一種提高光滑球擬酵母抵御高滲透壓脅迫的方法

專利名稱:一種提高光滑球擬酵母抵御高滲透壓脅迫的方法
技術領域：
一種提高光滑球擬酵母(7^"/0戸& g/Wrato)抵御高滲透壓脅迫的方法，屬于代謝控制策略優化發酵過程技術領域：
。本發明涉及一種在r g/Wrato內過量表達來源于L /ac^中編碼形成水的NADH氧化酶wox基因。提高了與水形成途徑相關的酶活，使胞內的水含量升高，保護細胞在高滲條件下的生長和功能。
背景技術：
NADH氧化酶直接將NADH氧化成NAD+并將02還原成H20。研究結果表明這個酶的表達會導致NADH/NAD+的比例急劇下降，并顯著的提高細胞對抗氧脅迫的能力。另外，NADH可以將02直接還原成水，不需要經過電子傳遞鏈，提高了形成水的效率，增加了胞內水含量，增強了細胞在高滲條件下的生長和功能。
發明內容
本發明的目的是提供一種通過在光滑球擬酵母r g/"6mto表達形成水的NADH氧化酶，顯著降低了 NADH/NAD+的比例，提高了與水形成途徑相關的酶活，使胞內水含量升高。在高滲條件下(3824mOsmobkg—i)r.g/a6ratoPD/wxE的菌體生長明顯提高。
本發明的技術方案 一種提高光滑球擬酵母抵御高滲透壓脅迫的方法，利
用多重維生素營養缺陷型的丙酮酸工業生產菌株光滑球擬酵母(7:
g/Wrato)CCTCC M202019為模式菌株，采用將來源于乳酸乳球菌(Z^ctococcws/acto)中編碼形成水的NADH氧化酶"ox基因過量表達于CCTCC M202019中，獲得了一株NADH氧化酶活性為34.8 l>mg" protein的重組菌7: g/WratoPDwojcE，在7: g/Wrato中表達"ox基因，顯著降低了 NADH/NAD+的比例，提高了與水形成途徑相關的酶活，使胞內的含水量升高，在3824mOsmoHcg"高滲條件下r. g/"6ratoPD"o^E的菌體生長明顯提高，表明通過控制水的生成途徑提高酵母細胞滲透適應性，通過過量表達NADH氧化酶，保護光滑球擬酵母(rora/o戸^y g/a6rato)抵御高滲透壓脅迫。1、菌株
原菌(模式菌株)光滑球擬酵母(7:g/a6rato)CCTCCM202019，煙酸(NA)、生物素(Bio)、硫胺素(Bi)、吡哆醇(Pdx)四種維生素營養缺陷型，且丙酮酸脫羧酶活性組成型降低，為江南大學選育菌株，該菌種已申請中國專利，申請號為02113142.2，公開號為CN1392246A。工程菌在光滑球擬酵母(7:g/Wrato) CCTCCM 202019細胞內過量表達
來源于乳酸乳球菌(丄a"ococc^ /ac&)中編碼形成水的NADH氧化酶"ox基因，構建工程菌r g/a6rato PD"ojcE。
2、 培養基
種子和斜面培養基(g'L"):葡萄糖30，蛋白胨10， KH2P04 1， MgS04'7H200.5;瓊脂20 (斜面培養基)，pH5.5。
基本發酵培養基(L):葡萄糖100g， NH4S04 7g， MgS04'7H20 0.8g， KH2P045g， CH3COONa5g， pH5.0。
3、 搖瓶培養
將3CTC、 200rpm下培養24h的種子以10%的接種量分別轉入基本發酵培養基，于3(TC、 200rpm條件下培養48h，按實驗要求添加不同濃度的煙酸、維生素B!、維生素Bs、生物素Bio。
細胞千重的測定取一定量的菌懸液置于10 mL容量瓶中，加2 mL鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，加入去離子水定容至10 mL，搖勻，用UV 7500型可見分光光度計，于660nm處比色測OD值，用細胞干重標準曲線算得細胞干重。
本發明的有益效果原菌和工程菌在滲透壓升高到2947 mOsmol'kg"時菌體量都有明顯下降。然而，在高滲條件下，工程菌r.g/"6ratoPDwoxE在發酵終點的菌體量高于原菌，分別提高17.5°/。 (2018 mOsmol'kg'1) ， 33.2% (2947mOsmol'kg")和71.80/0 (3824 mOsmol.kg")。
具體實施方式
實施例1:
在光滑球擬酵母？: 細胞內過量表達來源于乳酸乳球菌中編碼形成水的NADH氧化酶m x基因，構建工程菌T g/a6rato PDmojcE。發酵48 h，在滲透壓分別為2018 mOsmol'kg"， 2947 mOsmol'kg_1和3824 mOsmol'kg-1的條件下，最終菌體濃度分別為7.2 g丄'1， 5.8 g丄'1， 2.3 g丄—1，相比對照分別提高18.0 % (2018mOsmol.kg")， 34.9 % (2947 mOsmol.kg")和76.9 % (3824 mOsmol'kg-1)。
對照實施例
本發明所用的菌種光滑球擬酵母73 g/^)rato，先轉斜面在3(TC培養箱中培養12h，然后挑取單菌落用種子培養基培養24h，最后搖瓶發酵48h，溫度30°C，轉速200rpm。滲透壓分別為2018 mOsmol'kg"， 2947 mOsmol'kg"和3824mOsmol'kg-1，最終菌體濃度分別是6.1 g丄"(2018 mOsmol'kg-1), 4.3 g丄"(2947mOsmol.kg")和1.3 g七-1 (3824 mOsmol'kg-1^
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權利要求
1、一種提高光滑球擬酵母抵御高滲透壓脅迫的方法，其特征是利用多重維生素營養缺陷型的丙酮酸工業生產菌株光滑球擬酵母(T.glabrata)CCTCCM202019為模式菌株，采用將來源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中編碼形成水的NADH氧化酶nox基因過量表達于CCTCC M202019中，獲得了一株NADH氧化酶活性為34.8U·mg-1 protein的重組菌T.glabrata PDnoxE，在T.glabrata中表達nox基因，顯著降低了NADH/NAD+的比例，提高了與水形成途徑相關的酶活，使胞內的含水量升高，在3824mOsmol·kg-1高滲條件下T.glabrata PDnoxE的菌體生長明顯提高，表明通過控制水的生成途徑提高酵母細胞滲透適應性，通過過量表達NADH氧化酶，保護光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)抵御高滲透壓脅迫。
專利摘要
一種提高光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)抵御高滲透壓脅迫的方法，屬于代謝控制策略優化發酵過程技術領域：
。本發明采用將來源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中編碼形成水的NADH氧化酶nox基因過量表達于丙酮酸工業生產菌株T.glabrata中，獲得了一株NADH氧化酶活性為34.8U·mg^-1 protein的重組菌T.glabrata PDnoxE。在T.glabrata中表達nox基因，顯著降低了NADH/NAD⁺的比例，提高了與水形成途徑相關的酶活，使胞內的含水量升高。在高滲條件下(3824mOsmol·kg^-1)T.glabrata PDnoxE的菌體生長明顯提高。結果表明可以通過控制水的生成途徑提高酵母細胞滲透適應性。
文檔編號C12N1/19GKCN101591670SQ200910027522
公開日2009年12月2日 申請日期2009年5月11日
發明者劉立明, 堵國成, 沙 徐, 堅 陳 申請人:江南大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan