CaptoQ- sephaxose， 首選Q-s印harose裝填層析柱，用pH 6. 5-7- 5
5的磷酸緩沖液平衡，首選20mraol/L、 pH7.2的磷酸緩沖液。用超濾置換、稀釋等方 法將含重組人PDCD5溶液的離子強度調整為小于5 ms/cm、 pH調整為7. 2上樣，用 10±3. 5 ms/cm、 pH 7.2的緩沖液洗滌雜蛋白，再用20±5 ms/cm、 pH 7.2的磷酸 緩沖液洗脫目的蛋白，收集目的蛋白峰。在陰離子層析分離中，本發明首選 Q-s印harose FF介質和20mmol/L、 pH7. 2的磷酸緩沖液；先用10±3.5 ms/cm、 pH 7.2的緩沖液洗滌雜蛋白，再用20土5ms/cm、 pH 7. 2的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。 用超濾置換、稀釋等方法將含重組人PDCD5上清的離子強度調整為小于6 ms/cra、 pH調整為4.4-5.0。用陽離子層析介質如CM-s印harose、 SP- s印harose、 Toyopearl SP-550、 Toyopearl CM-650，優選CM-sepharose、 SP- sepharose， 首 選CM-s印harose，裝填層析柱；層析柱用pH 4. 4-5. 0， 10-50mmol/L的乙酸、檸檬 酸或磷酸緩沖液平衡，首選pH 5.0的20mmol/L乙酸緩沖液。將上述樣品上柱，用 電導ll士2ms/cm、 pH 4. 4-5. 0的緩沖液洗滌雜蛋白，再用20±3ms/cm、 pH 4. 4-5. 0
的緩沖液洗脫目的蛋白，收集目的蛋白峰。在陽離子層析分離中，本發明首選 CM-s印harose介質和pH 5.0、 20mmol/L檸檬酸緩沖液；先用電導為11 ±2ms/cm、 pH為5.0的緩沖液洗滌雜蛋白，再用20士3ms/cm、 pH5, 0的緩沖液洗脫目的蛋白。
也可采用疏水作用層析，在含重組人PDCD5的溶液中加入硫酸銨至 0.8-1.5mol/L， pH調整為7.0-7.4。用0.8-1.5mol /L硫酸銨、pH 7. 0-7. 4、 10-100咖ol/L的磷酸緩沖液平衡Phenyl-s印harose、Butyl- sepharose、 Toyopearl Butyl-650 、Toyopearl Phenyl-650柱，優選Phenyl-s印harose、Butyl- sepharose， 首選Phenyl-s印harose;緩沖液首選pH 7.2、 lmol /L硫酸銨、20mraol/L磷酸緩 沖液。上述樣品上樣，用1.0mol/L硫酸銨、pH7.2、 20mmo1/L的磷酸緩沖液洗滌 雜蛋白，用pH7.2、 20mmo1 /L的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白，收集目的蛋白峰。在 疏水作用層析中，本發明首選Phenyl-s印harose介質和pH 7. 2、 lmol /L硫酸銨、 20mmol/L磷酸緩沖液；先用1. 0mol/L硫酸銨、pH 7.2、 20rnmo1 /L的磷酸緩沖液 洗滌雜蛋白，再用PH 7.2、 20mmo1 /L的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。
與現有技術相比，本發明具有以下特點
1. 一般在中性條件下破碎基因工程菌使可溶性表達的重組蛋白釋放，含目的 蛋白的離心上清可用于后續的層析分離。但此時上清中的雜蛋白含量很高，非常不 利于后續的層析分離。本發明利用重組人PDCD5在酸性環境中比較穩定的特點，將 破碎時菌液或破碎后菌液的pH調至1.5-4.5，使部分雜蛋白沉淀；再將收集上清液的pH調至6. 5-7. 4，再次使部分雜蛋白沉淀。通過2次簡單的沉淀粗提，目的蛋白 純度從25%左右提高至約55%。
2.層析分離是重組蛋白純化精制的常用方法，離子交換和疏水作用層析是最常 選用的層析方法。我們通過粗提降低了上清中雜蛋白的含量，提高了層析介質對目 的蛋白的載量和分離效果。通過優化層析分離的條件，無論采用陰離子、陽離子或 疏水介質均能取得較高純度的PDCD5，再選用另一種層析介質進一步純化，就可達 到99%以上的純度，純化收率高于80%。本發明制備重組人PDCD5的方法可實現中 試放大。
圖h表達重組人PDCD5工程菌的生長曲線(實施例l)
橫坐標發酵時間(小時)；縱坐標600nm比色的吸光度值(OD600)
圖2:重組人PDCD5工程菌在IPTG誘導不同時間的SDS-PAGE圖(實施例1)
泳道l: PDCD5標準品
泳道2: 0. 5小時
泳道3: 1小時
泳道4: 1.5小時
泳道5: 2小時
泳道6: 2.5小時
泳道7: 3小時
泳道8: 3. 5小時
圖3:重組人PDCD5的粗提(實施例2) 泳道1:分子量marker 泳道2:重組人PDCD5標準品 泳道3:勻質破碎液 泳道4: pH 3.0時的離心上清液 泳道5: pH 3.0時的離心沉淀 泳道6: pH 7. 3時的離心上清液泳道7: PH 7. 3時的離心沉淀 圖4:重組人PDCD5的層析分離(實施例3、 4、 5) 泳道l:重組人PDCD5標準品
泳道2:陰離子-陽離子層析組合純化的重組人PDCD5 泳道3:陰離子-疏水層析組合純化的的重組人PDCD5
具體實施方式
下面通過實施例進一步說明本發明。應該解釋的是，本發明實施例的制備方法 僅僅是用于說明本發明，而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明 制備方法的簡單改進都屬于本發明要求保護的范圍。在上下文中，除非另有說明， 本發明中的百分數是重量百分數，物料用量比是體積比。
實施例1、重組人PDCD5工程菌100L生物反應器的發酵培養
將450ml種子液(OD6o。為3.3)接種于基礎培養基45L(蛋白胨720g，酵母提 取物450g， NaCl 225g， KH2PO471.04g， K2HPO4.3H2O,190.52g，加水溶解至45L, 調pH至7.0， 12rC滅菌30分鐘)發酵培養。自動控制溫度于37'C，用氨水自動流 加控制pH于7.0，每小時取樣檢測0D6(w值、葡萄糖濃度。為維持溶氧在30%-50% (相對百分數)，攪拌速度從200rpm逐漸調至600rpm，通氣量從0.8wm調至 1.2wm，最后通過調節氧氣流量維持溶氧。發酵約4小時至溶氧明顯上升時開始流 加碳元(葡萄糖12Kg，溶于20L去離子水)和氮元(蛋白胨1000g，酵母提取物1000g， 溶于12L去離子水)，發酵約12小時OD60()達75時，在罐中加入IPTG至終濃度為 3.5mmol/L，繼續培養5小時，至006()()達122后菌體密度開始下降(圖1)、溶氧 上升、OUR和CER下降，結束發酵。12000rpm離心發酵液10分鐘，收集菌體。發 酵終體積為84L,菌體濕重為17. 05kg。 SDS-PAGE電泳分析誘導不同時間的菌體蛋白 中目的蛋白含量，誘導0.5-l小時后，PDCD5即開始出現；誘導1.5-2小時后PDCD5 含量明顯增加；之后PDCD5含量緩慢增加；3.5小時終止發酵時目的蛋白約占菌體 蛋白的25% (圖2)。
實施例2、基因工程菌表達的重組人PDCD5的勻質破碎和粗提(圖3)
稱取濕菌體5Kg，以25L去離子水重懸菌體，勻質機破碎。先在50Mpa壓力 下預破菌體一次，然后在130Mpa壓力下破碎3次。此時上清液中PDCD5的含量約 占菌體蛋白的25% (泳道3)。調pH至3，攪拌20min;離心，10000rpm， 20 min，收集上清液。SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀中的蛋白組成，與泳道3比較，上清中 PDCD5純度上升，約為40%,部分雜蛋白缺失。調整pH至7.3，攪拌20min;離心 10000rpm，時間20min。得上清液23L，總蛋白濃度為2.5mg/ml，此即為重組人PDCD5 粗提物。SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀中的蛋白組成，與泳道3、 4和5比較，上 清中PDCD5純度上升至60%，更多的雜蛋白缺失。該實施例說明通過調節破碎菌液 的pH，提高了層析分離上樣液的PDCD5純度，降低了雜蛋白的含量和數量。
實施例3、重組人PDCD5的陰離子-陽離子交換層析純化
用20mmol/L、 pH 7.3的磷酸緩沖液平衡Q-sepharose FF (GE)層析柱，層析 柱規格為100X500mm。將實例2的重組人PDCD5粗提物23L上柱，先用20mmol/L、 pH7.3的磷酸緩沖液洗滌至流出液的光吸收值達水平，再用20mmol/L、 pH7.2、含 10Ommol/L的NaCl磷酸緩沖液洗滌至流出液的光吸收值達水平，最后再用 20mmol/L、 pH7.2、含200mmol/L的NaCl磷酸緩沖液洗脫目的蛋白，共收集目的 蛋白峰1.8L，總蛋白濃度為10.6mg/ml， SDS-PAGE分析其中重組人PDCD5純度為 99.6%，該步收率約為80%。
用20mmol/L、 pH 4.8的乙酸緩沖液平衡CM-s印harose FF (GE)層析柱，層析 柱規格50X200mm。將實例3收集的目的蛋白峰0.9L上柱，先用20腿ol/L、 pH 4.8 的乙酸緩沖液洗滌至流出液的光吸收值達水平，再用20mmol/L、 pH 7.2、含 10Ommol/L的NaCl的pH 4.8的乙酸緩沖液洗脫目的蛋白，共收集的目的蛋白峰 310ml，蛋白濃度為28mg/ml，SDS-PAGE分析其中重組人PDCD5純度為99.6% (圖 4)，該步收率約為90%。
實施例4、重組人PDCD5的疏水作用層析純化
在實施例3中，從Q-sepharoseFF洗脫的0.9L目的蛋白樣品中，加入硫酸銨至 終濃度為lmol/L, pH調整為7.0。用lmol/L硫酸銨、pH 7.0、 20mmol/L的磷酸緩 沖液平衡phenyl-sepharose柱(50X200腿)，上述樣品上樣。用lmol/L硫酸銨、 pH 7.0、 20mmol/L的磷酸緩沖液洗滌雜蛋白，用pH 7.0、 20mmol/L的磷酸緩沖液 洗脫目的蛋白，共收集目的蛋白峰330ml，蛋白濃度為27mg/ml,SDS-PAGE分析重 組人PDCD5純度為99.1% (圖4)，該步收率約為90%。
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權利要求
1、一種制備重組人PDCD5的方法，該方法包括表達重組人PDCD5工程菌的高密度發酵、菌體破碎、重組人PDCD5粗提和層析分離，其特征在于
(1)通過調節破碎前菌液的pH或菌體破碎液的pH，使雜蛋白沉淀；和
(2)通過層析分離組合
以簡化重組人PDCD5的純化工藝和提高重組人PDCD5的純度。
2、 根據權利要求
l的方法，其特征在于在菌體破碎前，調節菌液pH至1.5-5.0，優 選pH 1.5-4.0，首選pH2.0-3.0，沉淀部分雜蛋白。
3、 根據權利要求
1的方法，其特征在于在菌體破碎后，調節破碎液的pH至1.5-5.0， 優選pH 1.5-4.0，首選pH2.0-3.0，沉淀破碎液中的部分雜蛋白。
4、 根據權利要求
1-3之一的方法，其特征在于將調為酸性的離心上清液的pH調至 6.0-8.0，優選6.5-7.5，首選6.8-7.2，進一步沉淀部分雜蛋白。
5、 根據權利要求
1-4之一的方法，其特征在于在層析分離時選用陰離子-陽離子交 換層析、陰離子交換-疏水作用層析、陽離子-陰離子交換層析、陽離子交換-疏水作 用層析、疏水作用-陰離子交換或疏水作用-陽離子交換層析中的任意組合，優選陰 離子-陽離子交換層析、陰離子交換-疏水作用層析，首選陰離子-陽離子交換層析。
6、 根據權利要求
1-6之一的方法，其特征在于陰離子交換層析介質選用 Q-sepharose、 DEAE- s印haxose、 C即toQ- s印harose、 Toyopearl GigaC鄰Q-650 或Toyopearl DEAE-650，優選Q-sepharose、DEAE- s印harose、C即toQ- sepharose、， 首選Q-sephaxose; 陽離子交換層析介質選用CM-s印harose、 SP- sephaxose、 Toyopearl SP-550、 Toyopearl CM-650，優選CM-sepharose、 SP- s印harose， 首 選CM-s印harose; 疏TR作用層析介質選用Phenyl-sepharose、 Butyl- s印harose、 Toyopearl Butyl-650 、 Toyopearl Phenyl-650， 優選Phenyl-sepharose、 Butyi-sepharose， 首選Phenyl-s印harose。
7、 根據權利要求
1-7之一的方法，其特征在于在使用陰離子交換層析時使用 Q-s印harose介質和20mmol/L、 pH7.2的磷酸緩沖液，用10±3.5ms/cm、 pH 7.2的 緩沖液洗滌雜蛋白，再用20士5ms/cm、 pH 7.2的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。
8、 根據權利要求
1-7之一的方法，其特征在于在使用陽離子交換層析時使用CM-sepharose介質和pH 5.0、 20mmol/L擰檬酸緩沖液，先用電導11 ±2ms/cm、 pH 5.0的緩沖液洗滌雜蛋白，再用20土3ms/cm、 pH5.0的緩沖液洗脫目的蛋白。
9、根據權利要求
1-7之一的方法，其特征在于在使用疏水層析時使用 Phenyl-sepharose介質和pH 7.2、 lmol /L硫酸銨、20mmol/L磷酸緩沖液，用1.0mol/L 硫酸銨、pH7.2、 20mmol/L的磷酸緩沖液洗滌雜蛋白，用pH7.2、 20mmol/L的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。
專利摘要
本發明公開了一種制備具有促進細胞凋亡活性的重組人PDCD5(ProgrammedCell Death 5)的方法。本方法包括重組人PDCD5基因工程菌發酵、工程菌破碎、目的蛋白粗提和層析分離。本發明通過調節pH沉淀部分雜蛋白進行粗提，再選用層析組合分離精制，與以往報道的方法相比，不僅簡化了重組人PDCD5的純化工藝，提高了產品純度，而且可中試放大生產。
文檔編號C12P21/02GKCN101643763SQ200910169934
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月10日
發明者唐治華, 杰 張, 炎 張, 英 張, 白敏姿 申請人:北京天廣實生物技術股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan