專利名稱:綠僵菌發酵提純苦馬豆素的工藝的制作方法
綠僵菌發酵提純苦馬豆素的工藝技術領域：
[0001]本發明屬于生物工程領域，具體涉及微生物學、生物發酵，天然產物提取、分離和 鑒定方法，特別涉及一種綠僵菌發酵提純苦馬豆素的工藝。
背景技術：
[0002]苦馬豆素的來源有三種途徑(1)從植物中提取分離苦馬豆素目前已知含苦 馬豆素的植物有①豆科苦馬豆屬植物，如苦馬豆、灰苦馬豆(Swainsonacanescens)，該屬 植物在澳大利亞和我國均有分布灰苦馬豆，是首先分離出苦馬豆素的植物；②豆科黃芪 屬(Astragalas)和棘豆屬(Oxytropis)植物，這類植物是國內外研究較多的植物，分布 于世界各地，尤其是北美和我國，資源十分豐富。據不完全統計，這類植物在我國有44 種，其中黃芪屬21種，棘豆屬23種；③錦葵科黃花稔屬(Sida)，如鵝耳櫪黃花稔(Sida carpinifolia)，熱帶美洲和非洲可能是其發源地，在巴西的南部和東南部也發現有大量的 鵝耳櫪黃花稔；④旋花科番薯屬，Haraguchi M等^00 從Ipomea carnea的葉子、花和種 子中分離出苦馬豆素，新鮮葉子和花中的含量分別為0. 00 %和0. 00 %,種子中的含量 大約為葉子和花中含量的10倍。這類植物主要分布于澳大利亞。植物中的苦馬豆素相當 穩定，據Molyneux等(1991)]報道，保存15年的斑莢黃芪仍含有苦馬豆素。[0003](2)從真菌菌絲體及其培養液中提取分離苦馬豆素=Schneider B等(1984)從美 國標準庫保存的豆類絲核菌(Miizoctonia Legaminicola)中分離出苦馬豆素。Sim K L等 (1997)報道綠僵菌(Metarrhizium anisopliae)中也含有苦馬豆素，如果降低綠僵菌培 養液的PH值，可使苦馬豆素的濃度增加。Braim K等Q003)從中毒瘋草密柔毛黃芪，蘭伯 氏棘豆，絹毛棘豆的8個類群的葉、莖、種子和花中分離出內生植物真菌。所有培養的內生 植物都產生導致瘋草病的生物堿-苦馬豆素。感染內生植物的瘋草類群也產生苦馬豆素， 而且體外培養的內生植物的苦馬豆素水平與宿主植物類群的苦馬豆素水平高度相關。[0004](3)人工合成苦馬豆素[0005]鑒于苦馬豆素及其相關化合物在生物化學、免疫學、醫學和毒理學等方面的眾多 用途，美國的化學家^suda(1984)、Bennett(1989)和我國科學院院士周維善先后對苦馬 豆素人工合成進行了研究。由于苦馬豆素有4個手性碳原子，即使很好地控制反應，但是合 成的產物中還有16個化學結構相同，而立體構象不同的異構體，要使之分離卻十分困難， 整個合成過程有21步，產率僅為6. 6%。[0006]苦馬豆素的抗腫瘤活性、免疫增強作用及其抗輻射作用是十分明顯的，不容質疑。 然而制約苦馬豆素作為抗腫瘤藥物研發，產品產業化，最終走向臨床用藥的關鍵是苦馬豆 素純品的來源十分匱乏，遠遠不能滿足人們研究的需要。植物中苦馬豆素含量本身很低，僅 為0. 02%左右，且植物資源受自然因素的影響較大，使得苦馬豆素的生產量十分匱乏。化學 合成由于受合成路線及分離技術的限制使得苦馬豆素的來源也十分有限，這些都嚴重的制 約著苦馬豆素抗腫瘤活性研究及其產品開發。從真菌菌絲體及其培養液中提取分離苦馬豆 素，中國專利公開號CN1396^53，
公開日2003年2月12日，發明創造的名稱為生物發酵提純苦馬豆素的工藝，其所采用的微生物菌株是自行從自然界豆科植物中分離、篩選的可產生 苦馬豆素的豆類絲核菌7-3菌株(代號)，但沒有公開豆類絲核菌7-3菌株的具體獲得方法 和途徑，也沒有公開該豆類絲核菌7-3菌株的具體特性、標準、以及品質鑒定方法，同領域 的普通技術人員無法按說明書的內容重復實現；另外，采用生物發酵提取苦馬豆素，不僅是 菌絲體中含有苦馬豆素，培養液中也含有大量的苦馬豆素，而該發明的工藝只涉及菌絲體 中苦馬豆素的提取，確丟掉了培養液中苦馬豆素的提取，使提取苦馬豆素的效率降低。
發明內容
[0007]針對上述現有技術中存在的缺陷和不足，本發明的目的在于，提供一種綠僵菌發 酵提純苦馬豆素的工藝，該工藝使苦馬豆素原材料來源更為便利，有利于工廠化批量生產， 使生產成本大幅度降低，最終為促進苦馬豆素在抗腫瘤藥物及免疫增強劑等方面的產業化 提供物質保障。[0008]實現上述本發明目的的技術方案是一種綠僵菌發酵提純苦馬豆素的工藝，該工 藝是將從中國農業科學院微生物菌種保存中心保存的標準菌株一綠僵菌(Metarrhizium anisopliae CCTCC No. M93049D)通過生物發酵，使提取所得到的原材料(菌絲體和培養 液)中苦馬豆素得以富集，再經過DlOl大孔樹脂和硅膠柱層析、梯度分段升華等技術獲得苦馬豆素純品。[0009]本發明的生物發酵法提純苦馬豆素工藝，具體包括下列步驟[0010]1)綠僵菌菌株的保存與傳代將綠僵菌接種于高氏合成一號培養基(Gause’ s synthetic Nol)，培養4 6天，待菌種充分生長發育后，置-20°C低溫冰箱保存，每1 2 個月傳代一次。[0011]所述的高氏合成一號培養基的配方組成為硝酸鉀lg，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵 0. Olg,磷酸氫二鉀0. 5g，氯化鈉0. 5g，可溶性淀粉20g,瓊脂20g,水IOOOml ；[0012]2)綠僵菌接種、發酵培養及菌絲體和培養液收集在無菌狀態下，將綠僵菌接種 于生物發酵用改良克氏合成I號培養基，20°C 25°C通氣發酵培養10 14天。收集菌絲 體和培養液，干燥，備用；[0013]所述改良克氏合成I號培養基的配方組成為可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸鉀 2g，磷酸氫二鉀2g，氯化鈉2g，硫酸鎂0. 05g,碳酸鈣0. 02g,硫酸亞鐵0. Olg,酪蛋白0. 3g， DL-賴氨酸 0. lg,7jC 1000ml ；[0014]3)菌絲體中苦馬豆素的提取[0015]①菌絲體總浸膏提取稱取菌絲體，置超聲循環提取機，加6 10倍量(重量體積 比)的乙醇，20KHz超聲波室溫處理4次，每次0. 5 1小時，收集乙醇提取液并分離殘留 物，收集的提取液減壓回收溶劑，得到菌絲體總浸膏；[0016]②苦馬豆素粗品提取；上述得到的菌絲體總浸膏，先用3倍量(重量體積 比)ImoL/L鹽酸溶解浸膏，濾去不溶物，得到酸水液。將酸水液用濃氨水調pH至9 10，然 后用飽和正丁醇反復萃取4 6次，減壓回收溶劑得到苦馬豆素粗品。[0017]③苦馬豆素純品提取稱取苦馬豆素粗品，按1 1的比例(重量比)拌等量柱層 析用硅膠，揮干研成細粉末，硅膠柱層析分離，乙酸乙酯一乙醇(1 4，體積比)洗脫，采用 薄層色譜技術監測合并含苦馬豆素部分，最后經90 95°C油浴減壓梯度升華得到苦馬豆素純品。[0018]4)發酵液中苦馬豆素的提取發酵液經脫水、濃縮、脫糖、脫蛋白、超聲波裂解細 胞等前處理得到的濃縮水溶液，通過DlOl大孔樹脂收集蒸餾水洗脫部分，濃縮得到苦馬豆 素粗品，然后經硅膠柱層析和減壓梯度升華得到苦馬豆素純品。[0019]所述的薄層色譜監測技術是硅膠GF2M薄層板點樣，氯仿甲醇氨水水 (70 26 2 2，體積比)或乙醇乙酸乙酯O 1，4 1，體積比)上行法展開，[0020]以下通過表1來說明本發明與現有技術相比的優點[0021]表1綠僵菌生物發酵提取苦馬豆素工藝與現有技術對比性試驗[0022]
權利要求
1. 一種綠僵菌發酵提純苦馬豆素的工藝，其特征在于，包括下列步驟1)綠僵菌菌株的保存與傳代將綠僵菌接種于高氏合成一號培養基，培養4 6天，待 菌種充分生長發育后，置-20°C低溫冰箱保存，每1 2個月傳代一次；所述的高氏合成一號培養基的配方組成為硝酸鉀lg，硫酸鎂0. 5g，硫酸亞鐵0. Olg，磷 酸氫二鉀0. 5g，氯化鈉0. 5g，可溶性淀粉20g,瓊脂20g,水IOOOml ；2)綠僵菌接種、發酵培養及菌絲體和培養液收集在無菌狀態下，將綠僵菌接種于生 物發酵用改良克氏合成I號培養基，20°C 25°C通氣發酵培養10 14天，收集菌絲體和培 養液，干燥，備用；所述改良克氏合成I號培養基的配方組成為可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸鉀2g，磷 酸氫二鉀2g，氯化鈉2g，硫酸鎂0. 05g，碳酸鈣0. 02g，硫酸亞鐵0. Olg，酪蛋白0. 3g，DL_賴 氨酸 0. lg,7jC 1000ml ；3)菌絲體中苦馬豆素的提取①菌絲體總浸膏提取稱取菌絲體，置超聲循環提取機，加6 10倍量的工業酒精， 20KHz超聲波室溫處理4次，每次0. 5 1小時，收集乙醇提取液并分離殘留物，收集的提取 液減壓回收溶劑，得到菌絲體總浸膏；②苦馬豆素粗品提取；上述得到的菌絲體總浸膏，先用3倍量ImoL/L鹽酸溶解浸膏，濾 去不溶物，得到酸水液，將酸水液用濃氨水調pH至9 10，然后用飽和正丁醇反復萃取4 6次，減壓回收溶劑得到苦馬豆素粗品；③苦馬豆素純品提取稱取苦馬豆素粗品，按1 1的比例(重量比)拌等量柱層析用 硅膠，揮干研成細粉末，硅膠柱層析分離，乙酸乙酯乙醇1 4，(體積比)洗脫，采用薄層 色譜技術監測合并含苦馬豆素部分，最后經90 95°C油浴減壓梯度升華得到苦馬豆素純Pm ；4)發酵液中苦馬豆素的提取發酵液經脫水、濃縮、脫糖、脫蛋白、超聲波裂解細胞等 前處理得到的濃縮水溶液，通過DlOl大孔樹脂收集蒸餾水洗脫部分，濃縮得到苦馬豆素粗 品，然后經硅膠柱層析和減壓梯度升華得到苦馬豆素純品；所述的薄層色譜監測技術是硅膠GF2M薄層板點樣，氯仿甲醇氨水水 70 26 2 2，(體積比)或乙醇乙酸乙酯2 1或4 1，(體積比)上行法展開， 雙氧水/10%醋酐/Hirlich，s試劑噴霧顯色。
專利摘要
本發明公開了一種綠僵菌發酵提純苦馬豆素的工藝，從中國農業科學院微生物菌種保存中心購買的標準綠僵菌(Metarrhizium anisopliae)菌株，通過生物發酵工程培養，獲得含苦馬豆素較高的菌絲體和發酵液，采用超聲提取、溶劑萃取、薄層色譜、D101樹脂、硅膠柱層析及梯度升華等技術，從菌絲體和發酵液中分離提純出苦馬豆素純品。該工藝制備的苦馬豆素呈白色針狀結晶，分子量為173，熔點144～145℃，純度≥98％。本發明的工藝，不破壞現有的植物資源，不存在資源匱乏問題，生產周期短，提取成本低，生產量大，產品純度高，利于工廠化生產，可促進苦馬豆素作為抗腫瘤藥物及免疫增強劑等藥物研發的產業化進程。
文檔編號C12P17/06GKCN101100682 B發布類型授權 專利申請號CN 200610043120
公開日2011年4月27日 申請日期2006年7月7日
發明者傅艷萍, 來航線, 王建軍, 趙寶玉 申請人:西北農林科技大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (3),