用甲基營養酵母生產人熱休克蛋白70的方法

專利名稱:用甲基營養酵母生產人熱休克蛋白70的方法
發明領域本發明涉及蛋白質的生產、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達重組人熱休克蛋白70(hHSP70)，以及優化的大規模工業化發酵生產重組人熱休克蛋白70的方法。
發明背景生物體在受到熱或其它理化因素(如高溫、一氧化碳、煙堿、缺氧、重金屬離子、乙醇、紫外線照射等)的作用時，可啟動一組特定基因的表達，合成一組高度保守的蛋白質—熱休克蛋白(HSPs)。熱休克蛋白(HSP)也稱為應激蛋白，最初是作為一種細胞對熱休克的反應中合成的蛋白質被發現的。根據分子量的大小，迄今已鑒定的HSP包括HSP100、HSP90、HSP70和小分子HSP(22KDa，smHSP)等不同的家族。HSP不僅參與保護細胞對抗不良環境條件，而且也參與非應激細胞的生物化學和免疫學過程。HSP可完成不同的分子伴侶功能。例如，定位于細胞漿、細胞核、染色體或內質網中的HSP70家族的成員不僅參與向免疫系統的細胞呈遞抗原，而且也參與正常細胞中蛋白質的轉運、折疊和組裝。HSP可與蛋白質或多肽結合，并于三磷酸腺苷(ATP)存在下釋放這些結合的蛋白質或多肽，參與細胞的抗損傷和細胞分化。近年來研究發現，HSPs能將與其結合的抗原多肽或蛋白通過內源性途徑傳遞給主要組織相容性抗原復合物(MHC)I類分子，引發特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。而且，也可直接激活γδT細胞和NK細胞，刺激免疫細胞釋放各種免疫調節因子，在非特異性免疫過程中發揮作用。
Srivastava等人(Immunol.Today，1988，978-83；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，833407-3411)的研究發現，負責腫瘤不同免疫原性的分子是分子量為96KDa(gp96)的糖蛋白和84-86KDa(p84/86)的細胞內蛋白質。用分離自特定腫瘤細胞的gp96或p84/86免疫小鼠只能使動物產生針對該特定腫瘤的免疫反應。另外，已顯示HSP70能引發抗其來源腫瘤而不是其他不同腫瘤的免疫反應。因此，可以認為，針對腫瘤抗原肽的這種特異性免疫是來自與HSP與抗原肽的非共價復合物，而不是來自于HSP本身。
復合物中的抗原肽轉移到抗原呈遞細胞，與其表面上的主要組織相容性復合物(MHC)I類蛋白質分子結合，從而活化細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，引發CD8+細胞毒T細胞反應并殺傷靶細胞。因此，有可能使用由腫瘤細胞純化的HSP與抗原肽的非共價復合物治療和預防腫瘤(參見美國專利5,830,464、6,017,54，和PCT申請公開號WO96/10411、WO97/10001)。
另外，也可由病原體感染的細胞中分離應激蛋白-肽復合物，并將其用于治療和預防相應病原體(如病毒、細菌、真菌等)引起的感染(PCT 95/24923)。或者，還可使用應激蛋白-肽復合物體外致敏抗原呈遞細胞，并用于過繼性免疫治療(參見PCT申請公開號WO97/10002)。
目前，用于制備應激蛋白-肽復合物的HSP特別是HSP70及腫瘤抗原肽，大多是都是從腫瘤細胞中分離并純化得到的。然而，由于腫瘤細胞特別是發育早期的腫瘤細胞供應上的不足，常常使HSP-肽復合物的生產和使用受到限制。雖然有人曾利用大腸桿菌系統成功地表達了HSP70，但由于表達產物通常在宿主細胞內形成包涵體，所以致使產物的收率很低，或者純化困難，易于污染內毒素及大腸桿菌本身的HSP70，往往難于適應研究和臨床應用的需要。因此，有必要建立和發展重組表達和純化HSP例如HSP70，以及HSP-抗原肽復合物的方法，以便滿足實驗室研究的需求，并為腫瘤和其他感染性疾病的治療與預防大量提供這類免疫治療劑。
甲基營養酵母，特別是巴斯德畢赤酵母是已被深入研究的真核表達系統，并已被用于表達許多有用的蛋白質。例如，美國專利5,324,639公開了在甲基營養酵母特別是巴斯德畢赤酵母細胞中生產胰島素樣生長因子1的方法；美國專利5,330,901公開了使用巴斯德畢赤酵母系統表達人血清白蛋白的方法；美國專利5,965,389提供了在甲基營養酵母中表達L-谷氨酸脫羧酶(GAD65)的DNA構建體以及由之制備純的GAD65的方法；美國專利公開了在巴斯德畢赤酵母中表達血小板衍生的細胞因子(PDGF)的方法；美國專利6,780,615描述了使用重組巴斯德畢赤酵母生產應樂果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未見關于使用巴斯德畢赤酵母生產人HSP70的報道。
發明目的本發明的一個目的是提供一種使用甲基營養酵母生產重組人熱休克蛋白70(HSP70)多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養基中培養甲基營養酵母，其中所說的甲基營養酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構建體轉化的(1)甲基可誘導的轉錄啟動子；(2)編碼熱休克蛋白70的DNA片段；(3)轉錄終止子和(4)可選擇標志，從而以至少250mg/L培養基的濃度產生熱休克蛋白70多肽。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOX1基因。
本發明的另一個目的是提供用于表達重組人熱休克蛋白70的甲基營養酵母，該酵母能夠依靠作為碳源和能源的甲醇生長，并且是被包括甲基可誘導的轉錄啟動子、編碼熱休克蛋白70的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志的DNA構建體轉化的。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母，并且甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOX1基因。
本發明的再一個目的是提供用于在巴斯德畢赤酵母中表達重組人熱休克蛋白70多肽的DNA構建體，該構建體包括可操作地連接的元件甲基可誘導的轉錄啟動子、編碼熱休克蛋白70的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOX1基因。
本發明的再一個目的是提供使用巴斯德畢赤酵母大規模生產重組人熱休克蛋白70多肽的優化的發酵培養條件，特征在于其中發酵溫度維持在28℃～30℃、所使用的pH值為4.1～5.0、發酵液的DO值(溶解氧)保持在25％～30％、并且培養基中添加有0.5％(W/V)的蛋白胨。



圖1顯示重組質粒pPICZα/hhsp70轉化酵母菌的PCR鑒定電泳圖譜。其中泳道5和11是DNA分子量標志物；泳道12和13是空質粒載體轉化的酵母菌基因組DNA的PCR產物；泳道1～4和6～10是不同酵母菌轉化子基因組DNA的PCR擴增產物。
圖2顯示純化的rhHSP70蛋白質的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結果(考馬斯亮藍染色)。其中泳道1～4分別是純化中分部收集的洗脫液；泳道5是hHSP70標準品。
圖3顯示純化的rhHSP70的Western印跡分析結果。其中泳道3是hHSP70標準品；泳道1、2和4是本發明制備并純化的rhHSP70樣品。
圖4顯示酶聯免疫斑點法檢測的各組小鼠T細胞分泌IFN-γ水平的結果。
圖5顯示rhHSP70-抗原肽復合物誘導的抗原特異性CTL對靶細胞的殺傷活性(百分殺傷率)。
圖6顯示rhHSP70-抗原肽復合物對小鼠腫瘤生長(體積)的影響。
圖7A和7B顯示rhHSP70-抗原肽復合物對小鼠腫瘤組織和細胞結構的影響。其中7A是400倍光鏡照片，7B是200倍光鏡照片。

發明內容
本發明涉及蛋白質生產、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達熱休克蛋白70的方法。
巴斯德畢赤酵母(P.Pastoris)是20世紀80-90年代發展起來的極具潛力的酵母表達系統，由于其在蛋白質表達方面具有其它系統不可比擬的優點而得到越來越廣泛的應用。
作為真核表達系統，巴斯德畢赤酵母具有許多其它蛋白表達系統所不具備的優點①屬于單細胞生物，故保留了易于操作和生長速度快的特點(可高密度發酵培養，在發酵罐中細胞干重可達130g/L以上)；②營養要求低，培養基成分簡單，生產成本低，特別適用于工業化大規模生產；③通過同源重組，可將表達載體穩定地整合到宿主染色體中，連續傳代中不易丟失；④具有強有力的乙醇氧化酶基因(AOX)啟動子，可嚴格調控外源基因的表達；⑤表達量高，許多蛋白的產率可達到每升克以上水平；⑥表達的蛋白質既可存在于胞內又可分泌至胞外，巴斯德畢赤酵母自身蛋白質的分泌量很低，十分有利于目的產物純化；⑦作為真核表達系統，可對表達的蛋白進行翻譯后的正確加工和修飾；⑧糖基化程度低。
畢赤酵母表達系統由一個外源基因表達框和AOX1啟動子、多克隆位點(MCS)和一個從AOX1基因上拷貝下來的終止序列(TT)組成。同時，大多數載體都包含作為篩選標記的HIS4基因和為拷貝增殖而存在的序列(如ColEI復制起始點和抗氨芐青霉素基因)。另外，還含有使外源基因能以替代或插入方式整合到染色體的AOX1部位的AOX1 3’非編碼區序列。本發明所使用的載體是由啟動子、終止子、選擇標記、報告基因、復制起點等元件構成。另外分泌型載體還需要有信號序列。
最常用的啟動子是AOX1啟動子，它的甲醇誘導性很強，因而它控制下的外源基因能得到較高的表達。細胞中絕大多數乙醇氧化酶活力是由AOX1提供的。當在以葡萄糖或甘油為碳源的培養基上生長時，AOX1轉錄受到抑制；而在以甲醇為唯一生長碳源時，則可誘導AOX1基因的轉錄和蛋白質表達。選擇標記(HIS4)一般是對應于營養缺陷型受體的野生型基因。
巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白質很少，所以分泌表達是一種理想的表達方式。同時，胞外表達更有利于蛋白質的提取和純化。本發明優選的信號肽是α因子(αMF)。α因子信號序列由87個氨基酸組成，來自于啤酒酵母(S.cerevsia)的α性成熟因子前導序列，并且已將這段序列編碼的信號肽插人到巴斯德畢赤酵母的表達載體中。
本發明的巴斯德畢赤酵母表達載體可以是胞內表達的，也可以是分泌表達的。這些載體都包括一個由0.9kb的5′AOX1序列片段和約0.3kb的轉錄終止基因的3′序列組成的表達盒。分泌型表達載體可以是pPIC9，pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZα、pYAM75P6E6等；胞內表達的載體可以是pHIL-D2、pA0815、pPIC3K，pPICZ，pHWO10E121，pGAPZ、pGAPZα等。本發明優選的是pPICZα。
一般用于外源基因表達的巴斯德畢赤酵母菌株包括Y-11430、M-6100-3、GS115、KM71、SMD1168等，本發明優選的是巴斯德畢赤酵母X-33菌株。
得到攜帶HSP基因的重組表達載體后，可使用鋰鹽法、PEG法、原生質球法和電穿孔法等方法轉化巴斯德畢赤酵母宿主細胞。其中，本發明優選的轉化方法是電穿孔法((如參見Sambrook，ed.Molecular CloningA Laboratory Manul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1998))。
導入酵母體內的重組表達載體只有與酵母染色體上的同源區發生重組，整合到染色體上，外源基因才能夠穩定存在并得以表達。本發明中，為了穩定地表達目的基因，可以在His或5′AOX1的單酶切位點將質粒載體線性化(Sac I)，使之通過單交換整合到酵母細胞染色體中，從而得到表型為Mut+并具有高甲醇利用能力的轉化子。
用于本發明的巴斯德畢赤酵母含有典型高等真核生物的許多翻譯后修飾功能。這些功能包括信號肽的加工、蛋白質折疊、二硫鍵的形成、O-及N-型糖基化和酰化等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白質的糖基化鏈參與細胞識別、激素受體結合、蛋白質定位及宿主—微生物間相互作用。糖基化過程是經一系列剪接并產生由Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)組成的寡核糖的反應。巴斯德畢赤酵母能夠將碳水化合物連接到分泌表達的外源蛋白質上。巴斯德畢赤酵母修飾糖鏈的平均長度為8～14甘露糖，而且外鏈不含α-1，3甘露糖，所以其表達的糖蛋白特別適于治療應用。
由于本發明中充分優化了溶解氧水平、通氣量、發酵pH值，攪拌速率、營養補給等培養條件，所以可使酵母菌高密度生長，從而導致產物的高效表達。例如，在發酵罐培養條件下，本發明的重組HP70多肽表達產率可達到1.2g/L。
絕大多數情況下，巴斯德畢赤酵母(P.Pastoris)中整合多拷貝外源基因會提高重組蛋白表達產量，所以本發明優先選擇分泌型、高拷貝標記和易操作的穿梭載體，特別是pPICZα作為HSP70多肽的表達載體。
另外，由于在His位點整合時，染色體突變的His位點可與表達盒的HIS4基因位點之間發生基因交換會導致表達盒的丟失，故一般優先選擇AOX1位點。
本發明中，發酵培養所使用的培養基可以是BMGY/BMMY，BMG/BMM，MGY/MM等培養基，但優選的是成分中含有緩沖液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培養基。
作為唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般為培養體積的0.5-1.0％(V/V)。
發酵培養過程中，可使用已知的方法檢測由被轉化細胞分離物所產生的HSP70多肽含量，并從中選擇有高產率的細胞分離物，用于放大生產。
可使用飽和硫酸銨鹽析、離子交換層析、親合層析等方法分離并純化所需的HSP70多肽。
本發明首次在酵母(畢赤酵母X-33)中高效分泌表達了hHSP70，建立了穩定的rhHSP70畢赤酵母高效表達體系。與在大腸桿菌中的表達相比，本發明的方法具有如下特點①表達體系穩定，含目的基因的表達盒通過同源重組整合進入酵母的染色體中，菌種穩定，不存在質粒丟失的問題；②有效的分泌表達，目的蛋白質的表達受醇氧化酶啟動子的嚴格控制，可在甲醇誘導下啟動表達并將表達產物分泌到培養基中，而且畢赤酵母本身的蛋白很少分泌到培養基中，使目的蛋白更易于純化；③表達產量高，rhHSP70在畢赤酵母中的搖瓶規模表達量可高達250mg/L，在發酵罐中大規模高密度發酵培養時可達到1.2g/L；④不存在內毒素污染問題；⑤大規模發酵生產成本低。
在HSP70純化方面，目前大多采用ConA親和層析結合DEAE陰離子交換層析或者ATP/ADP親和層析結合DEAE陰離子交換層析。眾所周知，內毒素是由脂蛋白和多糖組成的，通常帶有負電荷，而核酸也帶負電荷，因此使用陰離子交換層析方法容易造成內毒素和核酸等雜質的污染。有人曾報道指出，HSP70在較高pH條件下不夠穩定，得率和純度均較低。例如在37℃溫育時很快降解，在高于pH7.7時37℃溫育2h即有明顯降解。因為hHSP70的等電點約為5.5，所以本發明采用pH4.0條件下進行陽離子交換層析可很好的避免核酸和內毒素的污染，并且有利于保持rhHSP70的穩定，防止其降解。
本發明建立了在酵母中高效分泌表達hHSP70的方法，同時建立了聯合使用疏水層析和陽離子交換層析技術純化hHSP70產物的方法。使用SDS-PAGE、Western印跡分析以及蛋白質N-端測序分析，證實按照本發明方法生產的rhHSP70具有與天然hHSP70相同的序列和理化性質，從而為進一步檢測其體內外生物學活性提供了必要條件。
進一步的生物學實驗表明，按照本發明方法制備HSP70可以作為分子伴侶，有效地結合靶細胞表面上的抗原肽，通過受體介導的胞吞作用將其結合的抗原分子遞呈給專職的抗原提呈細胞(APC)，經APC加工后進入MHC-I類分子途徑，激活特異性細胞毒性T細胞(CTL)。而且，HSP70也可直接激活γ/δT細胞和NK細胞等腫瘤免疫效應細胞，誘導體液和細胞抗腫瘤免疫反應。
本發明人使用合成的HER2/neu蛋白(Hynes NE，Stern DF，Biochem.Biophys.Acta，1994，198(1)，165-184)的CTL表位抗原肽與按照本發明方法制備的rhHSP70所形成的復合物進行動物體內實驗，結果證實，rhHSP70作為一種非特異性分子伴侶蛋白，其可將與之結合的抗原肽傳遞給主要組織相容性抗原復合物(MHC)I類分子，引發特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應，刺激免疫細胞(活化的CTL細胞)釋放活性細胞因子并促進腫瘤細胞的凋亡。我們的一系列實驗有力地表明，本發明制備的rhHSP70確實是一種有效的抗原蛋白分子載體和免疫佐劑。
在以上研究的基礎上，本發明進一步探討了畢赤酵母工程菌大規模發酵(80L發酵罐)方法，優化了利用酵母菌大規模發酵產生熱休克蛋白70的條件，以及適合大規模生產的產物純化方法。其中所使用的優化條件包括發酵溫度維持在28℃～30℃、所使用的pH值為4.1～5.0、發酵液的D0值(溶解氧)保持在25％～30％、并且培養基中添加有0.5％(W/V)的蛋白胨。
結果顯示，本發明建立的畢赤酵母工程菌大規模發酵生產重組人熱休克蛋白70的表達率約為1.2g/L發酵液、產物回收率約為80％、產物的純度高達約95％。本發明的這些研究結果無疑將為重組人熱休克蛋白70的工業化生產和臨床應用提供必要的基礎。
具體實施方式
以下借助實施例描述本發明的最佳實施方式。這些實施例旨在進一步舉例闡明本發明，而不是以任何方式限制本發明待批權利要求
的范圍。
實施例1人hsp70基因(hhsp70)的克隆和擴增(1)DNA的制備
將HeLa細胞(2×106)接種在含10％新生牛血清的DMEM培養液的培養皿中，于5％CO2培養箱中37℃培養。待細胞長滿培養皿后(約1×107個細胞)，棄去培養液，用PBS洗兩遍后，加入3ml冰冷的細胞裂解緩沖液，室溫放置5分鐘，然后轉入1.5ml移液(EP)管中(每管1ml)。按5μl蛋白酶K/ml細胞裂解緩沖液比例加入蛋白酶K，混勻，置于55℃放置3～16小時。取出上述EP管降至室溫后，每管加入5μl RNA酶，37℃放置15～60分鐘。樣品降至室溫后，加入200μl醋酸鉀溶液，劇烈震蕩20秒使其充分混勻。冰浴5分鐘后4℃離心(12000rpm)收集上清。用70％乙醇洗滌后，空氣中干燥DNA沉淀后進行瓊脂糖凝膠電泳定量(OD260/OD280＝1.6～1.8)。
(2)hhsp70基因的克隆(PCR法)取如上提取的人DNA 100ng，按如下比例建立PCR反應體系人基因組DNA 100ng；含Mg2+的10×LA PCR緩沖液10μl；dNTPs 8μl(各2.5mmol/L)；上游引物5’-GCATTCGAAACGATGGCCAAAGCCGC-3’(SEQ ID NO1)1μl(20pmol/μl)；下游引物5’-CCGGAATTCGCCCCTAATCTACCTCC-3’(SEQ ID NO2)1μl(20pmol/μl)；Taq酶1μl(5U/μl)；滅菌超純水至終體積100μl。PCR反應條件是94℃4分鐘；94℃30秒，58℃30秒，72℃2分鐘，共28個循環，然后72℃8分鐘。對擴增產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察片段大小，確定是否得到正確目的基因。
(3)克隆載體的構建、轉化與擴增回收PCR擴增的hhsp70基因片段進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。回收后，將hhsp70基因片段與T載體16℃連接30分鐘。連接反應體系包括hhsp70PCR產物0.1～0.3pmol；T載體0.03pmol；溶液I(含DNA連接酶和連接緩沖液，見Takara公司T載體試劑盒)5μl；滅菌超純水至終體積10μl。
按照常規方法，從37℃培養16小時的XL1-Blue陰性培養板上(不含抗生素的LB瓊脂平板)挑取單個菌落(直徑2～3mm)，接種于含有100ml LB培養基的1L培養瓶中，以制備感受態大腸桿菌細胞，并于-80℃凍存備用。
取一份凍存的感受態細胞融化后，加入上述連接產物，進行常規轉化。然后取200μl已轉化的感受態細胞涂布于含X-Gal、IPTG(二者可在涂菌前半小時涂于LB瓊脂平板表面)和氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上，37℃培養箱中培養12～16小時。
(4)重組載體的鑒定隨機挑取轉化后的白色單菌落(“藍白篩選”)，接種于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養基中，37℃強烈震蕩培養過夜，然后常規提取質粒DNA。取1μl溶解的DNA沉淀物進行瓊脂糖凝膠電泳定量分析和酶切鑒定。37℃PstI消化2小時，1％瓊脂糖凝膠電泳后根據內切酶譜鑒定正確克隆。挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質粒，用于DNA測序。
實施例2hhsp70畢赤酵母分泌型表達載體pPICZα/hhsp70的構建和宿主細胞轉化取上述測序鑒定正確的攜帶hhsp70基因的質粒50ng，按上述比例在0.2mlEP管中建立PCR反應體系。利用上述PGR反應體系和條件，借助上游引物5’-ATACTCGAGAAGAGAATGGCCAAAGCCGCGGCGATC-3’(SEQ ID NO3)引入酵母α因子信號肽的部分序列和XhoI位點，并利用下游引物5’-GCTCGATCTAGACCTAATCTACCTCCTCAATGGT-3’(SEQ ID NO4)引入XbaI位點。PCR引入上述序列和酶切位點后，回收目的片段。用相應酶切后，連入用同樣酶切后的質粒pPICZα，構建畢赤酵母表達載體pPICZα/hhsp70，然后轉化大腸桿菌，提取質粒并進行酶切鑒定和DNA序列測定分析。
取測序正確的培養菌液，按質粒提取試劑盒說明書提取質粒DNA并用瓊脂糖凝膠電泳法進行定量分析。取20～25μg pPICZα/hhsp70重組質粒經SacI酶消化(線性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質粒用10μl超純水溶解后置冰上備用。
從畢赤酵母X-33的YPD陰性培養板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取單個菌落，接種于5ml YPD培養基中，250rpm，30℃震蕩培養8小時，以常規制備酵母感受態細胞。
然后取80μl上述感受態菌，與20～25μg線性化的重組表達質粒混合，移入0.2cm電轉化杯內進行電轉化。取50～100μl轉化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上，30℃培養箱培養2～3天，觀察轉化子的生長狀況。
然后用PCR方法(所使用引物和反應條件同上)篩選轉化酵母菌。離心回收菌體后，以玻璃珠法提取酵母基因組DNA并進行PCR鑒定，鑒定結果如附圖1所示。
實施例3HSP70多肽的表達和純化(1)重組人熱休克蛋白70(rhHSP70)的表達取上述鑒定結果陽性的克隆接種于10ml BMGY(pH6.0)培養基中，30℃震蕩培養24小時，至OD600達到2.0～6.0時收集細胞。用等體積(10ml)BMMY(pH6.0)重懸細胞沉淀，30℃震蕩培養，誘導表達。誘導過程中，每24小時補充一次甲醇至終濃度0.5％，同時補充滅菌超純水，使發酵液總體積保持不變。在培養的第0、24、48、72、96和120小時等時間點各取0.5ml發酵液，離心取上清用于蛋白質分析(SDS-PAGE，Western Blot，N-端氨基酸序列分析等)。
(2)rhHSP70的純化用0.5mol/L NaOH將發酵上清液的pH值調整到7.4后，離心(12000rpm)10分鐘，以去除顆粒物質。然后用Sephacryl S-400樹脂柱進行分子篩層析(交換緩沖液為溶液D20mmol/L Tris-Ac，20mmol/L NaCl，3mmol/LMgC12，pH7.4)。用10倍柱體積的溶液D(20mmol/LTris-Ac，20mmol/L NaCl，3mmol/LMgC12，pH7.4)平衡ATP-Agrose親和層析柱(Sigma公司)。上樣結束后，用約10倍柱體積的溶液E(含0.5mol/L NaCl的溶液D)沖洗ATP-Agrose親和層析柱，至OD280曲線降至基線。依次用5倍柱體積的溶液D和溶液F(含3mmol/L ATP的溶液D)沖洗ATP-Agrose親和層析柱(流速為0.3ml/分)，并收集蛋白峰。然后，用10倍柱體積的溶液B(20mmol/L HAc-NaAc緩沖液(即溶液BNaAc·3H2O 4.9g；冰醋酸9.425ml，超純水定容至1L，pH 4.0)平衡Mono S陽離子樹脂，并將上述收集的蛋白樣品用溶液B稀釋4倍，之后用醋酸調節pH值為4.0，同上離心。以0.5ml/分鐘的速率加樣至Mono S陽離子樹脂上，加樣結束后，用溶液B沖洗至OD280值降至基線。然后用溶液C(含2mol/L NaCl的溶液B)梯度洗脫，并分部收集蛋白峰。最后用Sephacryl S-400進行分子篩層析。
SDS-PAGE分析結果顯示，如此純化的rhHSP70至少達到電泳純，且產物的的收率和純度分別達到約80％和95％(參見附圖2)。
實施例4HSP70多肽的理化性質鑒定(1)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)用SDS-PAGE法進行蛋白質分子量測定和初步定量分析。方法如下配制10％分離膠5％濃縮膠。分別取第48小時培養物上清按4∶1比例加入5×SDS樣品緩沖液，混勻后，煮沸3～5分鐘。取上述樣品，冷卻至室溫后，離心(10000rpm)30秒，取上清每孔加樣20μl。40V電泳至濃縮膠與分離膠交界處，調整電壓到100V，繼續恒壓電泳分離。考馬斯亮藍染色并脫色后，觀察分析結果。
(2)表達產物的Western印跡分析按照常規方法將發酵液上清經SDS-PAGE后，轉印到硝酸纖維素(NC)膜上，室溫干燥30～60分鐘。將上述NC膜置于平皿中，加入20ml封閉液(含0.2％BSA的TTBS)，室溫輕輕振蕩2～3小時或4℃封閉過夜。封閉結束后，將NC膜放入雜交袋中按0.1ml抗體溶液/cm2膜加入兔抗人HSP70抗體，室溫振蕩1～4小時。膜用TTBS漂洗3～5次后，用抗體稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體至1∶200～1∶1000，加入雜交袋中，與NC膜一起室溫振蕩2～4小時。加入1ml 0.3％(W/V)NiCl或CoCl2及10μl 30％H2O2溶液。洗膜后，將膜移入顯色液中，室溫下輕輕搖動并觀察顯色反應。結果如附圖3所示。
(3)表達產物的氨基酸序列分析蛋白質的一級結構是其高級結構的基礎，用基因重組技術表達分泌型蛋白時，表達的異源蛋白在加工成熟過程中容易出現信號肽錯誤切割現象，繼而影響表達蛋白的高級結構和生物活性的發揮。因此，在SDS-PAGE確定分子量正確的情況下，應對所表達的重組蛋白進行蛋白質N-末端的氨基酸序列測定，以確定其一級結構的正確性。本試驗的蛋白質測序工作委托國家生物醫學分析中心完成。測序結果表明，按照本發明方法制備的重組人熱休克蛋白70具有與野生型熱休克蛋白70完全相同的氨基酸序列。
實施例5rhHSP70的生物學活性和應用HSP70作為一種分子伴侶和分子載體，其可通過受體介導的胞吞作用有效地將其結合的抗原遞呈給專職的抗原提呈細胞(APC)，經APC加工后進入MHC-I類分子途徑，激活特異性細胞毒性T細胞(CTL)。本實施例中，使用化學合成的HER2/neu蛋白的CTL表位抗原肽與本發明生產的rhHSP70結合所形成的復合物作為治療性疫苗或實驗藥物，觀察該復合物對腫瘤動物模型的細胞毒性T細胞數量和靶細胞殺傷活性、腫瘤生長抑制率，以及T淋巴細胞的細胞因子(γ干擾素)分泌水平的影響，借以判斷和確定本發明生產的rhHSP70的生物學活性。
(1)乳腺癌腫瘤抗原肽的合成應用ProPred-I程序(http://www.imech.resraghava/propredl/index.html網頁)預測CTL表位，從抗原預測結果中選取兩種區段，即P106-114(Gln-Leu-Phe-Glu-Asp-Asn-Tyr-Ala-Leu)(SEQ ID NO5)和P369-377(Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu)(SEQ ID NO6)表位限制性肽作為待合成的乳腺癌腫瘤抗原肽(Kono et al.，Inf.j.Cancer，78(2)202-208，1998)。
使用ACT90型多肽合成儀(ACT公司)，以固相逐步接肽法合成抗原肽。合成過程結束后，脫去Fmoc保護基并從樹脂上切下合成的肽鏈，乙醚洗滌沉淀后即得到粗品肽。粗品肽用AKT explorer100(Amersham Phamacia Co.)中壓反相液相層析純化。然后將經過ATP親和層析處理并精確定量的rhHSP70與純化的抗原肽結合，得到rhHSP70-抗原肽復合物(濃度為0.1μg/μl)。
(2)本發明的rhHSP70對T細胞γ干擾素(IFN-γ)分泌和特異性CTL靶細胞殺傷活性的影響用胰酶消化處于對數生長期的乳腺癌D2F2細胞(1×108/ml)后，每只動物(雌性6-8周齡BALB/c小鼠，平均體重18～20g)皮下接種D2F2細胞0.1ml(1×107個細胞)。7天后隨機分為下列六組(每組12只動物)1)空白對照組每周兩側腹股溝皮下每側注射PBS 0.1ml，共兩次；2)rhHSP70組每周兩側腹股溝皮下注射，每側注射rhHSP700.1ml(0.1μg/μl)，共兩次；3)GM-CSF+P106-114多肽疫苗組兩側腹股溝皮下注射，每側注射合成多肽P106-1140.1ml(0.1μg/μl，含800ng rhGM-CSF佐劑)，每周一次，共兩次；4)GM-CSF+P369-377多肽疫苗組兩側腹股溝皮下每側注射合成多肽P369-3770.1ml(0.1μg/μl，含800ng rhGM-CSF)，每周一次，共兩次；5)rhHSP70-P106-114多肽復合物組每周兩側腹股溝皮下注射，每側注射rhHSP70-P106-114多肽復合物0.1ml(0.1μg/μl)，共兩次；6)rhHSP70-P369-377多肽復合物組每周兩側腹股溝皮下注射，每側注射rhHSP70-P369-377多肽復合物0.1ml(0.1μg/μl)，共兩次。
第二次免疫后7天，每組隨機選取4只動物，斷頸處死，無菌分離脾淋巴細胞，進行常規T細胞IFN-γ分泌測定(酶聯免疫斑點法)和特異性CTL檢測(細胞毒性T細胞顆粒酶釋放法)。其中按下列公式計算CTL殺傷活性。
CTL殺傷活性(％)＝100％×(檢測孔OD值-空白對照孔OD值)/(酶釋放孔OD值-空白對照孔OD值)由于活化的CTL細胞在體外受到特異抗原刺激后可分泌IFN-γ，因此檢測特異抗原刺激后的T細胞分泌IFN-γ的能力(采用酶聯免疫斑點法，ELISPORT)，即可推測特異性CTL細胞的數目。
T細胞IFN-γ分泌測定結果顯示，與對照組(PBS)相比，rhHSP70組、GM-CSF+P106-114組、GM-CSF+P369-377組、rhHSP70-P106-114組和rhHSP70-P369-377組分泌IFN-γ的小鼠脾細胞數量均明顯增多(P＜0.01)。而且，rhHSP70-P106-114組與GM-CSF+P106-114組、rhHSP70-P369-377組與GM-CSF+P369-377組、rhHSP70-P106-114組與rhHSP70組，以及rhHSP70-P369-377組與rhHSP70組相比，分泌IFN-γ的小鼠脾細胞數目亦明顯增多(P＜0.01)。另外，rhHSP70-P106-114組和rhHSP70-P369-377組相比有統計學差異(P＜0.05)，GM-CSF+P106-114組和GM-CSF+P369-377組相比差異無統計學意義(P＞0.1)。結果參見下列表1和附圖4。
表1rhHSP70-抗原肽復合物對小鼠T淋巴細胞IFN-γ分泌的影響(x±S，n＝4)


GM-CSF粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子。
特異性CTL檢測的結果顯示，與對照組(PBS)相比，GM-CSF+P106-114組、GM-CSF+P369-377組、rhHSP70-P106-114組和rhHSP70-P369-377組免疫刺激產生的特異性CTL細胞對特異靶細胞的殺傷作用明顯增強(P＜0.01)。而且，rhHSP70-P106-114組與GM-CSF+P106-114組、rhHSP70-P369-377組與GM-CSF+P369-377組、rhHSP70-P106-114組與rhHSP70組，以及rhHSP70-P369-377組與rhHSP70組相比，前者產生的CTL細胞對靶細胞的殺傷力亦增強(P＜0.01)。另外，rhHSP70-P106-114組與rhHSP70-P369-377組、GM-CSF+P106-114組與GM-CSF+P369-377組相比，均具有統計學差異(P＜0.05)。而對照組與rhHSP70組相比則差異無統計學意義(P＞0.1)。結果見下列表2和附圖5。
表2實驗小鼠特異性CTL對靶細胞的殺傷率(％)(x±S，n＝4)


(3)本發明的rhHSP70對小鼠腫瘤組織的生長狀況和腫瘤細胞結構的影響二次免疫小鼠后第30天處死動物，稱量瘤重并計算抑瘤率，以分析各種疫苗對腫瘤生長的抑制作用。結果可見，GM-CSF+P106-114組、GM-CSF+P369-377組、rhHSP70-P106-114組和rhHSP70-P369-377組的腫瘤重量和體積明顯低于對照組(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。而且，rhHSP70-P106-114組和rhHSP70-P369-377組的腫瘤重量和體積明顯小于GM-CSF+P106-114組和GM-CSF+P369-377組(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。rhHSP70組和對照組相比腫瘤體積和重量有所減小，但統計學差異不顯著(P＜0.05)。結果參見下列表3和附圖6。
表3rhHSP70-抗原肽復合物疫苗對小鼠D2F2乳腺腫瘤生長的抑制作用(x±S，n＝8)


腫瘤組織切片經HE染色后光鏡下觀察發現，GM-CSF+P106-114組和GM-CSF+P369-377組、rhHSP70-P106-114組和rhHSP70-P369-377組的腫瘤組織可見大面積壞死灶，壞死灶內或周邊可見有白細胞浸潤。壞死灶處的細胞胞漿紅染，細胞結構消失；胞核大部分呈現碎裂，核染色質崩解為小碎片；核膜破裂，染色質碎片分散于胞漿中。部分細胞呈核溶解，核染色較淡，只見核的輪廓，甚至核溶解消失。值得提到的是，在腫瘤組織周邊部也有大量壞死灶，且在rhHSP70-P106-114組和rhHSP70-P36-377組出現了腫瘤組織纖維化現象。PBS組和rhHSP70組小鼠腫瘤組織中則未見大面積壞死(參見附圖7A和7B)。
實施例6rhHSP70的大規模發酵制備及純化(1)最佳pH值的確定選取表達量較高的rhHSP70畢赤酵母工程菌，在10ml YPD培養基中30℃、250rpm震蕩培養約24～36小時。分別取上述未加緩沖液的BMGY 8ml，按下示的量加入1mol/L Na2HPO4和0.5mol/L檸檬酸，以配制成不同pH值的BMGY。混勻后各加入1ml畢赤酵母工程菌，30℃、250rpm震蕩培養約30小時，使其OD600≈5。


室溫離心(3000rpm)5分鐘，棄去上清，并在菌體沉淀物中加入不含緩沖液的BMMY 8ml。然后按如上所示的量加入1mol/L Na2HPO4和0.5mol/L檸檬酸，以配制成不同pH值的BMMY，30℃、250rpm震蕩培養。誘導表達過程中，每24小時補充一次甲醇至終濃度0.5％，同時補充滅菌去離子水，使發酵液總體積保持不變。在培養的第0、24、48、72、96和120小時等時間點各取0.5ml發酵液，離心收集上清進行蛋白質定量分析(SDS-PAGE法)。
(2)其他發酵條件的優化A)將凍存的工程菌在YPD瓊脂(含Zeocin 100μg/ml)板上30℃劃線培養。至菌落直徑達到2mm左右，挑取單克隆菌落加入到10ml YPD培養液(種子培養基)中，30℃、250rpm震蕩培養16～24小時。然后將上述培養物加入到YPD培養液(2L)中，30℃、250rpm震蕩培養約24小時，OD600達到10左右。
B)生物量的積累配制30L FM21培養基，加入80L發酵罐中，高壓滅菌(121℃，30分鐘)。待發酵罐內培養基冷卻到室溫時，用氨水調節FM21培養基的pH至所需數值，而后加入36.75ml PTM1微量元素混合物和13.5ml生物素貯備液。在發酵罐中加入2升上述培養的菌液，開始進行第一階段發酵罐培養(即甘油培養擴增菌體階段)。此階段培養溫度為30℃、攪拌速度500rpm，罐內壓力10psi，DO值(溶解氧)維持在20％以上，必要時通入純氧。在此階段，每天至少取樣2次，測OD600和細胞濕重，分析酵母菌生長狀態，肉眼和鏡下觀察菌液。排除雜菌污染，并留取上清用于蛋白分析。約24小時后DO值上升至接近100％，表明培養基中甘油已消耗殆盡。此時即轉入補充甘油階段，以進一步增加菌體密度。按照每升12mlPTM1微量元素的比例在高壓滅菌后的50％甘油中加入PTM1微量元素。混勻后，將此混合物以18.2ml/h/L初始發酵液(即546ml/h)的速率加入到發酵罐中，至菌體濕重達到180～220g/L。DO值上升至接近100％后，繼續維持“甘油饑餓”狀態30分鐘，然后進入甲醇誘導表達階段。
C)甲醇誘導rhHSP70的合成按照12ml/L的比例，在甲醇中加入PTM1微量元素，混勻后，以3.6ml/h/L初始發酵液(即108ml/小時)的速率加入到發酵罐中誘導表達。維持此低速率2～3小時，以使酵母逐漸適應以甲醇為唯一碳源的成長環境。DO值由波動較大變為相對穩定后，繼續維持此低速率并補加甲醇1小時。
然后加大補充甲醇的速率(7.2ml/h/L)，并將此速率維持2小時后將速率繼續增加至11ml/h/L。同時，監測DO值和發酵液溫度并判斷甲醇是否過量。若停止補充甲醇后的DO值在1分鐘內上升幅度大于10％，說明碳源受限，反之說明甲醇過量。在碳源受限的情況下，須加快補充甲醇的速率；如果甲醇過量則應調慢補甲醇的速率。
開始誘導表達后，每隔6小時取樣，檢測OD600和細胞濕重，借以分析酵母菌的生長狀態。此期間留取培養物上清，用于蛋白定量分析。連續誘導發酵72小時后，結束發酵。取各時間點的發酵液上清，進行SDS-PAGE分析。
實驗結果1)發酵液pH值對rhHSP70發酵產量的影響觀察了在大規模條件下pH值對rhHSP70產率的影響，發現在pH值低于4.0的發酵液上清中，幾乎檢測不到rhHSP70；在pH值4.1～5.0條件下，發酵的第18小時表達量即達到最高峰。繼續延長發酵時間，目的蛋白的表達量逐漸減少，雜蛋白條帶增加。pH值4.8時，在甲醇誘導的第48～54小時，rhHSP70表達量最高，可達1.2g/L。繼續延長發酵時間，rhHSP70的表達量反而減少。
2)溶解氧對rhHSP70發酵表達產量的影響在發酵過程中，發酵液的DO值(溶解氧)應保持在25％～30％之間。溶解氧過高對rhHSP70的表達沒有任何有利的影響，反而會增加生產成本。
3)培養基成分對rhHSP70發酵表達產量的影響本實驗比較了BSM培養基和FM21培養基，結果發現FM21比BSM培養基更適于發酵生產rhHSP70。而且，培養基中添加0.5％(W/V)的蛋白胨可使rhHSP70的表達量略有增加，特別是可使表達峰提前至甲醇誘導表達后的第30～36小時，且雜蛋白含量減少。
4)溫度對rhHSP70發酵表達產量的影響畢赤酵母的最佳生長溫度為30℃，溫度升高達到32℃對畢赤酵母是致命的。有時降低發酵溫度可增加目的蛋白的產量。有報道稱在甲醇誘導階段，溫度從30℃降至25℃，可使克隆到巴氏畢赤酵母中的半乳糖氧化酶的產量增加4倍。對于rhHSP70，在28℃～30℃的溫度下發酵取得了很好的效果。
5)甲醇流加速度對rhHSP70發酵表達的影響雖然畢赤酵母可以以甲醇為唯一碳源生長增殖，但甲醇對畢赤酵母菌而言仍是一種有毒物質，因此其在培養基中的濃度一般不得高于2％。本研究發現，在流加甲醇進行誘導時，盡管在一定范圍內目的蛋白質的表達量與甲醇消耗量呈正相關，但是甲醇的流加速度并非越快越好。就發酵表達rhHSP70而言，以甲醇的最終流加速度為8.5ml/h/L初始發酵液體積為宜，甲醇流加速度過低會延長誘導時間，增加雜蛋白的污染；甲醇流加速度過高也會導致表達量下降和雜蛋白增加。
(3)大規模純化系統及純化方法連續流離心處理經SDS-PAGE和Western引跡分析確定了含量的rhHSP70發酵液。取上清，將pH值調節至6.0，并加入1/20體積的1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)。取500ml發酵上清液，室溫攪拌下分別緩慢加入(NH4)2SO427.5g、56.5g、88g、121g、157g、195g、236g和280.5g，使(NH4)2SO4的飽和度分別達到10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％和80％。將不同硫酸銨飽和度的發酵液上清離心(10000rpm)10分鐘，取離心后的沉淀進行SDS-PAGE和Western印跡分析。結果發現，50％以上飽和度的(NH4)2SO4沉淀中含有rhHSP70。再取500mlpH值調節為6.0的發酵上清液室溫分別加入(NH4)2SO442g、72g、104g、136g，使(NH4)2SO4的飽和度分別為15％、25％、35％、45％。室溫沉淀約2小時后，同上離心。分別用10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％飽和度的(NH4)2SO4溶液沖洗Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水層析樹脂(10倍凝膠體積)，以平衡凝膠。然后分別加入相同(NH4)2SO4飽和度的發酵上清液，進行疏水柱分離，并對洗脫物(用20mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)洗脫)進行SDS-PAGE分析。由此確定rhHSP70疏水層析的最佳(NH4)2SO4飽和度為40％。
用10倍柱體積溶液B平衡SP Sepharose XL陽離子樹脂，用于進一步純化上述疏水層析洗脫的蛋白質溶液(pH4.0)，并用上述洗脫溶液(20mmol/L HAc-NaAc緩沖液、0.5mol·L-1NaCl，pH 4.0)洗脫。用超濾裝置濃縮純化后的rhHSP70，并用10mmol/L磷酸鹽緩沖液(其中含138mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，1mmol/LKCl)倍比稀釋3～5次以除鹽。SDS-PAGE分析確定純化后的蛋白質的純度和濃度，并用Bradford法精確定量。結果表明，經疏水層析和陽離子交換層析純化后，rhHSP70蛋白質的收率約為80％，純度可達95％以上。
序列表<110>吉林圣元科技有限公司<120>用甲基營養酵母生產重組人熱休克蛋白70的方法<140>
<141>
<160>6<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建克隆載體的PCR擴增引物。
<400>1GCATTCGAAA CGATGGCCAA AGCCGC<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建克隆載體的PCR擴增引物。
<400>2CCGGAATTCG CCCCTAATCT ACCTCC<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建表達載體的PCR擴增引物。
<400>3ATACTCGAGA AGAGAATGGC CAAAGCCGCG GCGATC<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建表達載體的PCR擴增引物。
<400>4
GCTCGATCTA GACCTAATCT ACCTCCTCAA TGGT<210>5<211>9<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>化學合成的HER2/neu蛋白的CTL表位抗原肽。
<400>4GlnLeuPheGluAspAsnTyrAlaLeu<210>6<211>9<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>化學合成的HER2/neu蛋白的CTL表位抗原肽。
<400>4LysIlePheGlySerLeuAlaPheLeu
權利要求
1.一種使用甲基營養酵母生產重組人熱休克蛋白70多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養基中培養甲基營養酵母，其中所說的甲基營養酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構建體轉化的(1)甲基可誘導的轉錄啟動子；(2)編碼人熱休克蛋白70的DNA片段；(3)轉錄終止子和(4)可選擇標志，從而以至少250mg/L培養基的濃度得到重組人熱休克蛋白70多肽。
2.根據權利要求
1的方法，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOX1基因。
3.用于表達重組人熱休克蛋白70的甲基營養酵母培養物，該酵母能夠依靠作為碳源和能源的甲醇生長，并且該酵母是被包括甲基可誘導的轉錄啟動子、編碼人熱休克蛋白70的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志的DNA構建體轉化的。
4.用于在巴斯德畢赤酵母中表達重組人熱休克蛋白70多肽的DNA構建體，該構建體包括可操作地連接的元件甲基可誘導的轉錄啟動子、編碼人熱休克蛋白70的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志。
5.根據權利要求
4的構建體，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母，并且甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOX1基因。
6.使用巴斯德畢赤酵母大規模生產重組人熱休克蛋白70多肽的優化的發酵培養條件，特征在于其中發酵溫度維持在28℃～30℃、所使用的pH值為4.1～5.0、發酵液的DO值(溶解氧)保持在25％～30％、并且培養基中添加有0.5％(W/V)的蛋白胨。
7.純化熱休克蛋白70的方法，特征在于依次使用疏水層析和陽離子交換層析技術分離。
專利摘要
本發明涉及蛋白質的生產、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達重組人熱休克蛋白70(hHSP70)，以及優化的大規模工業化發酵生產和純化重組人熱休克蛋白70的方法。
文檔編號C12N15/12GKCN1924001SQ200510017088
公開日2007年3月7日 申請日期2005年8月29日
發明者顏煒群, 馬杰 申請人:吉林圣元科技有限責任公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan