專利名稱:重型血友病a致病基因突變檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及檢測重型血友病A致病基因內(nèi)含子22和內(nèi)含子I倒位突變的試劑盒。
背景技術(shù)：
血友病A (hemophilia A, HA)又稱甲型血友病，是最為常見的X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，其主要病因是由于凝血因子VIII (FVIII)基因突變而引起的FVIII含量不足或功能缺陷。HA患者常自發(fā)性或外傷性出血不止，出血可發(fā)生在任何部位，但以關(guān)節(jié)出血最為多見。反復(fù)多次關(guān)節(jié)出血可導(dǎo)致患者致殘，甚至危及生命。臨床上根據(jù)患者血漿FVIII促凝活性及癥狀嚴(yán)重程度將HA分為重型、中型和輕型，其中50%為重型。
我國HA的發(fā)病率在男性人群中約為1/5000。血友病根據(jù)所缺乏凝血因子的不同分為血友病A和血友病B (hemophilia B, HB), HA約占全部血友病的80%_85%，HB則約占15%-20%且在臨床上通常為中型和輕型。HA的人群患病率無種族和地區(qū)差異，可能與較高的基因自發(fā)突變率相關(guān)。由于是X連鎖隱性遺傳，女性HA患者及其罕見。
FVIII基因全長186kb，位于X染色體長臂遠(yuǎn)端(Xq28)，含有26個外顯子和25個內(nèi)含子，編碼2351個氨基酸。隨著人們對HA分子基礎(chǔ)的認(rèn)識不斷深入，該病基因診斷的技術(shù)也得到了很大發(fā)展。截止2012年已經(jīng)報(bào)道基因突變1400多種，主要是點(diǎn)突變、插入、缺失和倒位，其中內(nèi)含子22倒位(Inversion 22，Inv22)突變約占全部重型血友病A的45%。1996年，Brinke等在一對同卵雙生的重型HA雙胞胎患者中第一次發(fā)現(xiàn)了 FVIII基因第I號內(nèi)含子倒位(Inversionl, Invl)突變,在大樣本重型HA患者中進(jìn)行了該倒位的篩查，發(fā)現(xiàn)第I號內(nèi)含子倒位是重型HA中僅次于第22號內(nèi)含子倒位的突變熱點(diǎn)。約50%的重型HA患者是由于內(nèi)含子22倒位和內(nèi)含子I倒位突變造成，這是近年來HA發(fā)病機(jī)制中重要的進(jìn)展。
目前血友病規(guī)范化診斷已建立了包括臨床診斷、家系調(diào)查、實(shí)驗(yàn)檢測等系列技術(shù)平臺。實(shí)驗(yàn)檢測分為基因診斷和非基因間接診斷。目前市場上所有的血友病診斷產(chǎn)品均采用非基因間接診斷，包括活化部分凝血活酶時間(APTT)、血漿凝血酶原時間(PT)、血漿FVIII C以及FVIII抗原檢測等。這些產(chǎn)品可以對HA進(jìn)行確診，但無法確定HA患者的基因突變類型更無法檢出攜帶者。因此，開發(fā)可以方便、準(zhǔn)確診斷HA的基因分型產(chǎn)品，有效應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，對避免重型血友病胎兒出生，減低HA發(fā)病率具有重要意義。
Single tube PCR assay for detection of chromosomal mutations application tothe inversion hotspot in the factor VIII gene including optionaluse of subcyclingPCR，該專利由 Qiang Liu 和 Steven S Sommer 發(fā)明，于 2002 年公開，專利號為US6355422B1。提出利用長距離PCR (Long Distance PCR，LD-PCR)法檢測血友病A內(nèi)含子22倒位突變。優(yōu)勢一管PCR法，直接分型檢測血友病A患者、攜帶者和野生型；缺限成本高昂、耗時長、僅能檢測內(nèi)含子22倒位，檢測系統(tǒng)不穩(wěn)定，試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配，無法作為臨床檢測產(chǎn)品應(yīng)用。[0007]由上海佰真生物技術(shù)有限公司申請，2011年公開，專利公開號為CN102230002A的中國發(fā)明“血友病致病基因檢測試劑盒及應(yīng)用”公開的技術(shù)方案主要針對FVIII和FIX因子外顯子區(qū)設(shè)計(jì)PCR和測序引物。優(yōu)勢同時檢測血友病A與血友病B致病基因，覆蓋全長序列；缺陷測序反應(yīng)耗時長、成本高昂，70%-80%血友病A的FVIII基因突變呈高度異質(zhì)性，突變形式復(fù)雜，測序結(jié)果難以分析。
目前，血友病A基因檢測方法主要有
LD-PCR法長距離PCR，一般指擴(kuò)增片斷超過5kb的PCR方法，但反應(yīng)體系無法滿足穩(wěn)定性和低成本要求。
Southern blot技術(shù)檢測HA內(nèi)含子22倒位,將待測的基因組DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化后，瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，凝膠經(jīng)堿處理使DNA變性，再將其從凝膠中印跡到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，以放射性或非放射性標(biāo)記的DNA探針與固相支持體上的DNA雜交，根據(jù)探針的標(biāo)記特性用相應(yīng)方法顯示雜交條帶，對待測DNA進(jìn)行分析。操作復(fù)雜、靈敏度低，已很少使用。
反向PCR法檢測HA內(nèi)含子22倒位，利用限制性內(nèi)切酶Bcl I消化基因組后突變體片段存在差異，通過酶切產(chǎn)物進(jìn)行自連，再利用PCR擴(kuò)增，電泳分析。該方法耗時長達(dá)48h以上、操作復(fù)雜、對技術(shù)要求高，不適合開發(fā)產(chǎn)品。
直接測序(DS):通過DNA測序儀對FVIII全基因直接進(jìn)行測序，找出基因突變的確切位置。但由于FVIII全基因片段很長，測序工作量大，時間長，限制了其在HA診斷上的廣泛應(yīng)用。
單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP):通過PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法檢測小片段PCR產(chǎn)物< 200bp，可篩查出點(diǎn)突變等的70%-95%。但當(dāng)PCR產(chǎn)物片段> 400bp時檢出率不足50%，要保證檢出率而使用小片段檢測大大限制了此法在HA診斷上的應(yīng)用。
變性梯度凝膠電泳(DGGE):利用野生型和突變型基因DNA在變性梯度凝膠過程中遷移率不同來檢測基因突變，當(dāng)檢測片段< 600bp時檢出率可達(dá)95%。DGGE比SSCP可靠、精準(zhǔn)、且檢測片段較長。
變性高效液相色譜(DHPLC):通過分離柱進(jìn)行突變DNA片段的分離和分析，對FVIII基因突變的檢出率達(dá)96%。此法快速高效，易于自動化，被檢片段可達(dá)1500bp，但費(fèi)用昂貴，與SSCP、DGGE法一樣需經(jīng)測序才能確定突變的具體位置。
綜上，現(xiàn)有技術(shù)中LD-PCR法由于反應(yīng)體系無法滿足穩(wěn)定性和低成本要求，僅能檢測內(nèi)含子22倒位突變而無法開展廣泛臨床應(yīng)用；測序法無法將結(jié)果分析與臨床診斷進(jìn)行有效結(jié)合；反向PCR法操作繁瑣；SSCP僅適合檢測點(diǎn)突變，DGGE和DHPLC操作繁瑣、費(fèi)用高昂、需測序確定突變的具體位置。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是運(yùn)用LD-PCR法快速靈敏地檢測HA患者的FVIII基因內(nèi)含子22和內(nèi)含子I倒位，可檢出50%的重型HA患者。
本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒，所述試劑盒包括Inv22PCR反應(yīng)液和InvlPCR反應(yīng)液；
I)所述Inv22PCR反應(yīng)液包括檢測重型血友病A致病基因內(nèi)含子22基因倒位的引物3條，分別為
引物A22 :SEQ ID NO :1
引物B22 :SEQ ID NO :2
引物C22 :SEQ ID NO :3
2)所述InvlPCR反應(yīng)液包括檢測重型血友病A致病基因內(nèi)含子22基因倒位的引物3條，分別為
引物IF= SEQIDNO[0025]引物IR= SEQIDNO[0026]引物2F= SEQIDNO6。
優(yōu)選的，上述重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒中所述Inv22PCR反應(yīng)液還包括Taq DNA聚合酶抑制劑，所述InvlPCR反應(yīng)液還包括Taq DNA聚合酶抑制劑。
優(yōu)選的，上述重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒中所述Taq DNA聚合酶抑制劑為 Taq-Antibody。
優(yōu)選的，上述重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒中所述試劑盒還包括Inv22陽性參考品、Invl陽性參考品和陰性參考品，所述Inv22陽性參考品為Inv22雜合子混合質(zhì)粒，所述Invl陽性參考品為Invl雜合子混合質(zhì)粒，所述陰性參考品為去離子水。
優(yōu)選的，上述重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒中，所述的Inv22PCR反應(yīng)液各組分含量為
2XGC buffer 25μ L ；
IOmM dATP、dCTP、dTTP 的等體積混合液2. O μ L ;
IOmM dGTP :1· 5μ L ;
ΙΟμΜ 引物 Α22 :1· 25μ L ;
ΙΟμΜ 引物 Β22 :0.625yL ;
ΙΟμΜ 引物 C22 :0.625yL ;
5U/ μ L LA taq DNA 聚合酶I. 0 μ L ;
5U/ μ L Taq-Antibody I. 0 μ L ；
去離子水11.5μ L ;
所述的InvlPCR反應(yīng)液各組分含量為
10XPCR buffer 2. 5μ L ；
2. 5mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的等體積混合液4 μ L ;
ΙΟμΜ 引物 IF :0· 5μ L ;
ΙΟμΜ 引物 IR :0· 5μ L ;
10y]/^_2F:0.5yL;
5U/ μ L Hotstar Taq 酶1· O μ L ;
5U/ μ L Taq-Antibody :0· 5 μ L ;
去離子水13.5μ L。
本發(fā)明有益效果為按照基因倒位原理，在FVIII基因內(nèi)含子22和內(nèi)含子I同源序列兩端分別設(shè)計(jì)特異性引物，基因重組后，引物對發(fā)生交叉擴(kuò)增，從而獲得不同長度的擴(kuò)增片段。本發(fā)明采用多重LD-PCR法開發(fā)高特異性的HA基因診斷產(chǎn)品。其優(yōu)點(diǎn)如下第一，解決Inv22長片斷擴(kuò)增穩(wěn)定性、檢測靈敏度、PCR產(chǎn)物量和電泳檢測豐度的問題，提高對高GC片斷的擴(kuò)增效率、篩選dNTP濃度增強(qiáng)擴(kuò)增特異性、篩選電泳條件提高檢測PCR產(chǎn)物條帶亮度；第二，通過添加Taq DNA聚合酶抑制劑解決試劑保存時間、溫度耐受等問題，提高本發(fā)明的臨床應(yīng)用的穩(wěn)定性。
圖I為本發(fā)明Inv22PCR產(chǎn)物電泳圖；其中I :Inv22雜合突變，攜帶者；2 :Inv22純合突變，HA患者；3 wild type ；4 Inv22陽性參考品；5 :陰性參考品；
圖2為本發(fā)明InvlPCR產(chǎn)物電泳圖；其中I :Invl雜合突變，攜帶者；2 wildtype ；3 =Invl純合突變，HA患者；4 =Invl陽性參考品；5 :陰性參考品；6 =Marker (2000bp,IOOObp,750bp,500bp,200bp,IOObp)。
具體實(shí)施方式
為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說明。
現(xiàn)有技術(shù)中LD-PCR法由于反應(yīng)體系無法滿足穩(wěn)定性和低成本要求、僅能檢測內(nèi)含子22倒位突變而無法開展廣泛臨床應(yīng)用；本發(fā)明利用LD-PCR技術(shù)，同時檢測重型血友病A內(nèi)含子22和內(nèi)含子I倒位突變，這兩類突變覆蓋50%的重型血友病A患者。通過添加保護(hù)劑，解決試劑穩(wěn)定性問題；優(yōu)化反應(yīng)體系，降低試劑成本，使產(chǎn)品真正應(yīng)用于臨床，填補(bǔ)國內(nèi)外血友病基因診斷廣品空白。
在FVIII基因內(nèi)含子22中有兩個基因FVIIIA和FVIIIB，而X染色體遠(yuǎn)端另有兩個與FVIIIA同源的基因。FVIIIA可與兩個同源基因之一發(fā)生同源重組，從而使FVIIIA基因內(nèi)含子22倒位至基因外遠(yuǎn)端。內(nèi)含子I倒位分子機(jī)制與Inv22相似在FVIII基因的I號內(nèi)含子內(nèi)intlh21序列和基因外遠(yuǎn)端intlh22序列同源性高達(dá)99. 9%。Intlh21和intlh22發(fā)生基因重組后可形成兩個嵌合的mRNA，F(xiàn)VIII基因轉(zhuǎn)錄被終止并與信號肽分離，導(dǎo)致FVIII蛋白合成與分泌失敗。
按照基因倒位原理，在FVIII基因內(nèi)含子22和內(nèi)含子I同源序列兩端分別設(shè)計(jì)特異性引物，基因重組后，引物對發(fā)生交叉擴(kuò)增，從而獲得不同長度的擴(kuò)增片段。據(jù)此，采用多重LD-PCR法開發(fā)高特異性的HA基因診斷產(chǎn)品。本發(fā)明從兩個角度進(jìn)行開發(fā)，第一，解決Inv22長片斷擴(kuò)增穩(wěn)定性、檢測靈敏度、PCR產(chǎn)物量和電泳檢測豐度，提高對高GC片斷的擴(kuò)增效率、增強(qiáng)擴(kuò)增特異性并提高電泳檢測分辨率；第二，為解決臨床應(yīng)用產(chǎn)品的穩(wěn)定性，通過添加Taq DNA聚合酶抑制劑解決試劑保存時間、溫度耐受等問題。
抑制劑在保存液狀態(tài)抑制PCR反應(yīng)液內(nèi)Taq DNA聚合酶活性，在PCR反應(yīng)開始后失活抑制劑，并恢復(fù)Taq DNA聚合酶活性，從而提高了 Taq DNA聚合酶對環(huán)境溫度耐受性。本發(fā)明選擇的Taq DNA聚合酶抑制劑為Taq-Antibody(Ap),它是一種Taq DNA聚合酶單克隆抗體，通過與Taq DNA聚合酶結(jié)合抑制酶活性，有效抑制引物二聚體的形成和非特異性擴(kuò)增，同時增強(qiáng)了酶的溫度耐受能力。
實(shí)施例I本發(fā)明試劑盒組成
本發(fā)明試劑盒特征包括Inv22PCR反應(yīng)液、InvlPCR反應(yīng)液、Inv22陽性參考品、Invl陽性參考品、陰性參考品。
Inv22PCR 反應(yīng)包括 Taq DNA 聚合酶、PCR buffer、Deaza-dGTP、dNTP、引物和Taq-Antibody (Ap)；
InvlPCR 反應(yīng)液包括 Taq DNA 聚合酶、PCR buffer、dNTP、引物和 Ap ；
Inv22陽性參考品是含有Inv22PCR擴(kuò)增產(chǎn)物全部片斷的混合質(zhì)粒；
Invl陽性參考品是含有Invl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物全部片斷的混合質(zhì)粒；
陰性參考品的成分為ddH20 ；
I、引物序列設(shè)計(jì)
根據(jù)已報(bào)道重型血友病A的FVIII基因倒位機(jī)制和序列，對相應(yīng)引物進(jìn)行了大量實(shí)踐的篩選，包括增加或減少引物長度，并設(shè)計(jì)系列引物覆蓋特異性區(qū)域，通過正交試驗(yàn)最終確定檢測HA內(nèi)含子22基因倒位引物3條，如表I所示，分別為A22，B22和C22 ;檢測HA內(nèi)含子I基因倒位引物3條，分別為1F、1R和2F。
權(quán)利要求
1.重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括Inv22PCR反應(yīng)液和InvlPCR反應(yīng)液；1)所述Inv22PCR反應(yīng)液包括檢測重型血友病A致病基因內(nèi)含子22基因倒位的引物3條，分別為引物 A22 SEQ ID NO 1 ；引物 B22 SEQ ID NO :2 ；引物 C22 SEQ ID NO :3 ；2)所述InvlPCR反應(yīng)液包括檢測重型血友病A致病基因內(nèi)含子22基因倒位的引物3條，分別為引物IFSEQIDNO4；引物IRSEQIDNO5 ；引物2FSEQIDNO:60
2.如權(quán)利要求
I所述的重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述Inv22PCR反應(yīng)液還包括Taq DNA聚合酶抑制劑，所述InvlPCR反應(yīng)液還包括Taq DNA聚合酶抑制劑。
3.如權(quán)利要求
2所述的重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述TaqDNA聚合酶抑制劑為Taq-Antibody。
4.如權(quán)利要求
I所述的重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括Inv22陽性參考品、Invl陽性參考品和陰性參考品,所述Inv22陽性參考品為Inv22雜合子混合質(zhì)粒，所述Invl陽性參考品為Invl雜合子混合質(zhì)粒，所述陰性參考品為去離子水。
5.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述的Inv22PCR反應(yīng)液各組分含量為2XGC buffer 25μ L ；IOmM dATP、dCTP、dTTP 的等體積混合液2. O μ L ;IOmM dGTP 1. 5μ L ；ΙΟμΜ 引物 Α22 1. 25μ L ；ΙΟμΜ 引物 Β22 0. 625μ L ；10yM^|^C22 0. 625μ L ；5U/ μ L LA taq DNA 聚合酶I. O μ L ;5U/μ L Taq-Antibody 1. O μ L ；去離子水11. 5μ L ；所述的InvlPCR反應(yīng)液各組分含量為IOXPCR buffer 2. 5μ L ；2.5mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的等體積混合液4μ L ；ΙΟμΜ 弓丨物 IF 0. 5μ L ；ΙΟμΜ 弓丨物 IR 0. 5μ L ；ΙΟμΜ 弓丨物 2F 0. 5μ L ；5U/ μ L Hotstar Taq I. O μ L ；5U/μ L Taq-Antibody 0.5 μ L ；去尚子水13. 5 μ L0
專利摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及檢測重型血友病A致病基因內(nèi)含子22和內(nèi)含子1倒位突變的試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種重型血友病A致病基因突變檢測試劑盒，包括Inv22PCR反應(yīng)液和Inv1PCR反應(yīng)液，所述Inv22PCR反應(yīng)液包括檢測重型血友病A致病基因內(nèi)含子22基因倒位的引物3條，所述Inv1PCR反應(yīng)液包括檢測重型血友病A致病基因內(nèi)含子22基因倒位的引物3條。本發(fā)明提高了Inv22長片斷擴(kuò)增穩(wěn)定性、檢測靈敏度、PCR產(chǎn)物量和電泳檢測豐度，并進(jìn)一步通過添加Taq DNA聚合酶抑制劑解決試劑保存時間、溫度耐受等問題，提高本發(fā)明的臨床應(yīng)用的穩(wěn)定性。
文檔編號C12Q1/68GKCN102943114SQ201210494686
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月28日
發(fā)明者劉晶晶, 王小薇, 朱玉華, 任維 申請人:亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan