專利名稱:利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及基因工程,特指一種利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法。
背景技術(shù):
由于飼料中加入植酸酶,可減少無機(jī)磷酸鹽加入量,提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益和降低磷對環(huán)境的污染。
雖然植酸酶具有良好的飼喂效果,但到目前為止還沒有在飼料工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用,其根本原因在于,在天然微生物中植酸酶的表達(dá)量太低,從而難以大量獲得廉價(jià)的植酸酶產(chǎn)品,不能滿足飼料工業(yè)發(fā)展的要求。隨著生物技術(shù)、基因工程等高新技術(shù)的發(fā)展,利用生物反應(yīng)器來高效表達(dá)植酸酶基因,提高植酸酶產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本已得到應(yīng)用。幾種微生物來源的植酸酶基因已得到了分離,如酵母Saccaromyces cerevisiae(Bajwa W.,Nucleic Acids Res.,127721-7739,1984)以及源自于大腸桿菌E.coli的同時(shí)具有植酸酶和酸性磷酸脂酶活力的雙功酶appA(Dassa,J.,et al.Bacteriol.1725497-5500,1990)等。植酸酶基因表達(dá)的研究主要集中在來源于A.niger(ficuum)的植酸酶基因phyA和phyB上。但國內(nèi)外的表達(dá)研究達(dá)到的表達(dá)水平都很低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),尤其是家蠶(Bm)-家蠶桿狀病毒(BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)、生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法,以期達(dá)到植酸酶的大量、廉價(jià)生產(chǎn),在飼料及食品中廣泛應(yīng)用。
其目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
將植酸酶基因與桿狀病毒載體進(jìn)行重組;用重組病毒感染昆蟲宿主;培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主使其進(jìn)行廣適性、高比活植酸酶表達(dá);收集含廣適性、高比活植酸酶的昆蟲宿主。
所述的桿狀病毒是BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、或TeNPV。
所述的昆蟲宿主是家蠶、野蠶、蓖麻蠶、樟蠶、樗蠶、柞蠶、日本柞蠶、野天蠶、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘蘭夜蛾、秋粘蟲、粉紋夜蛾、行軍蟲、棉鈴蟲、美國棉粘蟲、煙青蟲、煙草夜蛾、東方粘蟲、或舞毒蛾。
所述的桿狀病毒運(yùn)載載體AcRP23-lacZ,AcRP6-SC,AcUW1-lacZ,BacPAK6.Bac to Pac,Bacmid,BlucBacII(pETL),p2Bac,p2Blue,p89B310,pAc360、373,pAcAB3、4,PAcAS3,pAcC129、C4、DZI,pAcGP67,pAcIE1,pAcJP1,pAcM4LF2、7、8,pAcMP1、2,pAcRP23、25,pAcRW4,pAcsMAG,pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51,pAcVC2、3,pAcYM1,pAcJcC5,pBac1、2,pBlueBacIII,pBlueBacHis,pEV55、mXIV,pIEINeo,pJVETL,pJVNhe1,pJVP10,pJVrsMAG,pMBac,pP10,pPAK1,pPBac,pSHONEX 1.1,pSYN XIV VI+,pSYNVI+wp,pSYNXIV VI-,pVL1391、1392、1393、pVL941、945、985,pVTBac,pBM030,或pUAC-5。
所述的重組病毒是通過口食或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體。所述的蛹體為1-2天的早期嫩蛹。
本發(fā)明采用基因重組技術(shù),將來源于各種微生物(如黑曲霉、煙曲霉、酵母等真菌,大腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌等細(xì)菌)、植物(玉米、大豆、水稻等)的植酸酶基因構(gòu)建到各種桿狀病毒運(yùn)載載體(如AcRP23-lacZ,AcRP6-SC,AcUW1-lacZ,BacPAK6,Bac to Pac,Bacmid,BlueBacII(pETL),p2Bac,p2Blue,p89B310,pAc360、373,pAcAB3、4,pAcAS3,pAcC129、C4、DZ1,pAcGP67,pAcIE1,pAcJP1,pAcMLF2、7、8,pAcMP1、2,pAcRP23、25,pAcRW4,pAcsMAG,pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51,pAcVC2、3,pAcYM1,pAcJcC5,pBac1、2,pBlueBacIII,pBlueBacHis,pEV55、mXIV,pIEINeo,pJVETL,pJVNhe1,pJVP10,pJVrsMAG,pMBac,pP10,pPAK1,pPBac,pSHONEX 1.1,pSYN XIVVI+,pSYNVI+wp,pSYNXIV VI-,pVL1391、1392、1393,pVL941、945、985,pVTBac,pBM030,pUAC-5)上,使廣適性、高比活植酸酶基因在多角體啟動(dòng)子、p10啟動(dòng)子或別的病毒和真核生物的強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下,通過體內(nèi)或體外(invivo/in vitro)重組,將廣適性、高比活植酸酶基因appA整合到桿狀病毒的基因組上,得到重組病毒。重組病毒可通過經(jīng)口食下或采用各種手段透過表皮感染1-5齡(最優(yōu)時(shí)間為四或五齡)的昆蟲幼蟲或蛹體(最優(yōu)時(shí)間為1-2天的早期嫩蛹),表達(dá)生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶。
本發(fā)明中最優(yōu)化的方案是將來源于大腸桿菌(E.coli)的植酸酶和酸性磷酸脂酶的雙功酶基因appA,插入到運(yùn)載載體pVL1393上,再通過體內(nèi)重組將appA基因轉(zhuǎn)移到家蠶桿狀病毒親本株BmNPV-ZJ8的基因組上,替代基因組上的Polyhedrin基因,通過空斑篩選技術(shù)和PCR檢測技術(shù),獲得攜帶appA的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(appA)。將其感染家蠶細(xì)胞系或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹,可大量繁殖rBmNPV(appA)。當(dāng)rBmNPV(appA)在蠶體內(nèi)復(fù)制時(shí),appA在多角體蛋白基因(polh)啟動(dòng)子控制下表達(dá),產(chǎn)生廣適性、高比活植酸酶appA。在感染3-6天(最佳為5天)后收集含植酸酶的家蠶幼蟲或蛹的體液(或整體勻漿),殺滅感染性病原后,將其與載體(如麩皮、粕、石粉等)拌和,烘干、粉碎后便得到廣適性、高比活植酸酶制劑,可做為飼料添加劑添加到單胃動(dòng)物或魚飼料中。在酸性或近于中性胃液中,廣適性、高比活植酸酶水解植酸,將植酸磷降解為肌醇和磷酸。本發(fā)明生產(chǎn)的廣適性、高比活植酸酶經(jīng)過分離、純化后,還可添加到食品中,促進(jìn)食品中營養(yǎng)成分的吸收,提高食品的營養(yǎng)價(jià)值。
本發(fā)明采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),應(yīng)用昆蟲幼蟲及蛹作為生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶,可在單胃動(dòng)物及魚的飼料或食品中應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)化的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為家蠶(Bm)-家蠶桿狀病毒(BmNPV)表達(dá)系統(tǒng),通過基因重組,將廣適性、高比活植酸酶基因appA重組進(jìn)家蠶桿狀病毒BmNPV,獲得重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(appA),使攜帶廣適性、高比活植酸酶基因的rBmNPV(appA)在不同發(fā)育階段的家蠶(幼蟲、蛹等)中繁殖,應(yīng)用家蠶作為宿主的生物反應(yīng)器生產(chǎn)植酸酶。同樣,利用別的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),如AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TnNPV等也可按同樣的方法表達(dá)生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于將appA基因重組進(jìn)家蠶桿狀病毒,獲得重組病毒rBmNPV(appA),rBmNPV(appA)感染家蠶幼蟲或蛹體后,appA基因得到高表達(dá),每毫升蠶血淋巴可產(chǎn)生1.5毫克以上的appA蛋白,活力高達(dá)5000U以上,一條蠶(或蛹)產(chǎn)生的酶活力約為3萬單位(或2萬單位)以上。從大腸桿菌中克隆的appA基因曾在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(Golovan,S.,et al.,Can.J.Microbial.4659-71,2000)和畢赤酵母系統(tǒng)(Rodriguez E.,et al.,Arch.Biochem.Biophys.,382(1)105-112,2000)中進(jìn)行了表達(dá),但是表達(dá)量均很低,不足以大規(guī)模生產(chǎn)。而本發(fā)明的雙功酶appA其植酸酶每毫克的活力達(dá)3000U以上,其比活力是中國專利公開號(hào)CN1184156A和中國專利申請?zhí)?9103564.X的phyA2基因的30倍以上,pH適應(yīng)性在1.2-6.5和溫度在10-70℃范圍內(nèi)均有很高的活力,耐熱性亦優(yōu)于phyA2基因,便于酶制劑加工??壗z廠的下腳蠶蛹一直是飼料的蛋白源,因此加入用本發(fā)明生產(chǎn)的植酸酶,同時(shí)也給飼料加入了蛋白,增加了飼料營養(yǎng)價(jià)值,且無需投資建廠,無三廢,電力和水資源等能源消耗極少。除可用于工業(yè)化生產(chǎn)的配合飼料外,還可直接為農(nóng)民使用于各種單胃畜禽動(dòng)物(如豬、雞等)和魚中,因此符合我國國情,極有應(yīng)用推廣價(jià)值。由于家蠶已經(jīng)我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為食藥兼用昆蟲,所以此種廣適性、高比活植酸酶appA經(jīng)部分純化后,可作為食品添加劑,提高食品的營養(yǎng)價(jià)值??傮w而言,本項(xiàng)發(fā)明可以大幅度降低植酸酶的生產(chǎn)成本,能產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益。
四.
圖1、重組運(yùn)載載體pVL1393(appA)的構(gòu)建圖2、重組運(yùn)載載體pVL1393(appA)酶切鑒定圖
Lane1pGEM-3Z(appA)/BamHI+EcoRI;Lane2pVL1393(appA)/BamHI+EcoRI;Lane3pVL1393(appA)/BamHI+EcoRI;Lane4λDNA/HindIII Marker圖3、重組病毒rBmNPV(appA)的PCR鑒定Lane1pVL1393-appA質(zhì)粒DNA為模板;Lane2rBmNPV(appA)病毒DNA為模板;Lane3篩選的大腸桿菌基因組DNA為模板;Lane4λDNA/HindIII Marker圖4、appA基因在家蠶幼蟲中的表達(dá)圖5、appA基因在家蠶蛹中的表達(dá)圖6、植酸酶的反應(yīng)最適pH值圖7、appA植酸酶的溫度穩(wěn)定性五.實(shí)施方式實(shí)驗(yàn)材料1.菌株、病毒株與載體大腸桿菌株E.coli TG1和DH5α購自Promega公司;運(yùn)載載體pVL1393、家蠶細(xì)胞BmN、家蠶核型多角體病毒親本株BmNPV-ZJ8由中國科學(xué)院上海生化所吳祥甫研究員惠贈(zèng);家蠶品種JY1由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所農(nóng)業(yè)部家蠶生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。
2.酶與試劑限制性內(nèi)切酶、連接酶為Boehringer公司產(chǎn)品。
3.生化試劑IPTG、X-Gal、SDS及植酸鈉為Sigma公司產(chǎn)品。過硫酸銨、TEMED、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。Lipofectin、低融點(diǎn)瓊脂糖LMP、PCR試劑盒、T4DNA連接酶、RNA酶、Proteinase K、細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100、胎牛血清及其他試劑購于GIBCO-BRL公司。
4.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0);家蠶細(xì)胞培養(yǎng)基為TC-100。實(shí)施例一(一)、appA基因高表達(dá)大腸桿菌菌株的篩選1.采集樣本(來源于農(nóng)戶散養(yǎng)、未喂配合飼料及添加劑的新鮮豬糞)。
2.稱取0.05g樣品,加入蒸餾水1ml,充分搖勻。
3.用蒸餾水稀釋步驟2中樣品1000倍。
4.倒平板,下層為不含抗生素的LB,上層為瓊脂糖(1%agarose;100mM醋酸鈉緩沖液,pH4.5;20mM植酸鈉;50mM CaCl2),取100μl稀釋液涂布于平板上倒置培養(yǎng)過夜。
5.用滅菌牙簽挑取單菌落于4ml LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。
6.離心菌液,棄上清。沉淀用1ml蒸餾水洗一次,充分混勻,再次離心去上清。
7.沉淀中加入250μl Solution I,搖勻后加入少許溶菌酶粉末,混勻,于37℃溫育10分鐘。
8.樣品于冰上進(jìn)行超聲波破碎,強(qiáng)度為14,重復(fù)3次。
9.稀釋20倍后取100μl于試管中,加入含植酸鈉的緩沖液(內(nèi)含4mM植酸鈉,0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液,pH4.5),于37℃水浴中反應(yīng)30分鐘。
10.加入1ml 10%TCA,終止反應(yīng)。
11.加入2ml鐵鉬藍(lán)顯色劑,顯色5分鐘。
12.用紫外分光光度計(jì)在750nm波長處測定光密度值。將光密度值高的菌株用甘油保存于-20℃。
總共篩選了二百個(gè)菌株,最高和最低的菌株appA活力相差500倍以上,保留活力最好的菌株并制備相應(yīng)的基因組DNA。(二)、appA基因的克隆和序列分析1.含appA基因高表達(dá)E.coli基因組DNA的制備(1)挑取單菌落,于37℃過夜培養(yǎng)。
(2)12000rpm離心2min,去上清。
(3)沉淀中加入567μl TE緩沖液,混勻重懸,加入30μl10%(W/V)SDS和3μl20mg/ml蛋白酶K,混勻,37℃溫育1hr。
(4)加入100μl 5mol/l的NaCl,充分混勻,再加入80μl CTAB/NaCl(10%CTAB0.7mol/L NaCl),混勻,于65℃溫育10min。
(5)加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1),混勻,11000g離心5min,上清移入新管。
(6)加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),混勻,11000g離心5min,上清移入新管。
(7)加入等體積氯仿,混勻,11000g離心5min,上清移入新管。
(8)加入0.6體積異戊醇,輕輕混勻直到DNA沉淀,11000g離心5min,去上清。
(9)沉淀中加入1ml 70%酒精。
(10)11000g離心5min,去上清,抽干后加入50μl 0.1×TE溶解,于-20℃保存。2.PCR擴(kuò)增appA基因產(chǎn)物化學(xué)合成appA基因5’端和3’端引物5’-GAG GAT CCA CGA TGA AAGCGA TCT TAA TCC CAT-3’(Forward)和5’-TTG AAT TCA TTA CAA ACT GCACGC CGG TAT-3’(Revise)。用制備的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增appA基因。PCR反應(yīng)體系如下表、1PCR反應(yīng)條件加入物 體積滅菌ddH2O 33μl10×PCR Buffer 5μl2.5mM dNTP 4μl25mM MgCl23μl5‘引物 1μl3‘引物 1μl模板DNA 2μlTaq酶 1μlTotal 50μlPCR反應(yīng)過程94℃變性10分鐘;94℃ 1分鐘,53℃ 1分30秒,72℃ 3分鐘,共35個(gè)循環(huán)。最后延伸反應(yīng)8分鐘。3.PCR產(chǎn)物的純化將PCR擴(kuò)增的appA基因產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出約1.4kb的片段。在紫外燈下用滅菌手術(shù)刀切取含相應(yīng)DNA片段的凝膠,然后用Geneclean試劑盒進(jìn)行純化。方法如下切取凝膠片段并稱重,將其放入滅菌的1.5ml小離心管中,加入3倍(v/w)體積的6M NaI,37℃將凝膠溶解后,加入10μl玻璃奶(Glass milk),混勻后室溫下放置5分鐘,使DNA充分吸附在玻璃奶上,12000rpm離心5秒鐘,再用New Wash溶液洗三次,每次均將沉淀彈起,并離心。最后將沉淀晾干后加入30μl 0.1×TE Buffer溶解DNA,離心后去沉淀,取上清作進(jìn)一步分析。4.酶切與連接反應(yīng)酶切反應(yīng)純化后DNA用BamHI和EcoRI雙酶切分析,反應(yīng)總體積為50μl,其中純化的PCR產(chǎn)物10μl,10×酶相應(yīng)緩沖液5μl,兩種酶各為1μl,無菌水補(bǔ)足體積。37℃反應(yīng)2小時(shí)以上。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGEM-3Z作同樣酶切反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后于65℃滅活10分鐘。
連接反應(yīng)連接總體積15μl,PCR產(chǎn)物8μl,載體1μl,5×T4 DNA連接緩沖液3μl,T4 DNA連接酶1μl,無菌水補(bǔ)足體積,12~14℃連接過夜。5.大腸桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化用75mM CaCl2制備大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞。取步驟4中制備的連接混合物5μl,加到200μl感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕混勻,冰浴30分鐘,42℃熱激2分鐘,迅速置于冰上1~2分鐘,加入已溫育至37℃的LB培養(yǎng)基500μl,37℃培養(yǎng)1小時(shí),取100~200μl涂布于含100μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基平板上,37℃倒置培養(yǎng)過夜。6.質(zhì)粒DNA的制備(1)從轉(zhuǎn)化的LB平板上挑取單個(gè)菌落,接種于3ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜。
(2)取1.5ml菌液于小離心管中,3500rpm離心4min,去上清。
(3)加入Solution I 150μl,混勻后置于冰上15min。
(4)加入Solution II 300μl,氯仿150μl,輕輕混勻后靜置5min。
(5)加入Solution III 450μl,混勻后置于冰上15min。
(6)11000g離心10min,上清移入新管。
(7)加入異丙醇450μl,混勻后置于4℃ 15min。
(8)11000g離心6min,去上清。
(9)加入TER250μl,混勻后置于37℃ 20min。
(10)加入PPt Buffer 300~350μl,混勻后靜置15min。
(11)11000g離心6min,去上清。
(12)加入75%乙醇400μl。
(13)11000g離心3min,倒掉乙醇,抽干后加入0.1×TE Buffer 40μl溶解,于-20℃保存。7.重組子的鑒定用BamHI和EcoRI雙酶切步驟6中制備的質(zhì)粒DNA,電泳后出現(xiàn)約1.4kb的DNA條帶的質(zhì)粒為重組運(yùn)載質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pGEM-3Z(appA)進(jìn)行雙向測序。appA基因序列及氨基酸序列分別見表2、表3。(4)、轉(zhuǎn)移載體pVL1393(appA)的構(gòu)建將制備的質(zhì)粒pGEM-3Z(appA)用BamHI和EcoRI雙酶切,按上述方法純化appA基因片段,與經(jīng)同樣酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1,篩選得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-appA。重組質(zhì)粒構(gòu)建如圖1所示,酶切鑒定圖譜如圖2所示。(5)、家蠶核多角體病毒親本株BmNPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制備按GIBCO公司產(chǎn)品說明配制1×TC-100培養(yǎng)基,用2N NaOH將pH調(diào)至6.22,過濾除菌后的培養(yǎng)基補(bǔ)加10%胎牛血清,27℃下培養(yǎng)家蠶細(xì)胞Bm-5。用家蠶核多角體病毒親本株BmNPV-ZJ8感染對數(shù)生長期的細(xì)胞約50ml,感染復(fù)數(shù)為1,3~4天后收集病毒感染液,離心(5000rpm×10min),除去沉淀,上清用25000rpm離心1小時(shí),除上清,用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris 12.1g,EDTA33.6g,KCl 14.1g,pH7.5)懸浮病毒粒子沉淀,轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中,加入蛋白酶K至終濃度為50μg/ml,50℃保溫2小時(shí),再加入35%的Sarkorsel至終濃度為1%,繼續(xù)于50℃保溫2小時(shí),分別用等體積的苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)氯仿依次抽提,將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中,加入1/10體積的3M NaCl,再加入2倍體積的無水乙醇,-20℃放置2小時(shí)以上沉淀病毒DNA,5000rpm離心10分鐘,沉淀用75%乙醇洗一次,冷凍干燥。溶解在100μl TE Buffer中,放4℃保存?zhèn)溆谩?6)、重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(appA)的構(gòu)建和獲得1.重組桿狀病毒rBmNPV(appA)的構(gòu)建接種大約1×106細(xì)胞于15cm2培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞貼壁后,除去含胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基,用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基洗三次,加1.5ml無FBS培養(yǎng)基。向一滅菌管中依次加入1μg家蠶桿狀病毒親本株BmNPV-ZJ8 DNA,2μg重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVL1393-appA DNA和5μl脂質(zhì)體,用無菌雙蒸水補(bǔ)足體積到60μl,輕輕混勻,靜置15分鐘后,逐滴加入到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。27℃培養(yǎng)4小時(shí)后補(bǔ)加1.5ml無血清培養(yǎng)基和300μl FBS。27℃恒溫培養(yǎng)4~5天,收集上清液用于重組病毒的篩選。2.重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(appA)的篩選和純化接種適量細(xì)胞(約70~80%)于35mm小平皿中,細(xì)胞貼壁后,吸去培養(yǎng)基,將共轉(zhuǎn)染上清進(jìn)行不同濃度稀釋,取1ml共轉(zhuǎn)染液加到貼壁細(xì)胞中,分布均勻。27℃感染1小時(shí)后,吸去感染液,將2%低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠于60℃水浴中融化,冷至40℃與40℃預(yù)熱的2×TC-100培養(yǎng)基(含20%FBS)混合均勻,每平皿加4ml膠,待凝固后用Parafilm封口,27℃倒置培養(yǎng)3~5天,顯微鏡觀察。將不含有多角體的空斑挑選出來,重復(fù)以上步驟,經(jīng)過2~3輪的純化獲得純的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(appA)。3.重組病毒rBmNPV(appA)在家蠶細(xì)胞中的擴(kuò)增將重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(appA)感染正常生長的BmN細(xì)胞,培養(yǎng)3天后收集上清液,上清液中即含有大量的重組病毒rBmNPV(appA)。4.重組病毒的鑒定利用PCR方法分析外源基因整合。游離病毒基因組DNA的提取方法如下取病毒上清150μl,加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混勻,再加入20μl(8mol/L)的醋酸銨,混勻后用等體積的酚和氯仿分別抽提一次,酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物為5’-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT5’-TTGAATTCATTACAAACTGCACGCCGGTAT取上述病毒基因組DNA 1μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為94℃變性5min、94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5min。取15μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳分析,結(jié)果見圖3。(7)、appA基因在家蠶中的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)所用的家蠶高表達(dá)品種為JY1(由本實(shí)驗(yàn)室保存)。JY1品種家蠶飼養(yǎng)按呂鴻聲主編的《中國養(yǎng)蠶學(xué)》(上海科學(xué)技術(shù)出版社,1991)的常規(guī)方法進(jìn)行。餉食后48h選擇平均體重相同的15頭家蠶為一組,每頭蠶接種約1.0×105rBmNPV(appA),即5μl接種液中含2.0×107pfu/ml的rBmNPV(appA),共12組,在病毒感染后分別按60h、72h、84h、96h、108h、120h的時(shí)間取血樣并測定appA酶活力,重復(fù)三次。結(jié)果由圖4所示,從感染病毒60h開始,appA開始表達(dá),隨著時(shí)間的增加,所表達(dá)的酶活也隨之增加,在病毒感染后108小時(shí)達(dá)最高,每ml蠶血淋巴appA酶活力達(dá)4876.35單位,隨后酶活開始下降。實(shí)施例二、appA基因在家蠶蛹體中表達(dá)本實(shí)施例所用的家蠶蛹為高表達(dá)品種為JY1(由本實(shí)驗(yàn)室保存)。JY1品種家蠶飼養(yǎng)按呂鴻聲主編的《中國養(yǎng)蠶學(xué)》(上??茖W(xué)技術(shù)出版社,1991)的常規(guī)方法進(jìn)行。結(jié)繭七天后選擇平均體重相同的15粒蠶蛹為一組,每頭蛹接種約1.0×105rBmNPV(appA),即5μl接種液中含2.0×107pfu/ml的rBmNPV(appA),共12組,在病毒感染后按60h、72h、84h、96h、108h、120h的時(shí)間取血樣并測定appA酶活力,重復(fù)三次。結(jié)果如圖5所示,從感染病毒60h開始,appA開始表達(dá),隨著時(shí)間的增加,所表達(dá)的酶活也隨之增加,在病毒感染后96至108小時(shí)達(dá)最高,每ml蠶血淋巴appA酶活力大于5000單位,隨后酶活開始下降。家蠶生產(chǎn)的廣適性、高比活植酸酶的特性分析如下1.植酸酶的反應(yīng)最適pH值分別用不同緩沖液配制底物,調(diào)節(jié)底物pH值,0.25mol/L Gly-HCl(pH1.2-4)、0.25mol/L NaAc-HAc(pH4-6)、0.25mol/L Tris-HCl(pH6-7)、0.1mol/L Tris-HCl(pH6-9),測定酶在37℃時(shí)不同pH條件下反應(yīng)30分鐘的酶活力,結(jié)果如圖6所示,appA植酸酶催化反應(yīng)的最適pH為4.5,當(dāng)pH值超過5時(shí),酶活力急劇下降,在pH值超過7.5時(shí),酶活力幾乎測不出。2.appA植酸酶的溫度穩(wěn)定性含appA植酸酶的血樣用0.1mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH4.5)、0.15 mol/L HCl、1mmol/L CaCl2,5×稀釋后,分別在30-95℃下水浴15分鐘,迅速用冰浴降溫,10000rpm×20min離心,取上清稀釋后測定酶活力,以稀釋后未經(jīng)處理的樣品作對照,比較酶活力。結(jié)果如圖7所示,appA植酸酶活力在溫度20-60℃之間隨溫度的上升而增強(qiáng),至60℃時(shí)達(dá)最大,此后隨溫度的下降而降低,當(dāng)溫度超過90℃后酶已經(jīng)完全失活。
表2 appA基因序列1 GGA TCC ACG ATG AAA GCG ATC TTA ATC CCA TTT TTA TCT CTT CTG 4546 ATT CCG TTA ACC CCG CAA TCT GCA TTC GCT CAG AGT GAG CCG GAG 9091 CTG AAG CTG GAA AGT GTG GTG ATT GTC AGT CGT CAT GGT GTG CGT 135136 GCT CCA ACC AAG GCC ACG CAA CTG ATG CAG GAT GTC ACC CCA GAC 180181 GCA TGG CCA ACC TGG CCG GTA AAA CTG GGT TGG CTG ACA CCG CGC 225226 GGT GGT GAG CTA ATC GCC TAT CTC GGA CAT TAC CAA CGC CAG CGT 270271 CTG GTA GCC GAC GGA TTG CTG GCG AAA AAG GGC TGC CCG CAG TCT 315316 GGT CAG GTC GCG ATT ATT GCT GAT GTC GAC GAG CGT ACC CGT AAA 360361 ACA GGC GAA GCC TTC GCC GCC GGG CTG GCA CCT GAC TGT GCA ATA 405406 ACC GTA CAT ACC CAG GCA GAT ACG TCC AGT CCC GAT CCG TTA TTT 450451 AAT CCT CTA AAA ACT GGC GTT TGC CAA CTG GAT AAC GCG AAC GTG 495496 ACT GAC GCG ATC CTC AGC AGG GCA GGA GGG TCA ATT GCT GAT TTT 540541 ACC GGG CAT CGG CAA ACG GCG TTT CGC GAA CTG GAA CGG GTG CTT 585586 AAT TTT CCG CAA TCA AAC TTG TGC CTT AAA CGT GAG AAA CAG GAC 630631 GAA AGC TCT TCA TTA ACG CAG GCA TTA CCA TCG GAA CTC AAG GTG 675676 AGC GCC GAC AAT GTC TCA TTA ACC GGT GCG GTA AGC CTC GCA TCA 720721 ATG CTG ACG GAG ATA TTT CTC CTG CAA CAA GCA CAG GGA ATG CCG 765766 GAG CCG GGG TGG GGA AGG ATC ACC GAT TCA CAC CAG TGG AAC ACC 810811 TTG CTA AGT TTG CAT AAC GCG CAA TTT TAT TTG CTA CAA CGC ACG 855856 CCA GAG GTT GCC CGC AGC CGC GCC ACC CCG TTA TTA GAT TTG ATC 900901 AAG ACA GCG TTG ACG CCC CAT CCA CCG CAA AAA CAG GCG TAT GGT 945946 GTG ACA TTA CCC ACT TCA GTG CTG TTT ATC GCC GGA CAC GAT ACT 990991 AAT CTG GCA AAT GTC GGC GGC GCA CTG GAG CTC AAC TGG ACG CTC 10351036 CCC GGT CAG CCG GAT AAC ACG CCG CCA GGT GGT GAA CTG GTG TTT 10801081 GAA CGC TGG CGT CGG CTA AGC GAT AAC AGC CAG TGG ATT CAG GTT 11251126 TCG CTG GTC TTC CAG ACT TTA CAG CAG ATG CGT CAT AAA ACG CCG 11701171 CTG TCA TTA AAT ACG CCG CCC GGA GAG GTG AAA CTG ACC CTG GCA 12151216 GGA TGT GAA GAG CGA AAT GCG CAG GGC ATG TGT TCG TTG GCA GGT 12601261 TTT ACG CAA ATC GTG AAT GAA GCA CGC ATA CCG GCG TGC AGT TTG 13051306 TAA TGA ATT C 1350
表3 氨基酸序列表MKAILIPFLSLLIPLTPQSAFAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILSRAGGSIADFTGHRQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESSSLCQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMLTEIFKLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFYLLQRLPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRHKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSL.
權(quán)利要求
1.一種利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法,包括將植酸酶基因與桿狀病毒載體進(jìn)行重組;用重組病毒載體感染昆蟲宿主;培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主使其進(jìn)行廣適性、高比活植酸酶表達(dá);收集含廣適性、高比活植酸酶的昆蟲宿主。
2.按照權(quán)利要求
1所述的利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法,其特征在于,所述的桿狀病毒是BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、或TeNPV。
3.按照權(quán)利要求
1所述的利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法,其特征在于,所述的昆蟲宿主是家蠶、野蠶、蓖麻蠶、樟蠶、樗蠶、柞蠶、日本柞蠶、野天蠶、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘蘭夜蛾、秋粘蟲、粉紋夜蛾、行軍蟲、棉鈴蟲、美國棉粘蟲、煙青蟲、煙草夜蛾、東方粘蟲、或舞毒蛾。
4.按照權(quán)利要求
1所述的利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法,其特征在于,所述的昆蟲是家蠶,所述的桿狀病毒是家蠶桿狀病毒。
5.按照權(quán)利要求
1所述的利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法,其特征在于,所述的桿狀病毒運(yùn)載載體AcRP23-lacZ,AcRP6-SC,AcUWl-lacZ,BacPAK6,Bac to Pac,Bacmid,BlucBacII(pETL),p2Bac,p2Blue,p89B310,pAc360、373,pAcAB3、4,PAcAS3,pAcC129、C4、DZI,pAcGP67,pAcIE1,pAcJP1,pAcMLF2、7、8,pAcMPl、2,pAcRP23、25,pAcRW4,pAcsMAG,pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51,pAcVC2、3,pAcYMl,pAcJcC5,pBac1、2,pBlueBacIII,pBlueBacHis,pEV55、mXIV,pIEINeo,pJVETL,pJVNhel,pJVP10,pJVrsMAG,pMBac,pP10,pPAKl,pPBac,pSHONEX 1.1,pSYN XIV VI+,pSYNVI+wp,pSYNXIV VI-,pVL1391、1392、1393、pVL941、945、985,pVTBac,pBM030,或pUAC-5。
6.按照權(quán)利要求
1所述的利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法,其特征在于,所述的重組病毒是經(jīng)口或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體。
7.按照權(quán)利要求
1所述的利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法,其特征在于,所述的蛹體為化蛹后1-2天的早期嫩蛹。
8.按照權(quán)利要求
1所述的利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法,其特征在于,所述的植酸酶基因是來源于大腸桿菌的廣適性、高比活植酸酶基因和酸性磷酸脂酶雙功能基因appA;所述的運(yùn)載載體是pVL1393;所述的重組是指將廣適性、高比活植酸酶基因appA移到家蠶桿狀病毒親本株BmNPV-ZJ8的基因組上,替代病毒基因組上的Polyhedrin基因,然后通過空斑篩選技術(shù)和PCR檢測技術(shù),獲得攜帶appA的重組家蠶桿狀病毒rBmNPVappA;所述感染是將得到的重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹;在感染3-6天后收集含植酸酶的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿。
專利摘要
本發(fā)明提供一種利用重組桿狀病毒在昆蟲體內(nèi)表達(dá)、生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶appA方法,包括廣適性、高比活植酸酶基因與桿狀病毒載體進(jìn)行重組;用重組病毒感染昆蟲宿主;被感染的昆蟲宿主進(jìn)行植酸酶和酸性磷酸脂酶的表達(dá);收集含植酸酶的家蠶幼蟲或蛹的體液或勻漿。通過這種方法可以大量、廉價(jià)地生產(chǎn)廣適性、高比活植酸酶appA和磷酸脂酶用作飼料添加劑。
文檔編號(hào)C12N7/01GKCN1410540SQ01127288
公開日2003年4月16日 申請日期2001年9月29日
發(fā)明者張志芳, 何家祿, 姚斌, 周亞竟, 陳寅, 易詠竹 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan