專利名稱:一株產(chǎn)韌皮纖維脫膠酶的菌株及其在苧麻、大麻脫膠上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)韌皮纖維脫膠酶的菌株及其在苧麻、大麻脫膠中的應(yīng)用。
(二)技術(shù)背景半個(gè)多世紀(jì)以來，人們?cè)噲D改變采用化學(xué)脫膠工藝所帶來的環(huán)境污染和麻纖維紡織性能的部分劣化，因此本領(lǐng)域的許多研究工作者在努力尋找一種麻脫膠的新方法，生物脫膠受到了特別關(guān)注。1953年，中科院沈陽(yáng)林業(yè)土壤研究所劉期松等對(duì)苧麻脫膠微生物區(qū)系進(jìn)行了研究，喬何戈(Chaudhurg.S.D.)曾報(bào)導(dǎo)某些細(xì)菌和真菌在發(fā)酵過程中可以分解果膠物質(zhì)而釋放纖維，1958年阿里(Ali.M.M.)提出利用果膠酶進(jìn)行麻類(如黃麻、亞麻等)纖維的脫膠。1972年，福嗄提(Fogarty W.M.)和沃德(Ward D.D.)報(bào)導(dǎo)產(chǎn)生果膠酶的微生物或果膠酶制劑在脫膠工藝中加以利用的可能性。1976年，日本藤重升永公開了一種微生物進(jìn)行苧麻脫膠的方法(日本專利特開昭51-149976)，真菌產(chǎn)生的果膠酶中含有纖維素酶且最適作用PH為酸性，因而造成纖維強(qiáng)度的下降，脫膠效果不穩(wěn)定，難以用于工業(yè)化生產(chǎn)。又如中國(guó)專利CN85104285，CN-85104284，CN-89104529公開了利用芽孢桿菌進(jìn)行苧麻生物脫膠的方法。中國(guó)專利97109044公開了一株嗜堿芽孢桿菌及其苧麻脫膠方法，但由于其產(chǎn)生的果膠酶活性比較低脫膠時(shí)間長(zhǎng)(16～24h.)也難于在工業(yè)上應(yīng)用。上述專利均沒有涉及到對(duì)大麻脫膠的內(nèi)容。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一株產(chǎn)韌皮纖維脫膠酶的菌株及其在苧麻、大麻脫膠中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括菌種的分離、誘變選育、培養(yǎng)、搖瓶及發(fā)酵罐產(chǎn)酶發(fā)酵以及其在苧麻、大麻脫膠上的應(yīng)用。
按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，在濟(jì)南近郊采集土壤樣品，選擇分離、經(jīng)搖瓶發(fā)酵進(jìn)行初、復(fù)篩，然后經(jīng)紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變以及原生質(zhì)體融合等處理，并根據(jù)脫膠效果和酶活性高低二項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行篩選，獲得一株實(shí)驗(yàn)室編號(hào)No.13的菌株，其生物學(xué)特性為菌體桿狀、革蘭氏染色陽(yáng)性(G+)，內(nèi)生孢子近端生，孢子囊小于或等于菌體，孢子橢圓形、好氧、過氧化氫酶陽(yáng)性，對(duì)葡萄糖、果糖、蔗糖等能發(fā)酵產(chǎn)酸、對(duì)乳糖、半乳糖不產(chǎn)酸，能水解淀粉，在含7％NaCl的肉湯中生長(zhǎng)良好。根據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版1984科學(xué)出版社)及相關(guān)文獻(xiàn)鑒定該菌為枯草芽孢桿菌No.13(Bacillussubtilis No.13)。已于2000年11月20日將該菌提交給中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏，保藏號(hào)為CCTCC NO.M200038。
所述的枯草芽孢桿菌No.13(Bacillus subtilis No.13)CCTCC NO.M200038在含如下配比的斜面培養(yǎng)基上，能較穩(wěn)定的保持高產(chǎn)酶的特性，斜面培養(yǎng)基配方為10～20％土豆汁100份，蔗糖1.0～2.0份，果膠0.2～0.4份，酵母膏0.03～0.05份，瓊脂1.5～1.8份，或者是牛肉膏0.3份，蛋白胨1.0份，NaCl 0.5份，瓊脂1.8～2.0份，水100份，PH 7.2～7.4，100Pa滅菌20～30min，放置成斜面，用接種環(huán)劃線接種該菌種，30℃～34℃培養(yǎng)24～48h，保存?zhèn)溆谩?br>所述的Bacillus subtilis No.13 CCTCC No.M200038在規(guī)定的培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生對(duì)韌皮纖維有高效率的脫膠酶(主要有果膠酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等)，但不產(chǎn)生損傷纖維的纖維素酶(如C1酶)。這種培養(yǎng)條件是培養(yǎng)基配方麩皮2.0～5.0份，玉米粉0.5～2.0份，(NH4)2SO40.5～1.5份，豆餅粉0.5～1.5份，K2HPO40.05～0.1份，MgSO4·7H2O0.1～0.2份，水100份。消前PH7.5～8.5，100Pa滅菌20～30min。在30℃～34℃，180～220r/min，搖床培養(yǎng)48～72h，搖瓶發(fā)酵液過濾或低速離心后，稀釋500～1000倍，按Somogyi氏法測(cè)定果膠酶(以Sigma聚半乳溏醛酸為底物)、木聚糖酶(以Sigma木聚糖為底物)、甘露聚糖酶(以Sigma槐豆膠為底物)的酶活力。酶活力單位定義為在測(cè)定條件下，由底物每分鐘釋放1μmol產(chǎn)物所需的酶量即一個(gè)酶活力單位，用μ/ml表示。
產(chǎn)韌皮纖維脫膠酶的菌株Bacillus subtilis No.13發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)產(chǎn)生脫膠酶的條件是①流程斜面菌種→搖瓶菌種→一級(jí)種子→二級(jí)種子→發(fā)酵產(chǎn)酶，②一、二級(jí)種子和發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方(均為重量份)麩皮3.0～5.0份，玉米粉1.0～2.0份，豆餅粉0.5～1.5份，(NH4)2SO40.5～1.0份，K2HPO40.05～0.10份，MgSO4·7H2O 0.10～0.20份，消前PH7.5～8.5，③一、二級(jí)種子及發(fā)酵產(chǎn)酶控制條件罐壓0.03Mpa，溫度32℃～34℃，通氣量(空氣體積m3/發(fā)酵液體積m3·分鐘)1∶0.5～0.8，培養(yǎng)時(shí)間一、二級(jí)種子均為8～14h，產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間12～18h，④發(fā)酵結(jié)束的放罐標(biāo)準(zhǔn)，果膠酶400μ/ml～2000μ/ml，發(fā)酵液PH5.5～6.5，無異味、菌體生長(zhǎng)良好，無孢子或少數(shù)菌體出現(xiàn)孢子。
上述生產(chǎn)的脫膠酶液經(jīng)適當(dāng)處理后，可用于苧麻或大麻的脫膠。適當(dāng)處理的條件是用水稀釋酶液，將稀釋酶液的PH調(diào)至7.4～9.6之間，脫膠原麻的用量與稀釋酶液量為1∶10～20(重量∶體積)，脫膠溫度控制在35℃～50℃，脫膠酶液保持靜態(tài)或動(dòng)態(tài)，脫膠時(shí)間2～6h，脫膠麻經(jīng)洗麻機(jī)洗麻，后工序按常規(guī)進(jìn)行。制成的苧麻精干麻其殘膠率可達(dá)2.18％(化學(xué)法3.0％)，斷裂強(qiáng)度4.30CN/dtex(化學(xué)法為4.70CN/dtex)，產(chǎn)品制成率高于化學(xué)法2.5％，另外與化學(xué)法相比，對(duì)環(huán)境無污染，改善工人勞動(dòng)條件等。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1CCTCC No.M200038菌保存?zhèn)溆没蛐屡囵B(yǎng)的斜面菌種接種入搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。其制備方法為300ml搖瓶裝產(chǎn)酶培養(yǎng)基50ml置32℃±1℃，200r/min搖床培養(yǎng)72h。產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為麩皮3.0份，玉米粉1.0份，豆餅粉0.5份，(NH4)2SO41.0份，K2HPO40.1份，MgSO4·7H2O0.1份，水100份，消前PH8.0。培養(yǎng)完畢后，取下?lián)u瓶將發(fā)酵液用4層紗布過濾或2000～3000r/min離心，取清液，按Somogyi氏法測(cè)定酶活力，果膠酶(以Sigma聚半乳溏醛酸為底物)活力1075μ/ml，木聚糖酶(以Sigma木聚糖為底物)活力61μ/ml，甘露聚糖酶(以Sigma槐豆膠為底物)活力56μ/ml。
實(shí)施例2實(shí)施例1所產(chǎn)酶液經(jīng)稀釋5倍后，調(diào)PH8.5，稀釋酶液與大麻的浴比按10～16∶1(體積∶重量)，置40℃～50℃水浴保溫脫膠4h，取出水洗后，送山東省纖維檢驗(yàn)局測(cè)定，其主要指標(biāo)結(jié)果為纖維細(xì)度12.9～18.25dtex，纖維斷裂強(qiáng)度3.07～3.14CN/dtex，伸長(zhǎng)2.5～1.9CV％。
實(shí)施例3CCTCC No.M200038菌在發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)菌體及產(chǎn)酶并應(yīng)用于苧麻、大麻脫膠。
發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)產(chǎn)生脫膠酶的工藝流程為斜面菌種→搖瓶菌種→50L種子罐→500L種子罐→10M3發(fā)酵罐發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)產(chǎn)脫膠酶的條件是①50L、500L和10M3發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為麩皮3.0份，玉米粉1.0份，豆餅粉0.5份，(NH4)2SO41.0份，K2HPO40.10份，MgSO4·7H2O0.10份，消前調(diào)PH7.5～8.5，②50L、500L和10M3發(fā)酵罐控制條件，罐壓0.03Mpa，溫度32℃～34℃，通氣量1∶0.5～0.8，培養(yǎng)時(shí)間50L罐12h、500L罐10h，10M3罐，18h，③果膠酶活力508μ/ml，發(fā)酵液終PH5.5無異味，菌體生長(zhǎng)良好，數(shù)量較多。
約4.5M3脫膠酶液用于苧麻原麻脫膠4籠，每籠裝原麻500kg，共計(jì)2000kg，脫膠時(shí)調(diào)整脫膠稀釋酶液PH7.0～8.5，保溫30℃～45℃，通氣使脫膠酶液流動(dòng)。第一籠脫膠3h完成，第二、三籠3.5h完成，第四籠4h完成。精干麻制成率為62.5％，高于化學(xué)法2.5％，殘膠率2.18％，化學(xué)法為3.0％(優(yōu)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)≤3.0％)，斷裂強(qiáng)度(CN/dtex)4.30％，化學(xué)法為4.70％(優(yōu)級(jí)品標(biāo)準(zhǔn)≥3.53％)。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)韌皮纖維脫膠酶的菌株，其生物學(xué)特性為菌體桿狀、革蘭氏染色陽(yáng)性(G+)、內(nèi)生孢子近端生、孢子囊小于或等于菌體、孢子橢圓形、好氧、過氧化氫酶陽(yáng)性，對(duì)葡萄糖、果糖、蔗糖等能發(fā)酵產(chǎn)酸、對(duì)乳糖、半乳糖不產(chǎn)酸、能水解淀粉，在含7％NaCl的肉湯中生長(zhǎng)良好；根據(jù)1984科學(xué)出版社出版的伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)第八版，及鑒定該菌為枯草芽孢桿菌No.13中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No.M200038。
2.如權(quán)利要求
1所述的一株產(chǎn)韌皮纖維脫膠酶的菌株，其斜面培養(yǎng)和保存?zhèn)溆玫臈l件是斜面培養(yǎng)基配方普通牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面牛肉膏0.3份，蛋白胨1.0份，NaCl0.5份，瓊脂1.8～2.0份，水100份調(diào)PH 7.2～7.4，或者土豆汁斜面1O～20％土豆汁100份，蔗糖1.0～2.0份，果膠0.2～0.4份，酵母膏0.03～0.05份，瓊脂1.5～1.8份，PH 7.2～7.4，培養(yǎng)溫度30℃～34℃，培養(yǎng)時(shí)間24～48h，培養(yǎng)完畢后，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>3.如權(quán)利要求
1或2所述的一株產(chǎn)韌皮纖維脫膠酶的菌株，其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶的條件是培養(yǎng)基配方麩皮2.0～5.0份，玉米粉0.5～2.0份，(NH4)2SO40.5～1.5份，豆餅粉0.5～1.5份，K2HPO4，0.05～0.1份，MgSO4·7H2O，0.1～0.2份，水100份，消前PH7.5～8.5，100Pa滅菌，20～30分鐘；發(fā)酵控制條件培養(yǎng)溫度30℃～34℃，搖瓶轉(zhuǎn)速180～220r/min，培養(yǎng)時(shí)間48～72h；搖瓶發(fā)酵液過濾或低速離心后，稀釋500～1000倍，按Somogyi氏法測(cè)果膠酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶的活力。
4.如權(quán)利要求
3所述的一株產(chǎn)韌皮纖維脫膠酶的菌株及其產(chǎn)生的酶液，在大麻、苧麻脫膠中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求
4所述的一株產(chǎn)韌皮纖維脫膠酶的菌株在大麻苧麻脫膠中的應(yīng)用，其菌種在10立方米發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)產(chǎn)生脫膠酶的工藝條件是①工藝流程斜面→搖瓶→一級(jí)種子→二級(jí)種子→發(fā)酵產(chǎn)酶，②一、二級(jí)種子和發(fā)酵產(chǎn)酶的培養(yǎng)基配料(均為重量份)麩皮3.0～5.0份，玉米粉1.0～2.0份，豆餅粉0.5～1.5份，(NH4)2SO40.5～1.0份，K2HPO40.05～0.10份，MgSO4·7H2O 0.10～0.20份，消前PH7.5～8.5，③一、二級(jí)種子及發(fā)酵產(chǎn)酶控制條件罐壓0.03Mpa，溫度32℃～34℃，通氣量1∶0.5～0.8，培養(yǎng)時(shí)間一、二級(jí)種子均為8～14h，產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間12～18h，④發(fā)酵結(jié)束的放罐標(biāo)準(zhǔn)，果膠酶400μ/ml～2000μ/ml，發(fā)酵液PH5.5～6.5，無異味、菌體生長(zhǎng)良好，無孢子或少數(shù)菌體產(chǎn)生孢子。
專利摘要
本發(fā)明涉及一株可產(chǎn)生韌皮纖維脫膠酶的菌株及其在苧麻、大麻脫膠中的應(yīng)用,屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域：
,該菌經(jīng)鑒定為Bacillus subtilis No.13,保藏編號(hào)CCTCC,No.M200038,具有培養(yǎng)條件粗放、生長(zhǎng)繁殖快,在同一培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生脫膠所需的多種酶,脫膠效果好,且2～6小時(shí)即可完成,脫膠率達(dá)到95%,纖維分散度100%,不損傷纖維,無環(huán)境污染,可代替化學(xué)脫膠法用于苧麻大麻脫膠工藝。
文檔編號(hào)C12S3/00GKCN1371990SQ01127440
公開日2002年10月2日 申請(qǐng)日期2001年9月26日
發(fā)明者劉自鎔, 任建平, 馮瑞良, 張桂珍 申請(qǐng)人:山東大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan