通過使用棒狀菌突變株發(fā)酵生產(chǎn)5'－一磷酸黃苷的方法

專利名稱:通過使用棒狀菌突變株發(fā)酵生產(chǎn)5'－一磷酸黃苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的發(fā)酵方法以及其中使用的微生物。
5’-一磷酸黃苷(XMP)是嘌呤核苷酸生物合成的一種中間體并且被用作生產(chǎn)已知作為風味劑[Kuninaka(1960)《日本農(nóng)業(yè)化學協(xié)會雜志》(J.Agr.Chem.Soc.Japan)34，489]的5’-一磷酸鳥苷(GMP)的工業(yè)原料和用于合成藥物的原料[美國專利5,736,530]。
相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的描述已知通過直接發(fā)酵方法生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的方法包括使用棒狀菌(coryneform bacteria)的各種菌株的方法。據(jù)發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌(谷氨酸微球菌)和產(chǎn)氨短桿菌(現(xiàn)被重新命名為產(chǎn)氨棒桿菌)的需要鳥嘌呤或需要腺嘌呤-鳥嘌呤的突變株在合適的發(fā)酵條件下積累了大量的XMP[Misawa等人，1964，《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agr.Biol.Chem.)28，690-693，Misawa等人，1964，《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agr.Biol.Chem.)28，694-699，Demain等人，1965，《Aool.Vicrobiol.》13，757-765；Misawa等人，1969，《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agr.Biol.Chem.)33，370-376]。通過這些菌株積累XMP似乎是由于從細胞中直接分泌出從頭合成的核苷酸，這是因為XMP焦磷酸化酶(黃嘌呤phosphorybosyltransferase)非常少甚至是缺乏的，并且通過生長的細胞并不將外源提供的黃嘌呤轉(zhuǎn)化為XMP[Misawa等人，1964，《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agr.Biol.Chem.)28，694-699]。
此外，據(jù)報道通過具有弱的5’-核苷酸酶活性的枯草芽孢桿菌之需要腺嘌呤或需要腺嘌呤-鳥嘌呤的突變株積累了XMP以及IMP[Akiya等人，1972《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agr.Biol.Chem.)36，227-234]。
之后描述了一種使用具有弱的核苷酸酶活性并且具有更高XMP產(chǎn)率的產(chǎn)氨棒桿菌之腺嘌呤滲漏且需要鳥嘌呤的突變株的方法[Fujio等人，1984，《發(fā)酵技術(shù)雜志》《J.Ferment.Technol.》62，131]。
此外，也已經(jīng)進行了通過賦予產(chǎn)氨棒桿菌的5’-一磷酸黃苷產(chǎn)生菌株其它的特性來提高其產(chǎn)率的嘗試?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過使需要腺嘌呤-鳥嘌呤的突變株對溶菌酶具有敏感性[韓國專利公開號86-248及89-540]或者對細胞壁抑制性抗生素具有抗性[日本專利延遲公開號60-156399A2]就可以極大地提高產(chǎn)氨棒桿菌的5’-一磷酸黃苷產(chǎn)生菌株的產(chǎn)率。
對溶菌酶的敏感性以及對抗生素的抗性顯然與5’-一磷酸黃苷的胞質(zhì)膜滲透性有關(guān)。
眾所周知使微生物細胞處于應(yīng)激(溫度，輻射、饑餓、抑制劑和抗生素)之下的多種處理都會導致RNA和DNA的破壞，繼而分泌出核酸衍生物[A.Demain(1968).“通過發(fā)酵生產(chǎn)嘌呤核苷酸”《工業(yè)微生物學進展》(Progress inIndustrial Microbiology)第18卷，編輯D.J.D.Hockenhull.J.&A.Churchill有限公司，倫敦]。目前通常接受的是代謝物垮過胞質(zhì)膜的滲透一般是由或多或少的特異性流出的轉(zhuǎn)運蛋白介導的[Pao等人，1998《微生物學分子生物學回顧》(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62，1-34；Paulsen等人，1998《分子生物學雜志》(J.Mol.Biol.)277，573-592；Saier等人，1999《分子微生物學生物技術(shù)雜志》(J.Mol.Microbiol.Biothechnol.)(1999)1，257-279]。反之，可以合理地推測出這些轉(zhuǎn)運蛋白可以在應(yīng)激條件下被誘導或激活。據(jù)表明在許多年前[Billen，D.(1957)《Arch.Bichem.Biophys.》67，333-340]，紫外線或X射線照射的大腸桿菌細胞分泌出游離的堿基、核苷、單核苷酸和ATP。由于沒有發(fā)現(xiàn)DNA衍生物或肽，因此這種釋放并非是細胞溶解的結(jié)果。對于釋放最大時需要葡萄糖和無機磷酸鹽并且砷酸鹽或低溫的抑制作用表明其涉及了酶促作用，其中可能包括轉(zhuǎn)運蛋白的合成。
另外，在腺嘌呤滲漏的產(chǎn)氨棒桿菌營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)中錳離子(Mn2+)的缺乏導致對5’-一磷酸肌苷“膜滲透屏障的改變”，從而造成核苷酸大量的積累[Furuya等人，1970《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agr.Biol.Chem.)34，210-217]。之后確定了錳離子的缺乏影響了存在于棒狀菌中依賴于錳的核糖核苷酸還原酶功能，并且誘導了不平衡的生長應(yīng)激[Auling等人，1980《Arch. Microbiol.》127，105-114；Willing等人，1988《歐洲生物化學雜志》(Eur.J.Biochem.)170，603-611]。在這種情況下細胞呈現(xiàn)出絲狀的生長，并且分泌蛋白和一些代謝物到培養(yǎng)基中。
據(jù)認為在過量錳離子存在下由一些產(chǎn)氨短桿菌突變株所致的5’-一磷酸肌苷產(chǎn)率的提高也是由IMP分泌的“滲透性改善”引起的。這些突變株表現(xiàn)出對多種抗生素、洗滌劑、染料和溶菌酶的敏感性有所增加[Teshiba，S.與A.Furuya，1983.《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agr.Biol.Chem.)47，1035-1041]，而這顯然與細菌膜的改變有關(guān)。
另一方面，在枯草芽孢桿菌中，通過引入賦予了對抑制濃度的甲硫氨酸和甲硫氨酸類似物DL-甲硫氨酸亞砜的抗性的突變顯著地提高了鳥苷的生產(chǎn)[Matsui等人，1977《應(yīng)用環(huán)境微生物學》(Appl.Environ.Microbiol.)34，337-341；Matsui等人，1979《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agr.Biol.Chem.)43，1317-1323]。甲硫氨酸亞砜的抗性主要導致5’-核苷酸酶特異性的降低并且通過GMP導致IMP脫氫酶的抑制作用和阻遏作用的部分喪失[Matsui等人，1977《應(yīng)用環(huán)境微生物學》(Appl.Environ.Microbiol.)34，337-341]。而且，由GMP所致的PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶的陽遏和抑制作用也會喪失[Matsui等人，1979《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agr.Biol.Chem.)43，1317-1323]。將IMP轉(zhuǎn)化為XMP的IMP脫氫酶是對GMP合成具有特異性的途徑中的第一種酶，并且通常由GMP調(diào)節(jié)[Nishikawa等人，1967《生物化學雜志》(J.Biochem.)62，92]。PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶是嘌呤核苷酸生物合成途徑中的第一種酶，并且由AMP和GMP調(diào)節(jié)[Nishikawa等人，1967《生物化學雜志》(J.Biochem.)62，92；Sato與Shiio，1970《生物化學雜志》(J.Biochem.)68，763]。但是，從來沒有利用對甲硫氨酸類似物的抗性來改進棒狀菌的XMP產(chǎn)生菌株。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明已經(jīng)考慮了上述觀點，本發(fā)明的一個目的在于提供一種針對工業(yè)目的以高產(chǎn)率生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的更高效的方法以及可以在所述方法中使用的微生物。
為此，本發(fā)明的發(fā)明人在對5’-一磷酸黃苷產(chǎn)生菌進行了大量研究之后，發(fā)現(xiàn)屬于產(chǎn)氨棒桿菌(Coryvebacterium ammoniagenes)的并且具有新近發(fā)現(xiàn)的突變的微生物在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累了相當更多量的5’-一磷酸黃苷，其中所述的突變賦予了對細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯(lián)劑、RNA-聚合酶抑制劑和甲硫氨酸類似物的抗性。對一系列突變株的研究表明對上述化合物的抗性與5’-一磷酸黃苷的積累直接相關(guān)。
迄今，人們沒有認識到5’-一磷酸黃苷的產(chǎn)率可以通過使產(chǎn)生5’-一磷酸黃苷的微生物具有上述特性來提高。
因此基于這一發(fā)現(xiàn)繼續(xù)地工作以完成了本發(fā)明。
于是，本發(fā)明如下(1)棒狀菌，所述的細菌對由抑制劑所致的生長抑制作用具有抗性并且具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力，所述的抑制劑選自細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯(lián)劑、RNA-聚合酶抑制劑和甲硫氨酸類似物。
(2)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對甘氨酸具有抗性。
(3)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對多粘菌素具有抗性。
(4)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對寡霉素具有抗性。
(5)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對羰基氰化間氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrasone)(CCCP)具有抗性。
(6)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對利福平具有抗性。
(7)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對甲硫氨酸類似物具有抗性，其中所述的甲硫氨酸類似物選自DL-甲硫氨酸亞砜。L-甲硫氨酸亞砜、DL-甲硫氨酸砜以及L-甲硫氨酸砜。
(8)根據(jù)上述(1)至(7)之任一的棒狀菌，其中所述的細菌屬于產(chǎn)氨棒桿菌。
(9)根據(jù)(2)的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 10-52(VKPM B-8006)。
(10)根據(jù)(3)的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 101-51(VKPM B-8010)。
(11)根據(jù)(4)的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 67-52(VKPM B-8004)。
(12)根據(jù)(5)的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 97-52(VKPM B-8008)。
(13)根據(jù)(6)的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 93-38(VKPM B-8003)。
(14)根據(jù)(7)的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 11-51(VKPM B-8005)。
(15)根據(jù)(7)的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 47-51(VKPM B-8007)。
(16)一種通過發(fā)酵生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的方法，該方法包括下列步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述(1)至(15)之任一所說的細菌以便在培養(yǎng)物中生產(chǎn)和積累5’-一磷酸黃苷，以及從中回收所述的5’-一磷酸黃苷。
下面將要詳細地解釋本發(fā)明。
通過發(fā)明人以上的發(fā)現(xiàn)，他們認為可以合理地推測出一些影響細胞膜功能、DNA復制、轉(zhuǎn)錄或翻譯機理的突變可能是模擬了應(yīng)激條件并且誘導了特異性轉(zhuǎn)運蛋白活性的增強，從而增加了核酸衍生物、并且更具體地講為5’-一磷酸黃苷的積累。此外，由轉(zhuǎn)運蛋白介導的分泌可能取決于細菌細胞的能級的事實看來，增強ATP再生活性的突變對于5’-一磷酸黃苷產(chǎn)生菌株的改進可能也是有用的。
本發(fā)明的微生物可以通過賦予其特異性抗性而由本身就具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷能力的微生物中獲得。另一方面，本發(fā)明的微生物也可以通過使具有所述特異性抗性的微生物具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力來獲得。
術(shù)語“對細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑具有抗性的細菌”是指這樣一種來源于屬于棒狀菌的細菌菌株的微生物，其中由于親本菌株在遺傳特性上進行了修飾，從而它可以在含有細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑的培養(yǎng)基中生長。術(shù)語“細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑”是指抑制了胞質(zhì)膜生物合成或者影響其正常功能的化合物(例如甘氨酸、多粘菌素、短桿菌肽)。因此，正如本文所使用的那樣，術(shù)語“對由細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑所致的生長抑制作用的抗性”是指突變株能夠在含有作為抑制劑的化合物的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，而所述抑制劑的量可以抑制親本菌株的生長。
例如，通過在瓊脂平板上在32℃下培養(yǎng)，其中所述的瓊脂平板含有40g/L或更多，優(yōu)選50g/L或更多，的甘氨酸、40mg/L或更多，優(yōu)選50mg/L或更多，的多粘菌素、5mg/L或更多，優(yōu)選10mg/L或更多的，短桿菌肽，可以在3-5天內(nèi)形成菌落的微生物對這些藥物具有抗性。
術(shù)語“對磷酸化抑制劑具有抗性的細菌”是指這樣一種來源于屬于棒狀菌的細菌菌株的微生物，其中由于親本菌株在遺傳特性上進行了修飾，從而它可以在含有磷酸化抑制劑的培養(yǎng)基中生長。術(shù)語“磷酸化抑制劑”是指抑制通過F0/F1ATP酶(ATP合酶)由ADP和Pi合成ATP的化合物(例如寡霉素)。因此，正如本文所使用的那樣，術(shù)語“對由磷酸化抑制劑所致的生長抑制作用的抗性”是指突變株能夠在含有作為抑制劑的化合物的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，而所述抑制劑的量可以抑制親本菌株的生長。
例如，通過在瓊脂平板上在32℃下培養(yǎng)，其中所述的瓊脂平板含有50mg/L或更多，優(yōu)選100mg/L或更多，的寡霉素，可以在3天內(nèi)形成菌落的微生物對寡霉素具有抗性。
術(shù)語“對解偶聯(lián)劑具有抗性的細菌”是指這樣一種來源于屬于棒狀菌的細菌菌株的微生物，其中由于親本菌株在遺傳特性上進行了修飾，從而它可以在含有解偶聯(lián)劑的培養(yǎng)基中生長。術(shù)語“解偶聯(lián)劑”是指廢止了呼吸鏈和磷酸化系統(tǒng)之間的專性聯(lián)系的化合物[例如二硝基苯酚、羰基氰化間氯苯腙(CCCP)、對三氟甲氧基羰基氰化苯腙(FCCP)]。因此，正如本文所使用的那樣，術(shù)語“對解偶聯(lián)劑的抗性”是指突變株能夠在含有作為抑制劑的化合物的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，而所述抑制劑的量可以抑制親本菌株的生長。
例如，通過在瓊脂平板上在32℃下培養(yǎng)，其中所述的瓊脂平板含有2mg/L或更多，優(yōu)選4mg/L或更多，的CCCP或FCCP，可以在3天內(nèi)形成菌落的微生物對CCCP或FCCP具有抗性。
術(shù)語“對RNA-聚合酶抑制劑具有抗性的細菌”是指這樣一種來源于屬于棒狀菌的細菌菌株的微生物，其中由于親本菌株在遺傳特性上進行了修飾，從而它可以在含有RNA-聚合酶抑制劑的培養(yǎng)基中生長。術(shù)語“RNA-聚合酶抑制劑”是指抑制了依賴于DNA的RNA聚合酶活性的化合物(例如利福平)。因此，正如本文所使用的那樣，術(shù)語“對RNA-聚合酶抑制劑的抗性”是指突變株能夠在含有作為抑制劑的化合物的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，而所述抑制劑的量可以抑制親本菌株的生長。
例如，通過在瓊脂平板上在32℃下培養(yǎng)，其中所述的瓊脂平板含有5mg/L或更多，優(yōu)選15mg/L或更多，的利福平，可以在3天內(nèi)形成菌落的微生物對利福平具有抗性。
術(shù)語“對甲硫氨酸類似物具有抗性的細菌”是指這樣一種來源于屬于棒狀菌的細菌菌株的微生物，其中由于親本菌株在遺傳特性上進行了修飾，從而它可以在含有甲硫氨酸類似物的培養(yǎng)基中生長。術(shù)語“甲硫氨酸類似物”是指在結(jié)構(gòu)上類似于甲硫氨酸的化合物(DL-甲硫氨酸亞砜、L-甲硫氨酸亞砜、DL-甲硫氨酸砜以及L-甲硫氨酸砜)。因此，正如本文所使用的那樣，術(shù)語“對甲硫氨酸類似物的抗性”是指突變株能夠在含有作為抑制劑的化合物的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，而所述抑制劑的量可以抑制親本菌株的生長。
例如，通過在瓊脂平板上在32℃下培養(yǎng)，其中所述的瓊脂平板含有5g/L或更多，優(yōu)選10g/L或更多，的DL-甲硫氨酸亞砜或L-甲硫氨酸亞砜、或者5g/L或更多，優(yōu)選10g/L或更多，的DL-甲硫氨酸砜成L-甲硫氨酸砜，可以在5天內(nèi)形成菌落的微生物對這些藥物具有抗性。
本發(fā)明中所稱的“棒狀菌”包括迄今為止已被分入短桿菌屬、但目前又被并入棒桿菌屬的細菌[Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981)]，以及包括屬于與棒桿菌屬關(guān)系密切的短桿菌屬的細菌。所述棒狀菌的例子包括以下內(nèi)容產(chǎn)氨棒桿菌(產(chǎn)氨短桿菌)(Corynebacterium ammoniagenes(Brevibacterium ammoniagenes))嗜乙酰乙酸棒桿菌 (Corynebacterium acetoacidophilum)醋谷棒桿菌 (Corynebacterium acetoglutamicum)解堿棒桿菌 (Corynebacterium alkanolyticum)美棒桿菌 (Corynebacterium callunae)谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)百合花棒桿菌 (Corynebacterium lilium(谷氨酸棒桿菌) (Corynebacterium glutamicum))melassecola棒桿菌 (Corynebacterium melassecola)熱產(chǎn)氨棒桿菌 (Corynebacterium thermoaminogenes)力士棒桿菌 (Coryneabcterium herculis)擴展短桿菌 (Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒桿菌) (Corynebacterium glutamicum))黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum(谷氨酸棒桿菌) (Corynebacterium glutamicum))immariophilum短桿菌 (Brevibacterium immariophilum)乳發(fā)酵短桿菌 (Brevibacterium lactofermentum(谷氨酸棒桿菌) (Corynebacterium glutamicum))玫瑰色短桿菌 (Brevibacterium roseum)解糖短桿菌 (Brevibacterium saccharolyticum)生硫短桿菌 (Brevibacterium thiogenitalis)白色短桿菌 (Brevibacterium album)蠟狀短桿菌 (Brevibacterium cerinum)嗜氨微桿菌 (Microbacterium ammoniaphilum)更具體地講，下面給出了這些細菌菌株的具體實例產(chǎn)氨棒桿菌(產(chǎn)氨短桿菌)ATCC6871，ATCC6872，VKPM B-6307嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷棒桿菌ATCC15806解堿棒桿菌ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC15990melassecola棒桿菌ATCC17965熱產(chǎn)氨棒桿菌AJ12340(FERM BP-1539)力士棒桿菌ATCC13868擴展短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC14020黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13826，ATCC14067immariophilum短桿菌ATCC14068乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13665，ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240白色短桿菌ATCC15111蠟狀短桿菌ATCC15112
嗜氨微桿菌ATCC15354除了已經(jīng)提到的特性之外，在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，它們也可以具有其它特異的特性，諸如不同的營養(yǎng)需求、抗藥性、藥物敏感性和藥物依賴性。此外，本發(fā)明的微生物可以通過遺傳重組技術(shù)進行修飾以提高參與5’-一磷酸黃苷生物合成的酶的活性。
在實現(xiàn)本發(fā)明中有用的突變微生物可以通過采用常規(guī)的誘變技術(shù)(諸如紫外線照射、X射線照射、放射性射線照射)以及用化學誘變劑處理隨后通過影印方法進行選擇的突變來獲得。優(yōu)選的誘變劑為N-硝基-N’-甲基-N-亞硝基胍(下文中稱作NTG)。
因此，可能可以使屬于棒狀菌的本身就具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷能力的任何已知菌株(比如產(chǎn)氨棒桿菌)經(jīng)歷上述突變過程之一以獲得突變菌株，然后測試突變菌株以確定其是否滿足本發(fā)明與對抑制劑所致的生長抑制作用的抗性有關(guān)的上述要求并從而適用于本發(fā)明，其中所述的抑制劑為細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯(lián)劑、RNA-聚合酶抑制劑或甲硫氨酸類似物。通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且選出具有比其親本菌株更高產(chǎn)率地生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷能力的菌株來篩選出如上所述突變的菌株，并且在本發(fā)明中使用得到的菌株。
滿足本發(fā)明要求的菌株也可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的遺傳重組技術(shù)來得到。
通過順序選擇或遺傳重組技術(shù)可以在一個菌株中結(jié)合以上提到的抗性特征。
在實踐本發(fā)明的過程中使用的菌株的代表性實例為AGRI45-11(VKPM B-8009)、AGRI101-51(VKPM B-8010)、AGRI10-52(VKPM B-8006)、AGRI67-52(VKPM B-8004)、AGRI97-52(VKPM B-8008)、AGRI11-51(VKPMB-8005)、AGRI47-51(VKPMB-8007)和AGRI93-38(VKPMB-8003)。除了對生長抑制作用的抗性以及以更高的產(chǎn)率生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力之外，其中所述的抑制作用是由細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯(lián)劑、RNA-聚合酶抑制劑或甲硫氨酸類似物所致的，在本發(fā)明生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷中所用的棒狀菌與其親本菌株具有相同的細菌學特性。保藏號(VKPM B-8003-8010)已經(jīng)在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏所(VKPM)中進行了保藏的微生物，該保藏所位于俄羅斯莫斯科的1-st DorozhnyProezd，b.1 VKPM B-8003至8010于2001年7月17日保藏于上述保藏機構(gòu)，并于2001年10月15日按布達佩斯條約由原始保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。
這些菌株來源于作為親本菌株的產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)，該菌株為5’-一磷酸黃苷產(chǎn)生菌產(chǎn)氨棒桿菌AJ13606的鏈霉素抗性衍生菌。依次地，通過將以下一系列突變(即鳥嘌呤滲漏的需要、對高溫的敏感性以及對磺胺胍的抗性)依次引入到菌株AG98-79的基因組中，從5’-一磷酸肌苷產(chǎn)生菌產(chǎn)氨棒桿菌AG98-79得到了菌株產(chǎn)氨棒桿菌AJ13606，其中產(chǎn)氨棒桿菌AG98-79為已知菌株產(chǎn)氨棒桿菌225-5(VKPM B-1073)[俄羅斯專利515783]的衍生菌株。
以上述方法得到的產(chǎn)生5’-一磷酸黃苷的微生物可以以與常規(guī)的微生物培養(yǎng)相同的方式進行培養(yǎng)。因此，對培養(yǎng)基而言，可以使用液體培養(yǎng)基，其中含有一種或多種碳源、一種或多種氮源和金屬離子，并且如果需要的話，還含有其它營養(yǎng)物，比如氨基酸、核酸和維生素。作為碳源，例如可以使用葡萄糖、果糖、核糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、淀粉、淀粉水解物、糖蜜等。作為氮源，可以使用有機氮源(比如胨、玉米漿、大豆粉、酵母提取物以及脲)，此外還可以使用無機氮源(比如硫酸、硝酸、鹽酸、碳酸和其它酸的銨鹽，氨氣和氨水)，它們可以單獨或混合使用。作為其它營養(yǎng)物，適當?shù)剡x出為細菌生長所必須的無機鹽、氨基酸、維生素等并且這些物質(zhì)可以單獨或混合使用。
培養(yǎng)通常是在需氧的條件下進行的。培養(yǎng)基優(yōu)選pH在5至9的范圍內(nèi)。培養(yǎng)溫度通常在25℃至40℃之間進行選擇，以便該溫度適合于所用微生物的生長以及5’-一磷酸黃苷的積累。優(yōu)選進行培養(yǎng)直至5’-一磷酸黃苷的積累基本上達到最大。一般說來，培養(yǎng)1到6天能夠達到此目的。
對于從所得的培養(yǎng)液中分離和回收5’-一磷酸黃苷來說，可以采用本領(lǐng)域公知的常規(guī)純化技術(shù)。
從工業(yè)化的觀點來看，本發(fā)明生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的方法是很有利的，這是因為它導致更為大量地積累了5’-一磷酸黃苷，同時極少地生產(chǎn)出5’-一磷酸肌苷、黃苷或黃嘌呤這類副產(chǎn)物。
實施本發(fā)明的最佳方式下面的實施例目的在于更為具體地解釋本發(fā)明。
實施例1對甘氨酸具有抗性的突變株的選擇濃度介于1至6％之間的甘氨酸通過抑制D-丙氨酰D-丙氨酰連接酶和丙氨酸消旋酶來影響細胞壁的合成。在大腸桿菌中，對甘氨酸耐受性增加的突變株也表現(xiàn)出對青霉素G的敏感性有所增加(Wijsman Pafort，1974《Mol.Gen.Genet.》128，349-357)。因此，通過選擇甘氨酸抗性突變株，有可能獲得在胞外被膜中功能有所扭曲的菌株。這種缺陷可能模擬了應(yīng)激條件并且誘導了參與XMP分泌的轉(zhuǎn)運蛋白。因此，選出了對由甘氨酸所致的生長抑制作用具有抗性的突變株。
用50μg/ml NTG處理產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)20分鐘。然后將細胞平鋪在PYM培養(yǎng)基上，所述培養(yǎng)基具有下列組成(g/L)胨-10.0，酵母提取物-10.0，肉膏-5.0，NaCl-2.5，瓊脂-20.0，并且含有40g/L、或50g/L或者60g/L的甘氨酸。將接種的平板在30℃下培養(yǎng)5天。從呈現(xiàn)出的菌落當中，選出了產(chǎn)率最高的菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI10-52(VKPM B-8006)。
將該菌株以及親本菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)分別在種子培養(yǎng)基中在通氣情況下于32℃下培養(yǎng)20小時，所述的培養(yǎng)基具有下列組成(g/L)葡萄糖-20.0，胨-10.0，酵母提取物-10.0，NaCl-2.5，pH7.2，該培養(yǎng)基盛于20×200mm試管中。然后，將0.3ml所得的培養(yǎng)物接種到盛于20×200mm試管中的3ml具有下列組成(見下文)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且在旋轉(zhuǎn)搖床上在32℃下培養(yǎng)72小時。
在培養(yǎng)后，通過已知的方法測定培養(yǎng)基中XMP的積累量。
結(jié)果示于表1中。如表1所示，對甘氨酸具有抗性的AGRI10-52菌株比起親本菌株積累了更多的XMP。
基本培養(yǎng)基的組成g/L葡萄糖 90.0脲 7.2谷氨酸一鈉鹽 20.0Mamenou(T-N) 1.4KH2PO415.0K2HPO415.0
MgSO4·7H2O 10.0CaCl2·2H2O 0.1MnCl2·4H2O 0.01ZnSO4·7H2O 0.001FeSO4·7H2O 0.01生物素 0.00003泛酸鈣 0.01鹽酸硫胺素 0.005腺嘌呤 0.025鳥嘌呤 0.025pH(用氫氧化鉀調(diào)節(jié)) 7.2表1


注釋+生長；-沒有生長實施例2對多粘菌素B具有抗性的突變株的選擇多粘菌素B是一種有效地抵抗革蘭氏陰性細菌的多肽抗生素。人們認為細菌的細胞膜是所述抗生素的目標。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)高濃度(40-50g/ml)的多粘菌素B抑制了革蘭氏陽性細菌產(chǎn)氨棒桿菌的生長。賦予了對多粘菌素B的抗性的突變可以作用于胞質(zhì)膜并且模擬了應(yīng)激條件，其中包括XMP流出轉(zhuǎn)運蛋白。從而選出對由所述藥物所致的生長抑制作用具有抗性的突變株。
用NTG處理產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)，并且將細胞平鋪在如實施例1所述的PYM培養(yǎng)基上，而所述培養(yǎng)基含有45μg/ml、或50μg/ml、或55μg/ml或者60μg/ml的多粘菌素。將接種的平板在30℃下培養(yǎng)5天。從呈現(xiàn)出的菌落中，選出了產(chǎn)率最高的菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI101-51(VKPM B-8010)。
將該菌株以及親本菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)分別在如實施例1的種子培養(yǎng)基中在通氣情況下于32℃下培養(yǎng)20小時。然后，將0.3ml所得的培養(yǎng)物接種到盛于20×200mm試管中的3ml實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且在旋轉(zhuǎn)搖床上在32℃下培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)后，通過已知的方法測定培養(yǎng)基中XMP的積累量。
結(jié)果示于表2中。如表2所示，對多粘菌素具有抗性的AGRI101-51菌株比起親本菌株積累了更多的XMP。
表2


參見表1的注釋實施例3對利福平具有抗性的突變株的選擇利福平及其衍生物為通過結(jié)合到酶的β-亞單位并阻止轉(zhuǎn)錄開始來抑制依賴于DNA的RNA聚合酶活性的抗生素[Hartman等人，1967《Biochim.Biophys.Acta》145，843-844；Linn等人，1975《細菌學雜志》(J.Bacteriol.)122，1387-1390]。已經(jīng)報道了針對利福平抗性的突變對不同細菌的復合代謝過程具有多效的影響[Kane等人，1979《細菌學雜志》(J.Bacteriol.)137，1028-1030；Jin與Gross，1989《細菌學雜志》(J.Bacteriol.)171，5229-5231；Livshits與Sukhodolets，1973《Genetika》9，102-111]，而這類似于對已經(jīng)條件的響應(yīng)。因此，選出了對由利福平所致的生長抑制作用具有抗性的突變株并且測試了它的XMP的產(chǎn)率。
將親本菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)劃線接種到實施例1的PYM培養(yǎng)基上，所述培養(yǎng)基含有5、15、30或50μg/ml的利福平(而非甘氨酸)，并且將接種的平板在34℃下培養(yǎng)3天。從自發(fā)呈現(xiàn)出的菌落中選出對利福平具有抗性的突變株。在這些突變株中，選出產(chǎn)率最高的菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI93-38(VKPM B-8003)。
將該菌株以及親本菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)分別在如實施例1的種子培養(yǎng)基中在通氣情況下于32℃下培養(yǎng)20小時。然后，將0.3ml所得的培養(yǎng)物接種到盛于20×200mm試管中的3ml實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且在旋轉(zhuǎn)搖床上在32℃下培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)后，通過已知的方法測定培養(yǎng)基中XMP的積累量。
結(jié)果示于表3中。如表3所示，對利福平具有抗性的AGRI93-38菌株比起親本菌株積累了大約多出10％的XMP。
表3


參見表1的注釋實施例4對寡霉素具有抗性的突變株的選擇寡霉素是一種眾所周知的磷酸化抑制劑，它通過F0/F1ATP酶阻礙ATP的合成?？朔怂隹股刈饔玫耐蛔兛赡芤呀?jīng)提高了產(chǎn)生ATP的活性。反過來，產(chǎn)生ATP的激活可能對轉(zhuǎn)運蛋白介導的嘌呤核苷酸的分泌具有積極的作用。
采用實施例1所述的步驟，從菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)中選出對50或100μg/ml寡霉素具有抗性的一系列突變株，只是其中使用了寡霉素而非甘氨酸。它們中的一些證實了要比親本菌株的產(chǎn)率高。當如實施例1進行平行測定時，最佳突變株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI67-52(VKPM B-8004)比起親本菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)積累了大約多出22％的XMP。
表4


參見表1的注釋實施例5對羰基氰化間氯苯腙具有抗性的突變株的選擇羰基氰化間氯苯腙(CCCP)是眾所周知的解偶聯(lián)劑，它廢止了呼吸鏈和磷酸化系統(tǒng)之間的專性聯(lián)系。克服了所述藥物的這種作用的突變可以增強細胞的能量代謝并提高了產(chǎn)生ATP的活性。反過來，產(chǎn)生ATP的激活可能對轉(zhuǎn)運蛋白介導的嘌呤核苷酸的分泌具有積極的作用。
用NTG處理產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)，并將細胞平鋪到如實施例1的PYM培養(yǎng)基上，其中所述培養(yǎng)基含有2、4或6μg/ml的CCCP、而非甘氨酸。將接種的平板在30℃下培養(yǎng)5天。從呈現(xiàn)出的菌落當中，選出產(chǎn)率最高的菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI97-52(VKPM B-8008)。將該菌株以及親本菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPMB-8009)分別在如實施例1的種子培養(yǎng)基中在通氣情況下于32℃下培養(yǎng)20小時。然后，將0.3ml所得的培養(yǎng)物接種到盛于20×200mm試管中的3ml實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且在旋轉(zhuǎn)搖床上在32℃下培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)后，通過已知的方法測定培養(yǎng)基中XMP的積累量。
結(jié)果示于表5中。如表5所示，菌株AGRI97-52比起親本菌株積累了大約多出15％的XMP。
表5


參見表1的注釋實施例6對甲硫氨酸亞砜具有抗性的突變株的選擇高濃度的DL-甲硫氨酸及其類似物、谷氨酰胺拮抗劑、DL-甲硫氨酸亞砜抑制了XMP產(chǎn)生菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPMB-8009)的生長。已知枯草芽孢桿菌的甲硫氨酸亞砜抗性突變株生產(chǎn)鳥苷的能力有所改善(Matsui等人，《應(yīng)用環(huán)境微生物學》(Appl.Environ.Microbiol.)34，337-341，1977；Matsui等人，《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agric.Biol.Chem.)43(6)，1317-1323，1979；Matsui等人，《農(nóng)業(yè)生物化學》(Agric.Biol.Chem.)46(9)，2347-2352，1982)。從而得到了對所述類似物具有抗性的突變株。
如實施例1那樣用NTG處理產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPMB-8009)，將等分試樣引入到20×200mm試管中，并于32℃下在旋轉(zhuǎn)搖床上在具有下列組成(見下文)的基本培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)20小時。然后收集細胞并將其平鋪在含有瓊脂以及若干種抑制劑組合的基本培養(yǎng)基上1.DL-甲硫氨酸亞砜(5mg/ml)+DL-甲硫氨酸(7.5mg/ml)；2.DL-甲硫氨酸亞砜(10mg/ml)+DL-甲硫氨酸(7.5mg/ml)；3.DL-甲硫氨酸亞砜(5mg/ml)+DL-甲硫氨酸(20mg/ml)；4.DL-甲硫氨酸亞砜(10mg/ml)+DL-甲硫氨酸(20mg/ml)；基本培養(yǎng)基的組成g/L葡萄糖 20.0脲 2.0KH2PO41.0K2HPO43.0MgSO4·7H2O 0.3CaCl2·2H2O 0.1MnCl2·4H2O 0.0036ZnSO4·7H2O 0.001FeSO4·7H2O 0.01生物素 0.00003泛酸鈣 0.01鹽酸硫胺素 0.005腺嘌呤 0.025鳥嘌呤 0.025pH(用氫氧化鉀調(diào)節(jié)) 7.2瓊脂(在固體培養(yǎng)基中) 20.0將培養(yǎng)了4至8天后出現(xiàn)的突變株挑出并且測試其XMP的產(chǎn)率。在這些菌株當中，選出菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI11-51(VKPM B-8005)。將該菌株以及親本菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)分別在如實施例1的種子培養(yǎng)基中在通氣情況下于32℃下培養(yǎng)20小時。然后，將0.3ml所得的培養(yǎng)物接種到盛于20×200mm試管中的3ml實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且在旋轉(zhuǎn)搖床上在32℃下培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)后，通過已知的方法測定培養(yǎng)基中XMP的積累量。結(jié)果示于表6中。如表6所示，菌株AGRI11-51比起親本菌株積累了大約多出31％的XMP。
表6


參見表1的注釋實施例7對甲硫氨酸砜具有抗性的突變株的選擇高濃度的另一種甲硫氨酸類似物、即DL-甲硫氨酸砜也抑制了XMP產(chǎn)生菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)的生長。采用實施例6所述的步驟得到了對所述類似物具有抗性的突變株，其中除了僅僅采用了下列抑制劑的組合DL-甲硫氨酸砜(10mg/ml)+DL-甲硫氨酸(20mg/ml)。
在培養(yǎng)了4至8天后出現(xiàn)的突變株當中，選出菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI47-51(VKPMB-8007)。將該菌株以及親本菌株產(chǎn)氨棒桿菌AGRI45-11(VKPMB-8009)分別在如實施例1的種子培養(yǎng)基中在通氣情況下于32℃下培養(yǎng)20小時。然后，將0.3ml所得的培養(yǎng)物接種到盛于20×200mm試管中的3ml實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且在旋轉(zhuǎn)搖床上在32℃下培養(yǎng)72小時。結(jié)果示于表7中。
表7


參見表1的注釋如表7所示，AGRI47-51菌株比起親本菌株積累了大約多出36％的XMP。
權(quán)利要求
1.棒狀菌，所述的棒狀菌對由抑制劑所致的生長抑制作用具有抗性并且具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力，所述的抑制劑選自細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯(lián)劑、RNA-聚合酶抑制劑和甲硫氨酸類似物。
2.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對甘氨酸具有抗性。
3.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對多粘菌素具有抗性。
4.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對寡霉素具有抗性。
5.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對羰基氰化間氯苯腙(CCCP)具有抗性。
6.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對利福平具有抗性。
7.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的能力并且對甲硫氨酸類似物具有抗性，其中所述的甲硫氨酸類似物選自DL-甲硫氨酸亞砜、L-甲硫氨酸亞砜、DL-甲硫氨酸砜以及L-甲硫氨酸砜。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1至7之任一項的棒狀菌，其中所述的細菌屬于產(chǎn)氨棒桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求
2的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 10-52(VKPM B-8006)。
10.根據(jù)權(quán)利要求
3的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 101-51(VKPM B-8010)。
11.根據(jù)權(quán)利要求
4的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 67-52(VKPM B-8004)。
12.根據(jù)權(quán)利要求
5的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 97-52(VKPM B-8008)。
13.根據(jù)權(quán)利要求
6的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 93-38(VKPM B-8003)。
14.根據(jù)權(quán)利要求
7的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 11-51(VKPM B-8005)。
15.根據(jù)權(quán)利要求
7的棒狀菌，其中所述的細菌為產(chǎn)氨棒桿菌AGRI 47-51(VKPM B-8007)。
16.一種通過發(fā)酵生產(chǎn)5’-一磷酸黃苷的方法，該方法包括下列步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求
1至15之任一項的細菌以便在培養(yǎng)物中生產(chǎn)和積累5’-一磷酸黃苷，以及從中回收所述的5’-一磷酸黃苷。
專利摘要
通過培養(yǎng)細菌以及從中回收5’－一磷酸黃苷來生產(chǎn)5’－一磷酸黃苷,其中所述的細菌對生長抑制作用具有抗性并且具有生產(chǎn)5’－一磷酸黃苷的能力以便在培養(yǎng)物中生產(chǎn)和積累5’－一磷酸黃苷,而所述的抑制作用是由選自細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯(lián)劑、RNA—聚合酶抑制劑和甲硫氨酸類似物組成的抑制劑導致的。
文檔編號C12P19/00GKCN1362524SQ01130250
公開日2002年8月7日 申請日期2001年11月22日
發(fā)明者V·A·里希特斯, L·A·卡澤里諾瓦, S·V·格龍斯基, E·A·庫圖科瓦, N·P·扎卡塔瓦 申請人:味之素株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan