專(zhuān)利名稱(chēng)：:一種t載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種T載體的制備方法，特別是用內(nèi)切酶消化前T載體得到T載體的方法。
背景技術(shù)：
：T/A”克隆法(Clark，J.M.Novelnon-templatednucleotideadditionreactionscatalyzedbyprocaryoticandeucaryoticDNApolymerases.NucleicAcidsRes.1988，16，9677-86；Holton，T.A.andGraham，M.W.AsimpleandefficientmethodfordirectcloningofPCRproductsusingddT-tailedvectors.NucleicAcidsRes.1991，19，1156；Marchuk，D.，Drumm，M.，Saulino，A.andCollins，F(xiàn).S.ConstructionofT-vectors，arapidandgeneralsystemfordirectcloningofunmodifiedPCRproducts.NucleicAciddsRes.1991，19，1154；Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.andSmith，L.M.AuniversalmethodforthedirectcloningofPCRamplifiednucleicacid.Biotechnology(NY).1991，9，657-63)是伴隨著PCR技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種克隆方法。由于Taq酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性可以在幾乎任何雙鏈DNA分子的3’端加上一個(gè)突出的“A”(Clark，J.M.Novelnon-templatednucleotideadditionreactionscatalyzedbyprocaryoticandeucaryoticDNApolymerases.NucleicAcidsRes.1988，16，9677-86)，因此人們開(kāi)發(fā)出一種3’端帶一突出“T”的載體——T載體，以用于克隆Taq酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物或其它以Taq酶做A-tailing操作的線性DNA片段。目前用到的T載體一般是商品化的載體，其構(gòu)建策略不同廠商各有不同(Holton，T.A.andGraham，M.W.AsimpleandefficientmethodfordirectcloningofPCRproductsusingddT-tailedvectors.NucleicAcidsRes.1991，19，1156；Marchuk，D.，Drumm，M.，Saulino，A.andCollins，F(xiàn).S.ConstructionofT-vectors，arapidandgeneralsystemfordirectcloningofunmodifiedPCRproducts.NucleicAcidsRes.1991，19，1154)，主要分為兩類(lèi)1.在高濃度的dTTP的存在下，被產(chǎn)平末端的內(nèi)切酶消化后的載體與Taq酶溫育，由于Taq酶在不存在dATP的情況下有相對(duì)良好的3’末端加“T”能力，因此可以在線性化載體的平滑末端的3’端添加一個(gè)“T”，制成T載體。2.在ddTTP的存在下，具平滑末端的載體與末端轉(zhuǎn)移酶溫育，由于ddTTP不含3’-OH，因此末端轉(zhuǎn)移酶只能在載體的3’端加上一個(gè)“T”，構(gòu)成T載體。以上方法制得的T載體由于有生產(chǎn)廠商的嚴(yán)格質(zhì)量控制，其效率可達(dá)70％或更高(PromegaCatalog&TechnicalReference2000-01)，可以滿(mǎn)足常規(guī)的克隆操作。但由于其操作步驟較多，質(zhì)量不容易控制，因此只應(yīng)用于幾種常見(jiàn)載體如pUC18，pGEM等，而且須由專(zhuān)業(yè)的公司來(lái)生產(chǎn)。一類(lèi)產(chǎn)3’末端單核苷酸突出的限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列為T(mén)載體的簡(jiǎn)易制作提供了素材(Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.andSmith，L.M.AuniversalmethodforthedirectcloningofPCRamplifiednucleicacid.Biotechnology(NY).1991，9，657-63)。將這種識(shí)別序列反向重復(fù)的插入載體，并且將切割位點(diǎn)5’上游的第一個(gè)堿基設(shè)為T(mén)(即序列切開(kāi)后的3’末端突出堿基為T(mén))，便得到一前T載體，相應(yīng)的酶切處理可使前T載體轉(zhuǎn)變成含3’末端突出一個(gè)T的成熟T載體。已嘗試過(guò)用這一方法得到T載體的相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶有XcmI，Hphi，Eaml105I或其同裂酶AspEI等(Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.andSmith，L.M.AuniversalmethodforthedirectcloningofPCRamplifiednucleicacid.Biotechnology(NY)，1991，9，657-63；Ichihara，Y.andKurosawa，Y.ConstructionofnewTvectorsfordirectcloningofPCRproducts.Gene，1993，130，153-4；Testori，A.，Listowsky，I.andSollitti，P.DirectcloningofunmodifiedPCRproductsbyexploitinganengineeredrestrictionsite.Gene，1994，143，151-2；Cha，J.，Bishai，W.andChandrasegaran，S.NewvectorsfordirectcloningofPCRproducts.Gene，1993，136，369-70；IdoE，HayamiMConstructionofT-tailedvectorsderivedfromapUCplasmidarapidsystemfordirectcloningofunmodifiedPCRproducts.BiosciBiotechnolBiochem.1997，61，766-7；Arashi-Heese，N.，Miwa，M.andShibata，H.XcmIsite-containingvectorfordirectcloningandinvitrotranscriptionofPCRproduct.MolBiotechnol.1999，12，281-3；Schutte，B.C.，Ranade，K.，Pruessner，J.andDracopoli，N.OptimizedconditionsforcloningPCRproductsintoanXcmIT-vector.Biotechniques，1997，22，40-2；Vries，E.pUCPCR1AvectorfordirectcloningofPCRproductsinadoubleXcm1restrictionsiteofferingcompatiblesingle3′-overhangingTresidues.MolBiotechnol.1998，10，273-4；Borovkov，1997，A.Y.andRivkin，M.I.XcmI-containingvectorfordirectcloningofPCRproducts.Biotechniques，22，812-4；Testori，A.andSollitti，P.CloningunmodifiedPCRproductsusingengineeredXcmIrestrictionsitesinaportablecassette.MethodsMolBiol.1997，67，89-100)。但值得指出的是，目前用這一方法制作的T載體其克隆效率介于14-50％之間，質(zhì)量不穩(wěn)定。其中一個(gè)重要的原因是市售內(nèi)切酶所含殘余外切酶活性對(duì)目的T載體的影響。由于顯易見(jiàn)的原因，含單核苷酸突出末端的T載體比含多核苷酸粘性末端的載體對(duì)外切酶活性的影響更為敏感。而在這類(lèi)T載體的制作中，為降低背景，提高克隆效率，過(guò)消化(overdigestion)是通常采用的一種策略，這使得殘余外切酶活性對(duì)目的T載體的影響變得更為顯著，從而明顯降低所得T載體的質(zhì)量，并使其變得不穩(wěn)定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的構(gòu)建T載體的方法，該方法可最大限度抑制殘余外切酶活性對(duì)所得T載體的影響，從而解決上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題。本發(fā)明提供的制備T載體的方法，是將兩個(gè)產(chǎn)3’末端單核苷酸突出的內(nèi)切酶識(shí)別序列以反向重復(fù)方式插入自身不含相應(yīng)內(nèi)切酶識(shí)別序列的載體，而且切割位點(diǎn)5’上游的第1個(gè)堿基設(shè)為T(mén)(即序列切開(kāi)后的3’末端突出堿基為T(mén))，得到前T載體，用內(nèi)切酶過(guò)消化(overdigestion)該前T載體，得到成熟T載體；其特征是用內(nèi)切酶過(guò)消化前T載體時(shí)，在酶切反應(yīng)體系中添加至少10倍于前T載體摩爾濃度的外切酶競(jìng)爭(zhēng)性底物(ExonucleaseCompetitiveSubstrate，簡(jiǎn)稱(chēng)ECS)。添加外切酶競(jìng)爭(zhēng)性底物可以抑制市售內(nèi)切酶所含殘余外切酶活性對(duì)所得T載體的影響。所說(shuō)的外切酶競(jìng)爭(zhēng)性底物為線性單鏈或雙鏈寡DNA；最好為較短(約5-50個(gè)堿基或堿基對(duì))的線性單鏈或雙鏈寡DNA，以使得在不過(guò)度增加過(guò)消化體系中總DNA濃度的條件下，提供足夠的DNA末端以抑制殘余外切酶活性對(duì)所得T載體的影響。DNA外切酶的底物是非特異性的線形DNA的末端。因此在制作T載體的過(guò)消化體系中添加一些小分子寡DNA做為外切酶的競(jìng)爭(zhēng)性底物，可以起到與目的T載體競(jìng)爭(zhēng)殘余外切酶活性部位的作用，從而可抑制外切酶活性對(duì)目的T載體的影響?？紤]到一般現(xiàn)有載體都長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)Kb，是ECS的上百倍，因此本發(fā)明一般在過(guò)消化體系中添加與前T載體質(zhì)量相當(dāng)?shù)腅CS，在不過(guò)度增加總DNA濃度的情況下，使ECS的末端濃度達(dá)到目的T載體的十至上百倍，從而最大程度的抑制了殘余外切酶活性對(duì)目的T載體的影響，保證了所得T載體的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)證明按本發(fā)明方法可生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定，克隆效率極高的優(yōu)質(zhì)T載體而且該方法操作簡(jiǎn)單，易控制，具有普遍的應(yīng)用意義。圖1是HphI-XcmI接頭序列(SequenceoftheHphI-XcmIlinker)結(jié)構(gòu)示意圖。該接頭含兩個(gè)以反向重復(fù)排列的HphI、XcmI識(shí)別序列串聯(lián)體GGTGACCANNNNTNNNNTGG(N示A、T、C、G四種堿基中的任意堿基)；接頭兩末端分別是EcoRI和SaiI所對(duì)應(yīng)的粘性末端，為克隆入相應(yīng)載體提供方便；接頭中間還有一EcoRV識(shí)別位點(diǎn)，為以后的重組克隆篩選提供方便。圖2是重組質(zhì)粒pUC-HX(前T載體)的EcoRV酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。M示分子量Marker；泳道1為未消化的質(zhì)粒pUC-HX泳道2為EcoRV消化后的pUC-HX；泳道3為EcoRV消化后的質(zhì)粒pUC18。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1.質(zhì)粒pUC-HX(前T載體)的構(gòu)建按圖l所示的序列用常規(guī)方法合成HphI-XcmI接頭序列。接頭的兩條鏈分別合成，再分別溶于雙蒸水后，等摩爾混合，37℃退火15分鐘，即可得到全長(zhǎng)為60bp的雙鏈HphI-XcmI接頭(如圖1所示)。該接頭含兩個(gè)以反向重復(fù)方式排列的HphI、XcmI識(shí)別序列串聯(lián)體GGTGA(NNNNT/NNNN)(序列中內(nèi)切酶XcmI的切割位點(diǎn)5’上游第一個(gè)堿基被設(shè)為T(mén))，內(nèi)切酶XcmI消化含該接頭的載體可得到成熟T載體。將上述合成的DNA接頭HphI-XcmI插入到質(zhì)粒pUC18的EcoRI+SalI窗口，連接、轉(zhuǎn)化后便得到重組質(zhì)粒pUC-HX，其酶切分析(如圖2所示)和測(cè)序結(jié)果均表明插入正確。實(shí)施例2.ECS的合成按常規(guī)方法合成兩條外切酶競(jìng)爭(zhēng)性底物ECS1和ECS2，其具體序列分別為5’p-CCAGCGCTGGT和5’-CAAGAATTCATGGAATTTGGCAACCTA。ECS1是一含5’磷酸基團(tuán)的11個(gè)核苷酸的具回文結(jié)構(gòu)的寡DNA分子，在37℃的過(guò)消化體系中可彼此配對(duì)形成含與T載體相似的DNA末端的雙鏈結(jié)構(gòu)。ECS2是一27個(gè)核苷酸的普通PCR引物(不含5’磷酸基團(tuán))，在37℃的過(guò)消化體系中可保持單鏈結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3.載體pUC-HX-T(T載體)的獲得在分別添加ECS1和ECS2以及不添加外切酶競(jìng)爭(zhēng)性底物的三種情況下，分別用限制性?xún)?nèi)切酶XcmI消化載體pUC-HX得到成熟T載體pUC-HX-T。酶切反應(yīng)體系如下pUC-HX2μg外切酶競(jìng)爭(zhēng)性底物(ECS1/ECS2)2μg/NULLXcmI15UBuffer2(NEB)10μlddH2O至終體積100μl37℃反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，酚抽使酶失活。酶切產(chǎn)物跑1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收大小約為2.7kb的DNA片段(參照QIAGEN膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū))，即為載體pUC-HX-T。實(shí)施例4.載體pUC-HX-T的克隆效率測(cè)試1.連接反應(yīng)以Taq酶擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物為外源片段，載體pUC-HX-T和外源片段按摩爾比1∶5的量加入連接反應(yīng)體系，以TaKaRa公司提供的連接試劑盒DNALigationKitVer.2作連接，16℃反應(yīng)過(guò)夜。2.克隆效率測(cè)定參照《分子克隆》第二版。以E.coliTop10為受體菌用氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后涂布于LB(Amp+)瓊脂板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；從平板上隨機(jī)挑選一定數(shù)量克隆做擴(kuò)大培養(yǎng)，提取其中質(zhì)粒做酶切分析，鑒定是否含目的插入片段。分別以長(zhǎng)為1.3kb和0.5kb的Taq酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為外源片段對(duì)實(shí)施例3三種體系中(不加ECS和分別加ECS1，ECS2)制得的載體pUC-HX-T分別做克隆效率測(cè)試，并以商品化的T載體pMD18-T(購(gòu)自TaKaRa公司)為對(duì)照。具體結(jié)果如表1和表2所示。從表1和表2可看出過(guò)消化體系中ECS的添加對(duì)所得T載體的質(zhì)量有明顯影響，可顯著提高所得T載體的克隆效率，并使其效率保持較為穩(wěn)定；分別添加ECS1和ECS2的體系中生產(chǎn)出的T載體其克隆效率無(wú)明顯差別，說(shuō)明殘余外切酶活性作用的非特異性，單鏈寡DNA(ECS2)或雙鏈寡DNA(ECS1)對(duì)所得T載體有幾乎同樣的保護(hù)效果；添加了ECS的過(guò)消化體系中生產(chǎn)出的T載體具有略高于商品化的T載體pMD18-T的克隆效率。因此，應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定、優(yōu)良的T載體切實(shí)可行。表1.三種體系中制得的載體pUC-HX-T和pMD18-T對(duì)長(zhǎng)為1.3kb的A-tailedPCR產(chǎn)物的克隆效率比較表2.三種體系中制得的載體pUC-HX-T和pMD18-T對(duì)長(zhǎng)為0.5kb的A-tailedPCR產(chǎn)物的克隆效率比較權(quán)利要求1.一種T載體的制備方法，將兩個(gè)產(chǎn)3’末端單核苷酸突出的內(nèi)切酶識(shí)別序列以反向重復(fù)方式插入自身不含相應(yīng)酶切位點(diǎn)的載體，而且將識(shí)別序列中切割位點(diǎn)5’上游的第1個(gè)堿基設(shè)為T(mén)，得到前T載體，用內(nèi)切酶過(guò)消化該前T載體，得到成熟T載體；其特征是用內(nèi)切酶過(guò)消化前T載體時(shí)，在酶切反應(yīng)體系中添加至少10倍于前T載體摩爾濃度的外切酶競(jìng)爭(zhēng)性底物。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說(shuō)的外切酶競(jìng)爭(zhēng)性底物為線性單鏈或雙鏈寡DNA。3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所說(shuō)的外切酶的競(jìng)爭(zhēng)性底物為5～50個(gè)堿基的線性單鏈寡DNA或5～50個(gè)堿基對(duì)的線性雙鏈寡DNA。專(zhuān)利摘要本發(fā)明涉及一種用內(nèi)切酶消化前T載體得到T載體的方法。本發(fā)明應(yīng)用單鏈或雙鏈寡DNA作為外切酶的競(jìng)爭(zhēng)性底物，在不過(guò)度增加總DNA濃度的情況下，向生產(chǎn)T載體的過(guò)消化體系中添加至少10倍于前T載體摩爾濃度的外切酶競(jìng)爭(zhēng)性底物以抑制外切酶活性對(duì)所得T載體的影響，從而得到質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)良T載體。文檔編號(hào)C12N15/09GKCN1142279SQ01129854公開(kāi)日2004年3月17日申請(qǐng)日期2001年11月2日發(fā)明者王珣章,賀雄雷,付捷,龍綮新,王章申請(qǐng)人:中山大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan