專利名稱:一種固定化微生物的制備方法
一種固定化微生物的制備方法技術領域：
本發明屬于生物固定化技術領域：
，特別涉及一種微生物的固定化方法。
技術背景生物催化劑(如酶、微生物、動植物細胞、細胞器等)通過物理或化學方法固定化后，其 催化性能得以改善，使用效率大大提高。現在固化生物催化劑的應用研究，已涉及食品與發 酵工業、化學合成工業、環境污染治理與檢測等各個領域中。生物固定化技術是現代生物工程領域中的一項新興技術，應用范圍涉及到生物學、有機化 學、化學分析、醫療診斷、環境凈化及能源生產等多個領域。其固定化的方法和條件對固定 化細胞的性能有重要影響，決定了固定化細胞的強度、活性和重復使用性。目前固定化細胞 的方法主要有吸附法、包埋法和交聯法，其中最常用的是包埋法。包埋法是將細胞包埋在 半透性的聚合物或膜內，使細胞擴散進入多孔性的載體內部。其特點是操作簡單，能保持多 酶系統，對細胞的活性影響小。目前常用的包埋材料有瓊脂、海藻酸鈉、聚乙烯醇、聚丙 烯酰胺等，其中，海藻酸鈉固定化的細胞制備過程簡便，傳質性能較好，但強度較低；聚乙 烯醇是對環境無污染和對細胞無毒性的優良的人工合成高分子材料，成本低廉、形成載體具 有強韌的機械性能等優勢。因此，海藻酸鈉和聚乙烯醇是研究較多的材料，備受關注。現有用聚乙烯醇和海藻酸鈉固化細胞的方法，通常是與硼酸驚醒固化反應，如公開號為CN1696285A的"聚乙烯醇鉛鹽固定化酶/微生物的方法"專利，公開的是與飽和硼進行固化反應，但是硼酸對細胞的毒性較大，且制備過程中有較嚴重的粘連情況，不利于推廣應用。
發明內容
本發明的目的在于針對現有用聚乙烯醇和海藻酸鈉固化細胞方法的不足之處，提供一種 固定化微生物的制備方法，具有能制備出活性高、機械性能和穩定性好的固定化微生物，無毒性，并解決制備過程中的粘連問題。微生物細胞被固定化后，對溫度和pH值的穩定性高等 特點。實現本發明的目的技術方案是 一種固定化微生物的制備方法，用聚乙烯醇和海藻酸鈉為包埋材料，用硫酸鈉代替傳統方法中的硼酸，并通過氯化鈣和硫酸鈉分兩步進行固化反應， 具體方法步驟如下-(1)制備微生物混合液按1 1.5%的海藻酸鈉溶液:9 12%的聚乙烯醇溶液的質量比為1:6 12的比例，在容器 中，將1 1.5%的海藻酸鈉溶液和9 12%的聚乙烯醇溶液混合并攪拌均勻，制備出載體材料 溶液。然后將被固化的微生物加入載體材料溶液中，制備出微生物混合溶液。微生物:載體材 料的質量比為1:4 6。(2) 進行微生物球的第一步固化第(1)步完成后，先在質量濃度為1 5%的氯化鈣溶液中，用氫氧化鈉溶液調節pH值 為6.5 6.7，然后將第(1)步制備出的微生物混合液，滴加入調節pH值后的氯化鈣溶液中， 進行微生物球的第一步固化反應，固化反應時間為0. 5 1小時。(3) 進行微生物球的第二步固化第(2)步完成后，取出第一步固化后的微生物球，先用蒸餾水洗滌1 3次，再放入飽 和硫酸鈉溶液中，進行第二步固化反應，固化反應時間為2 4小時。(4) 洗滌第(3)步完成后，取出第二步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌1 3次，備用。本發明的工作原理是用聚乙烯醇和海藻酸鈉為包埋材料，用硫酸鈉代替傳統方法中的 硼酸，并通過氯化鈣和硫酸鈉分兩步進行固化反應。本發明能夠很好的解決聚乙烯醇反應過 程中的粘連問題，制備出的固定化微生物細胞具有較高的機械強度和活性，是一種適用于廢 水生物處理、生物制藥、食品發酵和釀造工業等涉及到固定化微生物技術的領域，能進行長 期穩定運行和高負荷連續運行的新型固定化微生物技術。 '采用上述技術方案后，本發明主要優點是采用本發明方法固定化微生物在制備過程中基本無粘連，反應試劑和反應條件對細胞活 性的影響較小，無毒性，操作簡便，制得的固定化微生物強度較高，穩定性好，可用于連續 運行。發明方法可廣泛應用于廢水生物處理、生物制藥、食品發酵和釀造工業等領域中，具 有良好的應用前景和實用價值。具體實施方案下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明。實施例1一種固定化微生物的制備方法的具體方法步驟如下(1) 制備微生物混合液按1. 1%的海藻酸鈉溶液11%的聚乙烯醇溶液的質量比為1:10的比例，在容器中，將1.1% 的海藻酸鈉溶液和11%的聚乙烯醇溶液混合并攪拌均勻，制備出載體材料溶液。然后將被固 化的微生物加入載體材料溶液中，制備出微生物混合溶液。微生物:載體材料的質量比為1:5。(2) 進行微生物球的第一步固化 第(1)步完成后，先在質量濃度為4%的氯化鈣溶液中，用氫氧化鈉溶液調節pH值為 6.6，然后將第(1)步制備出的微生物混合液，滴加入調節pH值后的氯化鈣溶液中，進行微 生物球的第一步固化反應，固化反應時間為0.5小時。(3) 進行微生物球的第二步固化第(2)步完成后，用網撈出第一步固化后的微生物球，先用蒸餾水洗滌3次，再放入飽
和硫酸鈉溶液中，進行第二步固化反應，固化反應時間為3小時。 (4)洗滌第(3)步完成后，用網撈出第二步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌2次，備用。 實施例2一種固定化微生物的制備方法的具體方法步驟如下(1) 制備微生物混合液按1. 5%的海藻酸鈉溶液:9%的聚乙烯醇溶液的質量比為1:6的比例，在容器中，將1. 5% 的海藻酸鈉溶液和9%的聚乙烯醇溶液混合并攪拌均勻，制備出載體材料溶液。然后將被固化 的微生物加入載體材料溶液中，制備出微生物混合溶液。微生物:載體材料的質量比為1:4。(2) 進行微生物球的第一步固化第(1)步完成后，先在質量濃度為1%的氯化鈣溶液中，用氫氧化鈉溶液調節pH值為 6.7，然后將第(1)步制備出的微生物混合液，滴加入調節pH值后的氯化鈣溶液中，進行微 生物球的第一步固化反應，固化反應時間為0.8小時。(3) 進行微生物球的第二步固化第(2)步完成后，用網撈出第一步固化后的微生物球，先用蒸餾水洗滌l次，再放入飽 和硫酸鈉溶液中，進行第二步固化反應，固化反應時間為2小時。(4) 洗滌第(3)步完成后，用網撈出第二步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌l次，備用。 實施例3一種固定化微生物的制備方法的具體方法步驟如下(1) 制備微生物混合液按1%的海藻酸鈉溶液:12%的聚乙烯醇溶液的質量比為1:12的比例，在一般容器中，將1~ 1%的海藻酸鈉溶液和12%的聚乙烯醇溶液混合并攪拌均勻，制備出載體材料溶液。然后將被 固化的微生物加入載體材料溶液中，制備出微生物混合溶液。微生物:載體材料的質量比為 1:6。(2) 進行微生物球的第一步固化第(1)步完成后，先在質量濃度為5%的氯化鈣溶液中，用氫氧化鈉溶液調節pH值為 6.5，然后將第(1)步制備出的微生物混合液，滴加入調節pH值后的氯化鈣溶液中，進行微 生物球的第一步固化反應，固化反應時間為l小時。 .(3) 進行微生物球的第二步固化第(2)步完成后，用網撈出第一步固化后的微生物球，先用蒸餾水洗滌2次，再放入飽 和硫酸鈉溶液中，進行第二步固化反應，固化反應時間為4小時。(4) 洗滌
第(3)步完成后，用網撈出第二步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌3次，備用。 實驗結果應用實施例1所述方法步驟做實驗，即所選用的實驗條件為PVA濃度11免，海藻酸鈉濃度1%,微生物與載體材料的質量比為1:5， CaCV濃度4免，第一步與CaCl2的反應時間為 30min，第二步與Na2SCU的反應時間為3h。在此制備固定化微球的過程中，微球基本無粘連。這樣制備的微球，其彈性系數為 65.3N/m，強度較高；連續運行5次(15天)，破碎率在8%以下，穩定性較好。脫水后，該 微球的比表面積為1628. 7893mVg，即8. 4697mV顆,孔容為3. 562929cm2/g，即18.5272X l(TcmV顆，平均孔徑為32.4800A; 40分鐘即可完全滲透。從以上試驗結果來看，應用該法 制備的固定化微球具有良好的彈性和滲透性，較高的比表面積和孔容，其內部的孔隙結構有 利于反應底物和營養物質的傳遞。并且，在制備固定化微球的過程中，微球基本無粘連。
權利要求
1.一種固定化微生物的制備方法，其特征在于具體的方法步驟如下
(1)制備微生物混合液
按1～1.5％的海藻酸鈉溶液∶9～12％的聚乙烯醇溶液的質量比為1∶6～12的比例，在容器中，將1～1.5％的海藻酸鈉溶液和9～12％的聚乙烯醇溶液混合并攪拌均勻，即為載體材料溶液，然后將被固化的微生物加入載體材料溶液中，微生物∶載體材料的質量比為1∶4～6；
(2)進行微生物球的第一步固化
第(1)步完成后，先在質量濃度為1～5％的氯化鈣溶液中，用氫氧化鈉溶液調節pH值為6.5～6.7，然后將第(1)步制備出的微生物混合液，滴加入調節pH值后的氯化鈣溶液中，進行微生物球的第一步固化反應，固化反應時間為0.5～1小時；
(3)進行微生物球的第二步固化
第(2)步完成后，取出第一步固化后的微生物球，先用蒸餾水洗滌1～3次，再放入飽和硫酸鈉溶液中，進行第二步固化反應，固化反應時間為2～4小時；
(4)洗滌
第(3)步完成后，取出第二步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌1～3次。
2. 按照權利要求
l所述的一種固定化微生物的制備方法，其特征在于一種固定化微生物的制 備方法的具體方法步驟如下-(1) 制備微生物混合液按1. 1%的海藻酸鈉溶液11%的聚乙烯醇溶液的質量比為1:10的比例，在容器中，將1. 1% 的海藻酸鈉溶液和11%的聚乙烯醇溶液混合并攪拌均勻，即為載體材料溶液，然后將被固化 的微生物加入載體材料溶液中，微生物:載體材料的質量比為1:5;(2) 進行微生物球的第一步固化第(1)步完成后，先在質量濃度為4%的氯化鈣溶液中，用氫氧化鈉溶液調節pH值為 6.6，然后將第(1)步制備出的微生物混合液，滴加入調節pH值后的氯化鈣溶液中，進行微 生物球的第一步固化反應，固化反應時間為0.5小時；(3) 進行微生物球的第二步固化第(2).步完成后，用網撈出第一步固化后的微生物球，先用蒸餾水洗滌3次，再放入飽 和硫酸鈉溶液中，進行第二步固化反應，固化反應時間為3小時； (.，)洗滌第(3)步完成后，用網撈出第二步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌2次。
3. 按照權利要求
l所述的一種固定化微生物的制備方法，其特征在于一種固定化微生物的制備方法的具體方法步驟如下(1) 制備微生物混合液按1.5%的海藻酸鈉溶液:9%的聚乙烯醇溶液的質量比為l:6的比例，在容器中，將1. 5% 的海藻酸鈉溶液和9%的聚乙烯醇溶液混合并攪拌均勻，即為載體材料溶液，然后將被固化的 微生物加入載體材料溶液中，微生物:載體材料的質量比為1:4;(2) 進行微生物球的第一步固化第(1)步完成后，先在質量濃度為1%的氯化鈣溶液中，用氫氧化鈉溶液調節pH值為 6.7,然后將第(1)步制備出的微生物混合液，滴加入調節pH值后的氯化鈣溶液中，進行微 生物球的第一步固化反應，固化反應時間為0.8小時；(3) 進行微生物球的第二步固化第(2)步完成后，用網撈出第一步固化后的微生物球，先用蒸餾水洗滌l次，再放入飽 和硫酸鈉溶液中，進行第二步固化反應，固化反應時間為2小時；(4) 洗滌第(3)步完成后，用網撈出第二步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌l次。
4.按照權利要求
l所述的一種固定化微生物的制備方法，其特征在于一種固定化微生物的制 備方法的具體方法步驟如下(1) 制備微生物混合液按1%的海藻酸鈉溶液12%的聚乙烯醇溶液的質量比為1:12的比例，在容器中，將1 1% 的海藻酸鈉溶液和12%的聚乙烯醇溶液混合并攪拌均勻，即為載體材料溶液，然后將被固化 的微生物加入載體材料溶液中，微生物:載體材料的質量比為1:6;(2) 進行微生物球的第一步固化第(1)步完成后，先在質量濃度為5%的氯化鈣溶液中，用氫氧化鈉溶液調節pH值為 6.5,然后將第(1)步制備出的微生物混合液，滴加入調節pH值后的氯化鈣溶液中，進行微 生物球的第一步固化反應，固化反應時間為1小時；(3) 進行微生物球的第二步固化第(2)步完成后，用網撈出第一步固化后的微生物球，先用蒸餾水洗滌2次，再放入飽 和硫酸鈉溶液中，進行第二步固化反應，固化反應時間為4小時；(4) 洗滌第(3)步完成后，用網撈出第二步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌3次。
專利摘要
一種固定化微生物的制備方法，涉及微生物的固定化方法。本發明用聚乙烯醇和海藻酸鈉為包埋材料，用硫酸鈉代替傳統方法中的硼酸，并通過氯化鈣和硫酸鈉分兩步進行固化反應。采用本發明方法固定化微生物在制備過程中基本無粘連，反應試劑和反應條件對細胞活性的影響較小，無毒性，操作簡便，制得的固定化微生物強度高，穩定性好，可用于連續運行。因此本發明方法可廣泛應用于廢水生物處理、生物制藥、食品發酵和釀造工業等領域中，具有良好的應用前景和實用價值。
文檔編號C12N11/04GKCN101165177SQ200710092752
公開日2008年4月23日 申請日期2007年9月26日
發明者侯長軍, 楊麗敏, 力 秦, 霍丹群 申請人:重慶大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan