專利名稱:神經突起延伸引導裝置及其制造方法
技術領域：
本發明是關于一種可引導及加速神經細胞突起生長的裝置及其制造方法，可用以做為神經細胞的培養與神經組織再生。
背景技術：
人體的各種感覺、行動、思考、情緒乃至于臟器的運作，皆由神經系統來負責統合與調控，因此只要神經系統的任何部位發生損傷或病變，皆會造成患者生活上極大的不便，甚至深深影響意識與精神狀態，由此可見，任何可以維持神經組織系統正常運作的相關技術與產品的重要性與迫切性。
神經系統生理功能的運作由神經細胞執行，神經細胞在結構上分為細胞本體(soma)與細胞突起(processes)二部分，其中細胞突起的部分又分為軸突(axon)與樹突(dendrite)。軸突負責傳送信息至另一神經細胞，樹突則負責接收其它神經細胞所傳遞而來的信息。神經細胞突起的末端有一隆起的構造，稱為突觸(synapse)。突觸為神經細胞之間相互接觸的部位，神經細胞利用此一部位分泌神經傳遞物質(neurotransmitter)刺激另一株神經細胞，同樣的，另一株神經細胞亦利用此一結構接受神經化學物質的刺激，引發細胞體內一連串的信息傳遞作用而反應的。
成熟的神經系統內，有二項主要維持其基本功能的標準需求首先神經細胞必須位于其特定位置，此外神經突起(即軸突與樹突)或是突觸的連結必須正確。神經細胞所處的位置及其所聯結的標的并非隨機產生，而是經由一連串分化與發育過程而形成。發育過程中個別神經細胞有其不同的移動路徑，以使細胞位于特定的位置。除了細胞位置外，神經細胞之間的連結亦需要正確，這仰賴發育過程中軸突末端的生長點(growthcone)沿著特定路徑延伸，最后與其標的(target)接觸，再分化成為突觸。不同生長點有其延伸的路徑，典型的生長點的外形上有一些小觸須(microspike)是由肌纖維蛋白(actin)所支撐的構造，生長點即是通過由這些小觸須的伸長或縮短來向前延伸或是改變延伸的方向。
神經軸突生長點的延伸不只于發育過程扮演重要角色，當神經組織受損之后，神經軸突生長點的再生路徑搜尋與標的連結，亦是受損神經功能恢復與否的重要關鍵。因此，神經軸突延伸(或再生)與生長點的路徑搜尋(path-finding)機轉如能被充分了解，將可于神經組織工程技術領域：
中協助開發神經組織工程相關產品，例如神經再生引導基材型式設計與神經再生引導活性分子的發明；同時，亦可以將軸突與生長點的生長特性分析運用于神經系統相關藥物的開發。
研究神經軸突生長點的延伸機制一直是神經科學領域一大重要課題，從文獻資料中得知，已經有相當多的科學家嘗試運用目前最新的材料與微機電技術于神經細胞體外培養上，通過此達到引導神經軸突依一定方向生長，形成特定型式神經網絡的目的，同時也方便紀錄神經軸突生長的各項參數，并利于神經細胞膜電位與神經傳導物質分泌的分析。目前在這一方面研究投入與產出最多的單位為德國的Max Planck Institute，其主要的技術開發方向包含1.特定結構的硅芯片基材加工(fabrication of patterned silicon chip)、2.將神經路徑引導分子以一定型式固定在基材上(surface modification with neuronalpath-finding molecule)、3.將體外培養的神經組織或細胞培養在材料上，形成神經細胞網絡。惟其發展的技術只提供神經細胞網絡的基本架構，科學家在體外神經細胞網絡建構上仍有許多瓶頸尚待突破，例如1.如何突破神經細胞與材料界面的聯系，以充分接收并刺激神經細胞信息傳導2.如何延長神經細胞在相關基材上培養的存活時間，以提高運用的效率3.如何建構一實時的神經軸突生長檢測系統，以充分掌握神經軸突延伸的機制4.如何設計神經細胞網絡芯片，以符合神經藥物篩選、神經組織再生引導、與神經信息傳導刺激/接收的運用，以及5.如更有效引導神經軸突生長延一定路徑延伸。
在神經細胞培養與再生技術領域：
中，已知美國專利公開號20030032946技術中是利用50～100納米寬的凹槽，用以引導神經軸突的速結，以應用于組織內與神經網絡連接。此外在L.Lauer et al.2002，“Electrophysiological recordings of patterned ratbrain stem slice neurons”所發表的技術論文中，揭露不同寬度與連接點(線寬2～6微米、結點直徑大小10～20微米)的設計，其是將蛋白質以特定型式涂布于培養基材上，然而前述技術的引導分子材料是為一連續式的神經引導路徑或于特定節點加強引導分子涂布區域，這與本發明的神經細胞生長裝置之間斷式引導分子型態顯然不同。
傳統的神經細胞培養裝置或方法大多以連續式神經細胞引導路徑的設計或是改變基材上的涂布材料，而培養時間需花費較長，因此開發一種可快速促使神經細胞再生與延伸的裝置是為重要的課題。
發明內容
為有效促進神經細胞的生長與再生，通過以控制神經細胞軸突的延伸，本發明是通過由基材表面微結構的設計形式，使基材得以運用于神經細胞培養或神經再生引導，加速神經軸突的延伸速度，縮短神經網絡連結或再生的時程。
本發明的目的是提供一種神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置，其是包含一基材，其是具有一表面，可允許神經細胞粘著成長于其上；及一引導分子材料，其是位于前述基材表面，用以引導神經細胞軸突成長；其中前述引導分子材料的分布是至少一部分為間斷式的型式。較佳地，前述引導分子材料的分布是為間斷式的線條或不連續的區塊的線條，其寬度是為2～10微米，且每20～100微米的長度間具有一2～15微米之間隔。前述裝置的基材上亦可進一步包含神經細胞培植區。
本發明的另一目的是提供一種神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置的方法，其步驟是包含(a)提供一微壓印圖章，該微壓印圖章上具有間斷式的圖案；(b)將引導分子材料形成于微壓印圖章上；(c)將步驟(b)的微壓印圖章覆蓋于一基材上，以將引導分子材料轉移至基材上；及(d)將微壓印圖章與基材分離，即可獲得具有引導分子材料的神經細胞生長裝置，且該裝置的引導分子材料的分布至少一部分為間斷式的型式。
本發明的再一目的是提供一種利用前述神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置培養神經細胞的方法，其步驟包含提供一欲培養的神經細胞；將神經細胞置于本發明的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置的引導分子材料上；及將前述裝置置于適合神經細胞生長的環境進行神經細胞生長或神經突起延伸的培養。
利用本發明的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置，其引導分子材料是為間斷或不連續的型態，以其進行神經細胞培養或神經再生引導時，不僅可控制神經軸突生長方向，同時可加速神經軸突的延伸速度，故可應用于神經細胞培養、植入式神經細胞芯片、體外神經網絡建構、神經再生引導基材及神經組織修復鷹架。
圖1A是為具備直線與圓形細胞培植區結構的微壓印圖章；圖1B是為具備直線與間斷式直線結構的微壓印圖章；圖1C是為具備間斷式直線結構的微壓印圖章的表面電子顯微鏡影像圖；圖2A是為本發明的具有間斷式引導分子材料型態的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置，其中間斷式的引導分子材料型態是為每10微米接續5微米之間斷裂口；圖2B是為本發明的具有間斷式引導分子材料型態的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置，其中間斷式的引導分子材料型態是為每100微米接續10微米之間斷裂口；圖2C是為現有的連續式引導分子材料型態；圖3A是為神經細胞于本發明的裝置上培養的軸突延伸趨勢圖，其中間斷式的引導分子材料型態是為每50微米接續5微米之間斷裂口；圖3B是為間斷式與連續式的引導分子材料型態對神經細胞軸突平均延伸速度的長條比較圖；圖4A是為神經細胞于本發明的裝置上培養的軸突延伸趨勢圖，其中間斷式的引導分子材料型態是為每20微米接續5微米之間斷裂口；圖4B是為間斷式與連續式的引導分子材料型態對神經細胞軸突平均延伸速度的長條比較圖；
圖5A是為神經細胞于本發明的裝置上培養的軸突延伸趨勢圖，其中間斷式的引導分子材料型態是為每40微米接續10微米之間斷裂口；圖5B是為間斷式與連續式的引導分子材料型態對神經細胞軸突平均延伸速度的長條比較圖。
1 神經細胞培植區結構2 直線結構3 間斷式直線結構具體實施方式
本發明的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置是由基材及引導分子材料的結合所構成，其中基材的材質可為硅芯片、玻璃、石英、聚合物、細胞培養基等材料所制成的組織鷹架、神經再生引導裝置、培養皿、芯片及微流體芯片。本發明的基材具有一表面，可允許神經細胞粘著成長于其上，而為使神經細胞的軸突依照預期方向生長，則需仰賴引導分子材料的作用，引導分子材料若欲更穩定地形成于基材表面，基材制作時可利用一體成型的方法將凹陷或隆起的線條或區塊制作于其表面上，或利用蝕刻法或沈積法于基材表面制作凹陷或隆起的線條或區，以便于將引導分子材料形成于其上。基材也可以是本技術領域：
所熟知的神經再生引導裝置或神經修復組織鷹架，通過由本發明的引導分子材料特殊分布型態，提升神經細胞于該基材上的生長及再生能力。
引導分子材料位于前述基材表面，其目的是用以引導神經細胞軸突成長，引導分子材料包含蛋白質、勝肽、神經傳導物質、生物兼容性復合材料及其混合物等有助于神經細胞生長、再生與貼附的物質，引導分子材料可透過化學固定、涂布、噴墨方式、微接觸式壓印技術(Micro-contact printing)等現有技術與基材表面接觸結。
引導分子材料型態是為間斷的線條或不連續的區塊，較佳是為不連續的線條，其寬度是為2～10微米，且每20～100微米的長度間具有一2～15微米之間隔。
本發明的神經細胞生長裝置其基材的表面是可進一步包含化學引誘劑因子、粘著分子、相斥分子及表面輪廓線材等本技術領域：
所熟知可用以控制及促進神經細胞生長、再生及軸突延伸的物質，以便使神經細胞軸突能于延伸過程中順利朝預期的方向。
本發明的一種制備神經細胞生長裝置的方法的一是利用微接觸式壓印技術。首先需提供一微壓印圖章，其是利用機械切割、蝕刻或光罩微影技術制作出一主模后，再將該主模進行翻模程序制得。微壓印圖章的材料的選用是以軟性高分子材料為主，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、聚丙烯或其混合物，其中較佳是為聚二甲基硅氧烷，微壓印圖章的制作是將液狀的微壓印圖章材料滴在一平面材料(例如玻片)上，再將此平面材料覆蓋于主模上，此時將主模及平面材料一起置于真空泵浦內抽氣，直到平面材料與主模間的氣體完全抽出后置于高溫環境中烘烤，直到軟性高分子材料固化后由主模上取下，此時微壓印圖章上即具備和主模互補的圖案，亦即本發明的欲用以形成間斷式引導分子材料型態的圖形(pattern)。
取得微壓印圖章之后，將引導分子材料形成于前述微壓印圖章上，過程中可以利用氮氣槍吹，加速引導分子材料的干燥成形，的后取欲涂布引導分子材料的基材，覆蓋于微壓印圖章上，基材可先進行酸洗及水洗的動作，之后浸泡于酒精中于使用前才取出烘烤，此外基材及微壓印圖章在進行引導分子材料的形成及轉印的步驟前，可先利用O2電漿進行表面處理，使其表面具有更佳的親水性，讓引導分子材料更容易附著。
當引導分子材料由微壓印圖章上移轉至基材上后，即可將基材與微壓印圖章分開，此步驟可利用刀片作為分離工具，使兩者的分離程序易于進行，也可較容易避免基材與微壓印圖章間發生兩次覆蓋的情形。
制備本發明的具間斷式神經軸突引導分子材料的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置的方法并不限于上述微接觸式壓印技術，任何可使神經軸突引導分子材料附著于基材上的方法皆可被使用。本發明的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置的實施態樣包括細胞培養皿、神經細胞芯片、微流體芯片、神經再生導管及神經組織修復鷹架等。可應用于神經細胞培養、植入式神經細胞芯片、體外神經網絡建構、神經再生引導基材。
以下實施例是用于進一步了解本發明的優點，并非用于限制本發明的申請專利范圍。
實施例1.本發明的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置的制備首先利用微影技術制作一硅芯片的主模，接著以10∶1的比例調制Sylgard silicone elastomer 184及PDMS的混合物，接著取一玻片，將前述配制好的PDMS溶液置于玻片上后，將玻片覆蓋于主模上，然后置于真空泵浦內抽氣，使玻片與主模間的氣體完全抽出。接著置于70℃的環境中烘烤，待PDMS固化后由主模上取下，即可制得PDMS的微壓印圖章(如圖1A至圖1C所示)。其中由圖1A及圖1B可知，本實施例的微壓印圖章的圖樣是包含一圓形的神經細胞培植區結構1及直線結構2(圖1A)，以及接續于該直線結構2后段之間斷式直線結構3。此是為了于基材制造出具有用于將神經細胞置入并培養于其中的神經細胞培植區的引導分子材料型態。而直線結構2與間斷式直線結構3是可于基材上制作出是用于使神經細胞軸突快速地延伸生長之間斷式引導分子材料型態。
接著取另一作為基材的玻片，該玻片在使用前已先經過酸洗、水洗及酒精浸泡的程序，經烘烤后和微壓印圖章一起進行O2電漿表面處理，接著將作為引導分子材料的層粘連蛋白(laminin)滴在微壓印圖章上后以氮氣槍輕吹，使引導材料分子能平均涂布于微壓印圖章的表面，等引導分子材料變干后，將玻片覆蓋于微壓印圖章上進行引導分子材料的轉移，過程中可輕壓玻片，但不可施力過大以免造成壓印圖案模糊。之后將玻片與微壓印圖章分開，若不容易分開可使用刀片輔助，過程中需避免玻片和微壓印圖章發生兩次覆蓋，分開的后即可制得本發明的神經細胞生長或神經突起延伸裝置。
根據上述微接觸式壓印技術制成的本發明的具有間斷式引導分子材料型態的神經細胞生長或神經突起延伸裝置如圖2A及圖2B所示，其與圖2C所示現有的連續式引導分子材料型態顯然不同。圖2A的引導分子材料線條寬度為5微米、兩并行線間的距離為20微米，線長以每10微米(Dash line:10微米)接續5微米之間斷裂口(Dash gap:5微米)方式重復排列。圖2B的引導分子材料線條寬度與兩并行線間的距離與圖2A一樣，分別為5微米與20微米，但圖2B中的線長以每100微米接續10微米之間斷裂口方式重復排列。圖2C的引導分子材料線條寬度為3微米、兩并行線間的距離為6微米。
實施例2.利用本發明的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置培養金魚神經細胞金魚神經細胞是由金魚視網膜組織誘導其神經軸突伸出組織塊的后，將其置于本發明的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置的引導材料分子上，本實施例的基材為一般載玻片、引導分子材料是為層粘連蛋白(laminin)，其型態是為間斷式線條，其長度為每50微米接續5微米之間斷裂口，對照組則為如圖2C所示的連續式線條。將具有金魚神經細胞的本發明的裝置置于適當環境中觀察神經細胞生長及神經突起延伸情形，所得結果如圖3A及圖3B，其中圖3A是為神經細胞于本發明的生長裝置上培養的軸突延伸趨勢圖，由圖可知在最初的120分鐘內，神經細胞軸突可被成功引導延伸，圖3B則是比較間斷式與連續式的引導分子材料型態對神經細胞軸突延伸速度的差異，由平均速度的長條比較圖可知，間斷式的引導分子材料型態可以誘發神經細胞以相較于連續式達約2倍的速度進行軸突的延伸。其機制推論乃因生長點(growth cone)以跳躍的方式跨過間斷的引導分子材料接口，因此加速了神經軸突延伸的速度。
實施例3.利用本發明的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置培養金魚神經細胞實驗準備及操作方法同實施例2，但本實施例的引導分子材料型態其長度為每50微米接續5微米之間斷裂口，對照組同樣為連續式線條，所得結果如圖4A及圖4B，其中圖4A是為神經細胞于本發明的生長裝置上培養的軸突延伸趨勢圖，由圖可知在最初的120分鐘內，神經細胞軸突可被成功引導延伸，圖4B則是比較間斷式與連續式的引導分子材料型態對神經細胞軸突延伸速度的差異，由平均速度的長條比較圖可知，間斷式的引導分子材料型態可以誘發神經細胞以相較于連續式達約2倍的速度進行軸突的延伸。
實施例4.利用本發明的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置培養金魚神經細胞實驗準備及操作方法同實施例2，但本實施例的引導分子材料型態其長度為每40微米接續10微米之間斷裂口，對照組同樣為連續式線條，所得結果如圖5A及圖5B，其中圖5A是為神經細胞于本發明的生長裝置上培養的軸突延伸趨勢圖，由圖可知在最初的120分鐘內，神經細胞軸突可被成功引導延伸，圖5B則是比較間斷式與連續式的引導分子材料型態對神經細胞軸突延伸速度的差異，由平均速度的長條比較圖可知，間斷式的引導分子材料型態可以誘發神經細胞以相較于連續式達約2.5倍的速度進行軸突的延伸。
由上述實施例的結果可知，本發明的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置其間斷式的引導分子材料型態，在應用于神經細胞培養或神經再生引導時，可促進神經細胞突起于基材表面的貼附延伸，并引導神經軸突生長方向，加速神經軸突的延伸速度。相較于現有神經細胞生長或神經突起延伸裝置的技術，可明顯加速神經突起延伸速度，對于未來神經醫學重建及再生醫療是為一項重大的突破。
其它實施態樣在本說明書中揭露本發明數個實施態樣。根據本說明書所揭露的內容，任何熟習本技術領域：
的人士皆可基于本發明的特色，在不脫離本發明精神與目的下，對本發明做不同的更動與修飾，因此，其它實施態樣也包含在本發明的申請專利范圍內。
權利要求
1.一種神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置，其特征在于包含一基材，其是具有一表面，允許神經細胞粘著成長于其上；及一引導分子材料，其是位于前述基材表面，用以引導神經細胞軸突成長；其中前述引導分子材料的分布是至少一部分為間斷式的型式。
2.如權利要求
1所述的裝置，其特征在于，所述引導分子材料的分布是為間斷式的線條。
3.如權利要求
1所述的裝置，其特征在于，所述引導分子材料的分布是為不連續的區塊。
4.如權利要求
2所述的裝置，其特征在于，所述間斷式的線條其寬度是為2～10微米。
5.如權利要求
2所述的裝置，其特征在于，所述間斷式的線條其每20～100微米的長度間具有一2～15微米之間隔。
6.如權利要求
1所述的裝置，其特征在于，所述引導分子材料包含蛋白質、勝肽、神經傳導物質、生物兼容性復合材料或其混合物。
7.如權利要求
1所述的裝置，其特征在于，所述基材的表面可進一步先利用蝕刻法或沈積法制作具有間斷式型式的神經軸突引導路徑，用于使引導分子材料涂布于其上。
8.如權利要求
1所述的裝置，其特征在于，所述引導分子材料是可通過由化學固定、涂布方式、噴墨方式或微接觸壓印方式附著于基材表面上。
9.如權利要求
1所述的裝置，其特征在于，所述基材上可進一步包含一神經細胞培植區。
10.如權利要求
1所述的裝置，其特征在于，所述基材的表面是可進一步包含化學引誘劑因子、粘著分子、相斥分子及表面輪廓線材。
11.一種制備神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置的方法，其特征在于，包含(a)提供一微壓印圖章，該微壓印圖章上具有間斷式的圖案；(b)將引導分子材料形成于前述微壓印圖章上；(c)將前述步驟(b)的微壓印圖章覆蓋于一基材上，通過以將引導分子材料轉移至基材上；及(d)將前述微壓印圖章與基材分離，即可獲得具有引導分子材料的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置，且該裝置的引導分子材料的分布至少一部分為間斷式的型式。
12.如權利要求
11所述的方法，其特征在于，所述微壓印圖章是利用一以微影技術制得的主模將其翻模后制得。
13.如權利要求
11所述的方法，其特征在于，所述微壓印圖章的材料是包含聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚丙烯或其混合物。
14.如權利要求
13所述的方法，其特征在于，所述微壓印圖章的材料是為聚二甲硅氧烷。
15.如權利要求
11所述的方法，其特征在于，所述引導分子材料的分布是為間斷式的線條。
16.如權利要求
11所述的方法，其特征在于，所述引導分子材料的分布是為不連續的區塊。
17.如權利要求
15所述的方法，其特征在于，所述間斷式的線條其寬度是為2～10微米。
18.如權利要求
15所述的方法，其特征在于，所述間斷式的線條其每20～100微米的長度間具有一2～15微米之間隔。
19.如權利要求
11所述的方法，其特征在于，所述基材上可進一步包含一神經細胞培植區。
20.如權利要求
11所述的方法，其特征在于，所述引導分子材料包含蛋白質、勝肽、神經傳導物質、生物兼容性復合材料或其混合物。
21.一種利用權利要求
1所述的神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置培養神經細胞的方法，其特征在于，步驟包含提供一欲培養的神經細胞；將前述神經細胞置于神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置的引導分子材料上；及將前述裝置置于適合前述神經細胞生長的環境進行神經細胞生長或神經突起延伸的培養。
22.如權利要求
21所述的方法，其特征在于，所述引導分子材料的分布是為間斷式的線條。
23.如權利要求
21所述的方法，其特征在于，所述引導分子材料的分布是為不連續的區塊。
24.如權利要求
22所述的方法，其特征在于，所述間斷式的線條其寬度是為2～10微米。
25.如權利要求
22所述的方法，其特征在于，所述間斷式的線條其每20～100微米的長度間具有一2～15微米之間隔。
26.如權利要求
21所述的方法，其特征在于，所述引導分子材料包含蛋白質、勝肽、神經傳導物質、生物兼容性復合材料或其混合物。
專利摘要
本發明是關于一種神經細胞生長或神經突起延伸引導裝置，其是利用于基材上設計間斷式的神經路徑引導分子材料，達到引導并加速神經細胞軸突的延伸速度，縮短神經網絡連結或再生的時程。本發明亦揭露一種利用微接觸壓印方法制備該神經細胞生長裝置的方法。
文檔編號C12N5/08GKCN1861779SQ200510070169
公開日2006年11月15日 申請日期2005年5月9日
發明者沈欣欣, 駱婉珣, 林奇宏, 劉宏文 申請人:財團法人工業技術研究院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan