專利名稱:鸚鵡熱衣原體的一種重組主要外膜蛋白及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及鸚鵡熱衣原體的一種重組主要外膜蛋白及其編碼基因與制備方法和應用，特別是涉及鸚鵡熱衣原體的一種重組主要外膜蛋白及其編碼基因與制備方法和在制備疫苗中的應用。
背景技術：
鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci，Cps)能感染各種鳥類、家禽和家畜，引起多種疾病。Spears(1979)曾根據感染的動物種類將29株Cps菌株分為八個生物型，即牛型、羊型、小鼠型、豚鼠型、兔型、貓型和鸚鵡型。KDE Everett等(1999)以16S和23SrRNA基因全長序列分析為依據，提出了一套新的衣原體分類體系，將原來鸚鵡熱衣原體Cps重新分為流產嗜衣原體(Chlamydophila abortus)、鸚鵡嗜衣原體(Chlamydophila psittaci)、豚鼠嗜衣原體(Chlamydophila caviae)和貓嗜衣原體(Chlamydophila falis)四個種，均歸為副衣原體科。Cps是比較常見的導致牛、羊和其它哺乳動物流產的病原體，在患病的母畜中，可通過胎盤屏障，引起宮內感染，嚴重時會對畜牧業造成重大損失。調查表明，我國引種頻繁的國營農牧場、集約化飼養的大、中型畜禽場的Cps感染率在8-50％之間，動物群的流產率和死胎率遠高于安全場，Cps感染以及局部爆發流行已對我國畜牧業形成嚴重威協，爆發流行時經濟損失慘重。因此，對Cps的防治，具有十分重要的意義。
預防Cps感染最好的辦法是免疫接種，目前在我國普遍使用的Cps疫苗是從接種的雞胚中提取并滅活的Cps菌體疫苗，這種疫苗雖然也能起到一定的保護作用，但存在許多弊端，如不易大規模生產、成本高不易推廣、存在變態反應原等。
隨著分子生物學的發展，人們對Cps抗原的結構和功能有了更深入的了解，發現Cps主要外膜蛋白(MOMP)是其種特異性抗原，又是其最主要的保護性抗原。例如利用限制性片段長度多態性方法(RFLP)，兩家實驗室分別對36株和20株反芻動物來源的Cps MOMP基因進行了分析，得出一致結論無論來源如何，所有對小鼠有侵襲力的菌株，其MOMP基因的酶切圖譜表現出嚴格的均一性，而對小鼠無侵襲力的菌株卻有著不同的酶切圖譜，說明感染不同反芻動物的Cps所編碼的MOMP毒力基因基本一致。進一步研究發現Cps的脂多糖(LPS)抗原在機體的免疫應答中不起保護作用，而MOMP是Cps最主要的保護性抗原，用從Cps中提取的LPS和MOMP免疫小鼠，然后用Cps致死劑量進行腹腔接種，結果LPS免疫組小鼠全部死亡，MOMP免疫組得以存活。為確定MOMP作為疫苗的可能性，有人進行了滅活的全菌疫苗和提純的MOMP亞細胞單位疫苗免疫母羊的效果比較，結果兩種疫苗免疫組存活羔羊和流產的比例分別是15∶1和16∶1，而未免疫組的比例是8∶9；另外，感染后恢復期羊血清在免疫印跡實驗中顯示出MOMP抗體的存在，進一步說明了MOMP作為疫苗的保護性作用。
發明內容
本發明的發明人對我國流行的10株Cps MOMP基因進行了克隆和測序，證明我國流行的Cps MOMP基因基本一致，具有高度保守性。在此基礎上，對Cps MOMP保護性抗原進行了克隆表達，獲得了較高的產物表達率。
本發明的目的是提供Cps的一種重組主要外膜蛋白及其編碼基因。
本發明所提供的Cps重組主要外膜蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質。
序列表中序列2的蛋白質由302個氨基酸殘基組成。
Cps重組主要外膜蛋白的編碼基因，是序列表中序列1的DNA序列。
序列1的基因由1058個核苷酸組成，其中自5’到3’端第79位到984位核苷酸為該基因的讀碼框。
含有序列1DNA序列的表達載體及轉基因細胞系均屬于本發明的保護范圍。
本發明的第二個目的是提供Cps重組主要外膜蛋白的制備方法。
鸚鵡熱衣原體的一種重組主要外膜蛋白的制備方法，包括以下步驟1)利用PCR方法對鸚鵡熱全DNA進行擴增，得到目的片段，其引物是15’-ACG CCA TGG ACC CAG CTG AAC CAA GTT T-3’；25’-ACG AAG CTT GAT TGT GGC TTC CCC TAA-3’；2)目的片段導入pET32a(+)載體；3)轉入大腸桿菌DH5a中進行增殖，提取質粒后，再轉入表達型菌體BL21(DE3)中；4)挑取陽性菌落培養，經IPTG誘導表達，收集菌體；5)超聲破碎得到包含體；6)純化得到目的蛋白。
利用本發明提供的基因，可以得到較高的表達產物收獲率，每100ml培養液可收獲重組蛋白17mg，該重組蛋白具有較好的抗原性和免疫原性。
本發明的又一個目的是提供一種能夠有效預防鸚鵡熱的疫苗。
本發明所提供的預防鸚鵡熱感染的疫苗，其活性成分是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質。
為了使疫苗的效果更好，所述疫苗中還可以加有佐劑。加入的佐劑可以是10號礦物油佐劑或福氏佐劑。
本發明疫苗的免疫劑量一般為0.5-1mg/Kg體重。
用本發明Cps重組MOMP為活性成分的疫苗免疫的大耳白家兔產生了對鸚鵡熱衣原體的特異性抗體，第三針免疫后的效價可達1∶10000，用Cps重組MOMP免疫Balb/c小鼠，MTT方法檢測脾淋巴細胞對Cps的特異性增殖反應，結果表明，免疫組脾淋巴細胞對Cps的增殖指數明顯高于佐劑對照組(P＜0.01)。Cps重組MOMP在家兔和小鼠體內可誘導Cps特異性的體液免疫和細胞免疫應答。說明其具有較好的免疫原性，市場應用前景非常廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
具體實施方式
實施例1、鸚鵡熱衣原體主要外膜蛋白的制備1、利用PCR方法對鸚鵡熱全DNA進行擴增，其引物是15’-ACG CCA TGG ACC CAG CTG AAC CAA GTT T-3’；25’-ACG AAG CTT GAT TGT GGC TTC CCC TAA-3’。
2、將目的片段從T載體上切下，與經相同酶切的pET32a(+)載體相連。
3、轉入大腸桿菌DH5a中進行增殖，提取質粒后，再轉入表達型菌體BL21(DE3)中。
4、挑取陽性菌落，菌液和培養液的比例為1∶50，同時加入Amp(1∶1000)，37℃、250rpm搖床培養4小時，至菌液OD600＝0.7-0.9，加入IPTG至終濃度1mM，繼續培養5小時，離心集菌。
5、用超聲緩沖液(50mM NaH2PO4pH7.8，300mM NaCl)重懸菌體沉淀至適當濃度，超聲破碎60分鐘，30秒間歇20秒，超聲次數40次，功率35％。
6、10000rpm離心15分鐘，棄上清(需經SDS-PAGE證實不含目的蛋白后再棄掉)，沉淀即為包含體。
7、生理鹽水重懸沉淀，10000rpm離心15分鐘，棄上清(需經SDS-PAGE證實不含目的蛋白后再棄掉)。
8、生理鹽水重懸沉淀8000rpm離心15分鐘，棄上清(需經SDS-PAGE證實不含目的蛋白后再棄掉)。
9、生理鹽水重懸沉淀，超聲破碎60分鐘，10000rpm離心15分鐘，棄上清(需經SDS-PAGE證實不含目的蛋白后再棄掉)。
10、生理鹽水重懸沉淀，8000rpm離心15分鐘，棄上清(需經SDS-PAGE證實不含目的蛋白后再棄掉)。
11、含8M尿素的緩沖液B(NaH2PO40.1M，Tris-HCl pH8.0，0.01M)重懸沉淀，37℃搖床250rpm助溶3小時。
12、12000rpm離心20分鐘，上清即為含重組蛋白的緩沖液，置含6M尿素的PBS緩沖液中透析4小時以上。
13、轉置含4M尿素的PBS緩沖液中透析4小時以上。
14、轉置含3M尿素的PBS緩沖液中透析4小時以上。
15、轉置含2M尿素的PBS緩沖液中透析4小時以上。
16、轉置含1M尿素的PBS緩沖液中透析4小時以上。
17、轉置含0.5M尿素的PBS緩沖液中透析4小時以上。
18、獲得Cps重組MOMP，生產量為每100ml培養液可收獲重組蛋白17mg。
實施例2、以本發明Cps重組MOMP為活性成分的疫苗對家兔的免疫評價將實施例1所得的Cps重組MOMP稀釋至10μg/ml后用以包被酶聯板比較合適。用此酶聯板測定血清效價。取血清檢測為陰性的大耳白家兔6只，隨機分成實驗組和對照組。大耳白家兔，30日齡，雄性，體重相近約2kg/只，由本院實驗動物中心提供。實驗組用本發明Cps重組MOMP免疫，將制備的Cps重組MOMP與10號礦物油佐劑充分攪拌混勻，制成乳狀膠溶液，腹部皮下多點注射家兔3只，每只注射2mg，間隔20d同樣劑量和部位追加1針，30d時再追加1針，共追加2針，對照組大耳白家兔3只，僅注射10號礦物油佐劑，共免疫3次。比較實驗組及對照組大耳白家兔血清的OD值。結果是免疫前采取的血清1∶200稀釋后檢測，均為陰性；免疫后的血清1∶200稀釋后檢測，對照組的動物均為陰性，實驗組的動物均為陽性，其平均效價為1∶10000。說明本發明的Cps重組MOMP可以在家兔體內誘導產生體液免疫反應。
實施例3、以本發明Cps重組MOMP為活性成分的疫苗對小鼠的免疫評價將實施例1所得的Cps重組MOMP與10號礦物油佐劑充分攪拌混勻，制成乳狀膠疫苗。將Balb/c小鼠隨機分兩組，實驗組9只，腹部皮下多點注射疫苗0.25mg/只，間隔2周，同樣劑量和部位追加免疫1針，共追加2針；對照組3只，僅注射10號礦物油佐劑0.25mg/只。第3針免疫后10天活殺取脾臟進行脾淋巴細胞分離和抗原特異性淋巴細胞增殖反應，具體方法為每組小鼠斷頸處死后取脾臟，置于5％FCS RPMI1640培養液中，經研磨、過濾、洗滌2次，活細胞記數調整細胞濃度為2×105/ml，接種96孔細胞培養板，100μl/孔。然后加入抗原，抗原分別為Cps重組MOMP和Cps菌體蛋白，Cps重組MOMP和Cps菌體蛋白濃度均為10μg/ml，每孔加100μl，每個樣品設3個復孔，37℃ 5％CO2孵箱培養7天。對照不加抗原，每孔加100μl，每樣品設3個復孔，在37℃ 5％CO2孵箱培養72小時。檢測時，每孔棄120μl上清，加四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液10μl，37℃ CO2孵箱6小時，離心去上清。每孔加助溶劑(DMSO)100μl，靜置10分鐘，酶聯儀測OD值(570nm)。計算增殖指數(增殖指數＝實驗組OD值/對照組OD值)，結果用SPSS軟件進行方差統計學分析。結果表明，Cps重組MOMP免疫小鼠后，用Cps重組MOMP和Cps菌體蛋白測定的增殖指數，明顯高于佐劑對照組(P＜0.01)，而免疫組Cps重組MOMP和Cps菌體蛋白之間的增殖指數差異不顯著，Cps重組MOMP免疫小鼠能誘導淋巴細胞增殖反應，說明本發明的鸚鵡熱衣原體重組主要外膜蛋白可以在小鼠體內誘導產生細胞免疫反應。
序列表<160>2<210>1<211>1058<212>DNA<213>衣原體屬鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci，Cps)<400>1atgaaaaaac tcttgaaatc ggcattatta tttgccgcta cgggttccgc tctctcctta 60caagccttgc ctgtagggaa cccagctgaa ccaagtttat taatcgatgg cactatgtgg 120gaaggtgctt caggtgatcc ttgcgatcct tgctctactt ggtgtgatgc tatcagcatc 180cgcgcaggat actacggaga ttatgttttc gatcgtgtat taaaagttga tgtgaataaa 240actttcagcg gcattggcaa gaaacccaca ggatcctctc caaatgactt taaaaatgct 300gaagatagac ccaacgtcgc ttatggcaga catttgcaag actccgaatg gtttacaaat 360gcagctttct tagcgttaaa tatctgggat cgttttgata ttttctgcac attaggcgct 420tctaatgggt acttcaaagc tagttctgcg gcattcaatc tcgttggttt gattggtgtt 480aaaggaaact ccttaacaaa tgaccaactt cccaacgtag ccatcactca aggcgttgtt 540gagttttaca cagatacaac gttctcttgg agcgtaggtg cacgtggagc tctatgggaa 600tgtggttgcg caactttagg agctgaattc caatacgctc aatctaatcc taaaattgaa 660atgttgaatg taatctccag cccagcacaa tttgtggttc acaagcctag aggatacaag 720ggaacgtccg ccaactttcc tttacctgca aatgcaggca cagaggctgc tacggatact 780aaatctgcaa cactcaaata tcatgaatgg caagttggtc tagcactctc ttacagattg 840aacatgttag ttccttacat tggcgtaaac tggtcacgag caacttttga tgccgacact 900atccgcatcg ctcaacctaa attggcctct gctgttatga acttgaccac atggaaccca 960acccttttag gggaagccac aatccttgat acttccaata aattcagtga cttcttacaa 1020atcgcttcga ttcagatcaa caagatgaaa tctagaaa 1058<210>2
<211>302<212>PRT<213>衣原體屬鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci，Cps)<400>2Asn Pro Ala Glu Pro Ser Leu Leu Ile Asp Gly Thr Met Trp Glu1 5 10 15Gly Ala Ser Gly Asp Pro Cys Asp Pro Cys Ser Thr Trp Cys Asp20 25 30Ala Ile Ser Ile Arg Ala Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Val Phe Asp35 40 45Arg Val Leu Lys Val Asp Val Asn Lys Thr Phe Ser Gly Ile Gly50 55 60Lys Lys Pro Thr Gly Ser Ser Pro Asn Asp Phe Lys Asn Ala Glu65 70 75Asp Arg Pro Asn Val Ala Tyr Gly Arg His Leu Gln Ser Glu Trp80 85 90Phe Thr Asn Ala Ala Phe Leu Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe95 100 105Asp Ile Phe Cys Thr Asp Leu Gly Ala Ser Asn Gly Tyr Phe Lys110 115 120Ala Ser Ser Ala Ala Phe Asn Leu Val Gly Leu Ile Gly Val Lys125 130 135Gly Asn Ser Leu Thr Asn Asp Gln Leu Pro Asn Val Ala Ile Thr140 145 150Gln Gly Val Val Glu Phe Tyr Thr Asp Thr Thr Phe Ser Trp Ser155 160 165Val Gly Ala Arg Gly Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Ala Thr Leu
170 175 180Gly Ala Glu Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Asn Pro Lys Ile Glu Met185 190 195Leu Asn Val Ile Ser Ser Pro Ala Gln Phe Val Val His Lys Pro200 205 210Arg Gly Tyr Lys Gly Thr Ser Ala Asn Phe Pro Leu Pro Ala Asn215 220 225Ala Gly Thr Glu Ala Ala Thr Asp Thr Lys Ser Ala Thr Leu Lys230 235 240Tyr His Glu Trp Gln Val Gly Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn245 250 255Met Leu Val Pro Tyr Ile Gly Val Asn Trp Ser Arg Ala Thr Phe260 265 270Asp Ala Asp Thr Ile Arg Ile Ala Gln Pro Lys Leu Ala Ser Ala275 280 285Val Met Asn Leu Thr Thr Trp Asn Pro Thr Leu Leu Gly Glu Ala290 295 300Thr Ile302
權利要求
1.鸚鵡熱衣原體的一種重組主要外膜蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質。
2.鸚鵡熱衣原體的一種重組主要外膜蛋白的編碼基因，是具有序列表中序列1的DNA序列。
3.含有權利要求
2所述基因的表達載體。
4.含有權利要求
2所述基因的轉基因細胞系。
5.鸚鵡熱衣原體的一種重組主要外膜蛋白的制備方法，包括以下步驟1)利用PCR方法對鸚鵡熱全DNA進行擴增，得到目的片段，其引物是15’-ACG CCA TGG ACC CAG CTG AAC CAA GTT T-3’；25’-ACG AAG CTT GAT TGT GGC TTC CCC TAA-3’；2)目的片段導入pET32a(+)載體；3)轉入大腸桿菌DH5a中進行增殖，提取質粒后，再轉入表達型菌體BL21(DE3)中；4)挑取陽性菌落培養，經IPTG誘導表達，收集菌體；5)超聲破碎得到包含體；6)純化得到目的蛋白。
6.一種預防鸚鵡熱感染的疫苗，其活性成分是權利要求
1所述的重組主要外膜蛋白保護性抗原。
專利摘要
本發明公開了鸚鵡熱衣原體的一種重組主要外膜蛋白及其制備方法與應用，本發明所提供的鸚鵡熱衣原體的一種重組主要外膜蛋白是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質，其編碼基因是具有序列表中序列1核苷酸序列的DNA。本發明鸚鵡熱衣原體的一種重組主要外膜蛋白的制備方法，包括以下步驟1)擴增目的片段；2)目的片段導入pET32a(+)載體；3)轉入大腸桿菌DH5a中進行增殖，提取質粒后，再轉入表達型菌體BL21(DE3)中；4)挑取陽性菌落培養，經IPTG誘導表達，收集菌體；5)超聲破碎得到包含體；6)純化得到目的蛋白。本發明的抗原具有非常好的免疫原性，可廣泛用于預防鸚鵡熱疫苗的制備。
文檔編號A61K39/118GKCN1194008SQ02146790
公開日2005年3月23日 申請日期2002年11月8日
發明者端青, 朱虹, 張浩杰, 劉向偉 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan