專利名稱:恥垢分枝桿菌菌苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有免疫調節作用的生物制品，特別是指恥垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)CGMCC NO.0795菌苗，屬于微生物應用技術領域：
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背景技術：
結核病是危害人類健康的重大傳染病之一，多耐藥結核菌的大量出現以及與艾滋病并發使結核病人數急劇增加，對人類的健康形成極大威脅。在已感染結核菌人群中強反應者(結核菌素實驗時，硬結直徑≥15mm或有水泡、壞死，并除去已經發病者)發病幾率極高，被稱為結核感染高危人群。我國目前有近半人口感染了結核菌，其中高危人群達5000萬之多。大量的結核高危人群是個巨大的隱患，他們本身發病率極高，又是潛在的傳染源，如何控制這些人群潛在的內源性復發和外源性再感染，是全球結核病控制的重點之一。
目前國際對結核病的控制方式主要是對未感染人群接種卡介苗預防和對臨床病人采用長期化療。然而，結核病預防沿用多年的卡介苗，其適用對象是尚未感染的健康人群，對已經感染的高危人群無保護作用；長期規則化療又很難被尚未發病的高危人群接受。因此，為高危人群尋找合適的保護手段，對結核病的控制將有重要意義。為此，我們提出新的結核病預防概念現代預防不僅僅指預防病原體對宿主的感染，更應包括預防感染人群的發病。
上個世紀末，國內學者在Stanford教授研究的基礎上，成功研制出M.vaccae菌苗，它在對結核病的輔助治療方面獲得顯著療效，這提示了對結核高危人群采取免疫預防的可能性；然而，M.vaccae菌苗在國外已受到嚴格的專利保護，不利于進一步研究和應用。目前類似的產品還有草分枝桿菌制劑，但其因注射副作用大，不能進行多次注射而影響了作用效果；恥垢分枝桿菌也是一種非致病性、快生長分枝桿菌，對機體有較強的免疫調節作用，國內外尚無該菌苗的報道。
發明內容
本發明的主要目的在于提供一種恥垢分枝桿菌菌苗的液體或凍干制劑的制備方法及其用途。
本發明的目的是通過如下技術方案實現的一種恥垢分枝桿菌菌苗，該菌苗包括恥垢分枝桿菌(MycobacteriumSmegmatis)的裂解產物。
所述的菌苗中的細胞已用高壓蒸汽法裂解。
所述的菌苗包括恥垢分枝桿菌的細胞壁、菌體蛋白和富含細菌DNA具有較強免疫活性的CpG片段的復合物。
所述的復合物為液體菌苗或凍干制劑。
上述恥垢分枝桿菌菌苗是從恥垢分枝桿菌制備的。
所述的恥垢分枝桿菌菌苗的制備方法至少包括如下步驟步驟一菌體培養將液體低溫保藏菌種室溫下溶解，接種于改良羅氏培養基，37℃培養3-7天后轉種于改良羅氏培養基，37℃培養3-5天；步驟二菌體收集待菌體生長至對數期時，以生理鹽水洗下羅氏培養基表面的菌體并將上述菌體以生理鹽水洗滌一次或一次以上，離心收集菌體。離心條件為6000r/min、30min、4℃。
步驟三菌苗制備以生理鹽水或磷酸鹽緩沖液將上述菌體配成所需濃度的菌液，經121℃、15min高壓，裂解菌體，制備細胞勻質。
步驟四成品制備無菌條件下分裝上述細胞勻質，即制得恥垢分枝桿菌液體菌苗，或經冷凍干燥制得恥垢分枝桿菌菌苗的凍干制劑。
所述的改良羅氏培養基的配制方法為(2000ml)將天冬素4.5g、磷酸二氫鉀3.0g、檸檬酸鎂0.65g、硫酸鎂0.3g、馬鈴薯淀粉37.6g、丙三醇15.0ml、蒸餾水750ml混勻后，沸水浴至澄明，10磅20分鐘滅菌，即為基質；將新鮮雞蛋洗凈瀝干，75％酒精中浸泡30分鐘，取出，放入無菌室，晾干；將雞蛋液1250ml打入容器攪勻后經無菌紗布過濾入含基質的大三角瓶中，混勻并加入2％孔雀綠液20ml混勻，倒入廣口瓶中，分裝中管，約7ml/管；最后在87℃-88℃，40分鐘條件下烤干。37℃無菌測定24h后貯存4℃冰箱備用。
上述恥垢分枝桿菌菌苗在制備一種生物制品中的用途為該生物制品可用于預防結核高危人群的內源性復發和外源性再感染；或可用于促進免疫功能處于低下狀態的結核菌感染人群的免疫功能恢復；或可用于抑制免疫功能處于亢進狀態的結核菌感染人群的過強免疫應答。
該生物制品可用于提高正常人群的Th1類免疫應答。
綜上所述，本發明具有如下優點本發明提供的菌苗集中了細菌細胞壁良好佐劑作用、菌體蛋白的抗原特異性及誘導產生細胞因子的作用特點，并富含細菌DNA具有較強免疫活性的CpG片段；解決了國外類似制品菌體顆粒大、液體菌苗易形成菌團的問題，避免或減少了目前常規菌苗注射后可能出現的副作用，提高制品的安全性；可多次注射，解決了國外類似制品皮內途徑只能一次注射或三個月以上長間隔注射效果欠佳的缺點。
本發明涉及的恥垢分枝桿菌菌苗不但可以預防正常人群被結核菌感染，更可經濟、有效地控制結核高危人群潛在的內源性復發和外源性再感染，這對控制結核病的蔓延、提高人類的生活質量具有重要意義。此外，該菌苗對免疫系統介導的皮膚病也有潛在的治療價值。
圖1為陰性對照組(生理鹽水組)豚鼠臟器病變外觀；圖2為本發明恥垢分枝桿菌菌苗預防組豚鼠臟器病變外觀；
圖3為陽性對照組(M.Vaccae菌苗組)豚鼠臟器病變外觀。
具體實施方式
下面將結合附圖和具體實施例來對本發明進行詳細說明恥垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)，已于2002年9月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC NO.0795。
恥垢分枝桿菌菌苗是恥垢分枝桿菌的裂解產物，其制備方法為步驟一菌體培養將液體低溫保藏菌種室溫下溶解，接種于改良羅氏培養基，37℃培養3-7天后轉種于改良羅氏培養基，37℃培養3-5天；步驟二菌體收集待菌體生長至對數期時，以生理鹽水洗下羅氏培養基表面的菌體并將上述菌體以生理鹽水洗滌一次或一次以上，離心收集菌體。離心條件為6000r/min、30min、4℃。
步驟三菌苗制備以生理鹽水或磷酸鹽緩沖液將上述菌體配成所需濃度的菌液，經121℃、15分鐘高壓、裂解菌體，制備細胞勻質。
步驟四成品制備無菌條件下分裝上述細胞勻質，即制得恥垢分枝桿菌液體菌苗，或經冷凍干燥、制得恥垢分枝桿菌菌苗的凍干制劑。
其中，改良羅氏培養基配制方法為(2000ml)首先，將天冬素4.5g、磷酸二氫鉀3.0g、檸檬酸鎂0.65g、硫酸鎂0.3g、馬鈴薯淀粉37.6g、丙三醇15.0ml、蒸餾水750ml混勻后，沸水浴至澄明，10磅20分鐘滅菌，即為基質。
其次，將新鮮雞蛋(約四斤)洗凈瀝干，75％酒精中浸泡30分鐘，取出，放入無菌室，晾干；然后，將雞蛋液1250ml打入瓷杯，攪勻后經無菌紗布過濾入含基質的大三角瓶中，混勻，并加入2％孔雀綠液20ml，混勻，倒入廣口瓶中，分裝中管，約7ml/管，最后在87℃-88℃烤干；37℃無菌測定24h后貯存4℃冰箱備用。
恥垢分枝桿菌菌苗應用于動物的實驗結果恥垢分枝桿菌菌苗預防高危結核的效力實驗以結核強毒菌株腹股溝皮下注射健康豚鼠，建立結核菌感染的高危模型。感染后3天，給每只豚鼠肌肉注射0.1mg恥垢分枝桿菌菌苗進行免疫預防，每周一次，連續4周。同時以生理鹽水作陰性對照組，以M.vaccae菌苗作陽性對照組(恥垢分枝桿菌菌苗和M.vaccae菌苗應用劑量均為一人份/只)。結果觀察感染后第7周，解剖各組豚鼠，觀察肝、脾、肺、淋巴結等各臟器結核病變程度，根據《病理學實驗方法結核菌感染后病變指數標準》以雙盲法進行評分；取各豚鼠的脾臟進行活菌分離；同時取所有動物的肝、脾、肺做病理檢查。各臟器外觀結果如圖1、圖2、圖3所示，其病理評分及活菌分離結果如下表1.豚鼠臟器病變指數(X±SD)
**治療組與對照組比較時，p＜0.01表2.豚鼠脾臟活菌分離數的對數值(X±SD)
病理切片結果為對照組動物的肺、肝、脾多呈廣泛性粟粒樣結核結節或干酪樣壞死。M.vaccae組病變較輕，除有個例呈結核樣病變，多為治療后的類上皮樣結節、或呈現正常的組織切片；恥垢分枝桿菌菌苗預防組病變最輕，呈現非特異性增生、治療后類上皮樣結節、或正常的組織切片。
綜合上述結果，可以看出與對照組比較，恥垢分枝桿菌菌苗同M.vaccae菌苗一樣，可顯著減輕豚鼠臟器的病變程度、降低病理指數、抑制或殺死豚鼠體內的結核菌。
實驗結論為恥垢分枝桿菌菌苗對已經感染結核菌的“高危”豚鼠有預防作用。
恥垢分枝桿菌菌苗的藥理學研究以正常、免疫功能低下和免疫功能亢進的動物模型分別探討了恥垢分枝桿菌菌苗的免疫調節作用及其作用機理。結果發現恥垢分枝桿菌菌苗可提高正常動物的免疫功能，尤其是提高Th1類免疫應答，包括增強T淋巴細胞增殖反應、遲發性超敏反應、提高IL-12和IL-2等Th1類細胞因子和巨噬細胞內殺傷因子(NO)的表達，這對預防結核等細胞內感染的疾病具有重要意義；同時，在免疫功能低下的動物模型中，恥垢分枝桿菌菌苗可促進免疫功能的恢復，在免疫功能亢進的動物模型中，恥垢分枝桿菌菌苗可抑制過強的免疫應答。由此可看出，恥垢分枝桿菌菌苗具有雙向免疫調節功能，這對因感染時期不同而呈現不同免疫狀態的結核菌感染人群的預防有重要意義。
恥垢分枝桿菌菌苗的毒理學研究按新藥臨床前研究的要求，進行了恥垢分枝桿菌菌苗對小鼠的急性毒性實驗、Beagle犬的長期毒性實驗以及豚鼠的全身過敏實驗和家兔的熱源實驗。取3種劑量(分別為人用劑量的25000倍、50000倍、250000倍)，經腹腔、肌肉2種途徑注射小鼠，結果均未引起實驗小鼠的異常癥狀及死亡。取3種劑量(相當于擬臨床人用量的62.5倍、625倍和3125倍時)，給Beagle犬連續肌肉注射14周，在實驗前、中、末期和恢復期，通過一般行為、血常規、血生化、尿常規、心電圖和病理學等指標的檢測，均未發現Beagle犬出現毒性反應。同時，熱源實驗和全身過敏實驗分別證明了恥垢分枝桿菌菌苗無熱源反應、不引起全身速發性變態反應。
總之，恥垢分枝桿菌菌苗實驗結果表明該菌苗可提高正常小鼠的細胞免疫功能，促進免疫功能低下小鼠免疫功能的恢復；抑制免疫功能亢進豚鼠超強的免疫應答；在結核菌感染的動物模型中，該菌苗可顯著抑制已經感染的動物體內結核菌的繁殖、近而減輕臟器的病變程度；在豬血清致敏的動物模型中，該菌苗可顯著抑制模型動物過敏反應的發生；同時，該菌苗具有良好的安全性。
最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求
范圍當中。
權利要求
1.一種恥垢分枝桿菌菌苗的制備方法，其特征在于它至少包括如下步驟步驟一菌體培養將液體低溫保藏恥垢分枝桿菌CGMCC NO.0795菌種室溫下溶解，接種于改良羅氏培養基，37℃培養3-7天后轉種于改良羅氏培養基，37℃培養3-5天；步驟二菌體收集待菌體生長至對數期時，以生理鹽水洗下羅氏培養基表面的菌體并將上述菌體以生理鹽水洗滌一次或一次以上，離心收集菌體，離心條件為6000r/min、30min、4℃；步驟三菌苗制備以生理鹽水或磷酸鹽緩沖液將上述菌體配成所需濃度的菌液，經121℃、15min高壓，裂解菌體，制備細胞勻質；步驟四成品制備無菌條件下分裝上述細胞勻質，制得恥垢分枝桿菌液體菌苗，或經冷凍干燥制得恥垢分枝桿菌菌苗的凍干制劑。
2.根據權利要求
1所述的恥垢分枝桿菌菌苗的制備方法，其特征在于所述的改良羅氏培養基2000ml的配制方法為將天冬素4.5g、磷酸二氫鉀3.0g、檸檬酸鎂0.65g、硫酸鎂0.3g、馬鈴薯淀粉37.6g、丙三醇15.0ml、蒸餾水750ml混勻后，沸水浴至澄明，10磅20分鐘滅菌，作為基質；將新鮮雞蛋洗凈瀝干，75％酒精中浸泡30分鐘，取出，放入無菌室，晾干；將雞蛋液1250ml打入容器攪勻后經無菌紗布過濾入含基質的大三角瓶中，混勻并加入2％孔雀綠液20ml搖勻，倒入廣口瓶中，分裝中管，7ml/管；最后在87℃-88℃，40分鐘條件下烤干，37℃無菌測定24h后貯存4℃冰箱備用。
3.一種權利要求
1或2的制備方法制備的恥垢分枝桿菌菌苗。
4.根據權利要求
3所述的恥垢分枝桿菌菌苗，其特征在于所述的菌苗包括所述恥垢分枝桿菌的細胞壁、菌體蛋白和富含細菌DNA具有較強免疫活性的CpG片段的復合物。
5.一種權利要求
3或4所述的恥垢分枝桿菌菌苗在制備一種生物制品中的用途，該生物制品用于預防結核高危人群的內源性復發和外源性再感染；或用于促進免疫功能處于低下狀態的結核菌感染人群的免疫功能恢復；或用于抑制免疫功能處于亢進狀態的結核菌感染人群的過強免疫應答。
6.根據權利要求
5所述的恥垢分枝桿菌菌苗在制備一種生物制品中的用途，其特征在于該生物制品用于提高正常人群的Th1類免疫應答。
專利摘要
本發明公開了一種恥垢分枝桿菌菌苗，是恥垢分枝桿菌(MycobacteriumSmegmatis)的裂解產物，集中了細菌細胞壁良好佐劑作用、菌體蛋白的抗原特異性及誘導產生細胞因子的作用特點，并富含細菌DNA具有較強免疫活性的CpG片段。該菌苗是通過收集生長于改良羅氏培養基上的恥垢分枝桿菌，用高壓蒸汽法裂解制備得到的。該恥垢分枝桿菌菌苗可用于提高正常人群對結核菌的免疫功能，促進免疫功能處于低下狀態的結核菌感染人群的免疫功能恢復，抑制免疫功能處于亢進狀態的結核菌感染人群的過強免疫應答；尤其用于對結核高危人群的免疫預防。
文檔編號C12N1/20GKCN1234845SQ02130687
公開日2006年1月4日 申請日期2002年9月18日
發明者王國治, 徐苗, 陳保文, 沈小兵, 蘇城 申請人:中國藥品生物制品檢定所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan