專利名稱:用于發(fā)酵生產(chǎn)l-賴氨酸的重組dna、菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及L-賴氨酸的生產(chǎn)方法，特別涉及一種用于發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的DNA、菌株及方法，屬于微生物工程技術領域：
。
背景技術：
發(fā)酵法生產(chǎn)L-賴氨酸，大多采用從自然環(huán)境分離的微生物菌株并由此微生物菌株得到的人工突變株。已知的高產(chǎn)人工突變株大多為S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、磺胺胍(SG)、賴氨酸乙酯鹽酸鹽(Lys-OEt)等抗性，且多為高絲氨酸缺陷型或蘇氨酸缺陷型和蛋氨酸缺陷型，并且屬于埃希氏屬、棒桿菌屬，短桿菌屬。
就埃希氏屬來說，根據(jù)專利公開號CN 1423691A披露了通過增強來源于大腸桿菌脫敏的天冬氨酸激酶II1、二氫吡啶二羧酸還原酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脫酰酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和天冬氨酸- β -半醛脫氫酶來增加L-賴氨酸
的產(chǎn)量。
就棒桿菌和短桿菌屬來說，根據(jù)專利公開號CN 100451104C中的報道，通過增強
丙酮酸羧化酶、二氫吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶、L-賴氨酸輸送蛋白和二氫吡啶二羧酸還原酶來增加L-賴氨酸的產(chǎn)量。
在大腸桿菌中，L-賴氨酸合成以草酰乙酸為前體，通過過量表達來源于大腸桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，將磷酸烯醇式丙酮酸直接羧化為草酰乙酸，增加了 L-賴氨酸合成的前體；通過過量表達來源于大腸桿菌的脫敏的天冬氨酸激酶III和天冬氨酸-β -半醛脫氫酶來增加天冬氨酸代謝途徑的代謝通量；通過過量表達來源于大腸桿菌的脫敏的二氫吡啶二羧酸合酶和來源于棒桿菌的二氨基庚二酸脫氫酶來增加L-賴氨酸合成的代謝流量。
但是，上述用于增強表達大腸桿菌中L-賴氨酸合成途徑關鍵酶的質(zhì)粒都需要在表達的基因前面加入啟動子，例如專利CN 1423691Α所述的pCABDEl過量表達了 lysC、dapA、dapB、ddh、dapE這5個基因，其中dapA受Ptet啟動子的控制，lysC、dapB、ddh和dapE分別受4個Plac啟動子的控制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是克隆L-賴氨酸產(chǎn)生菌L-賴氨酸生物合成途徑關鍵酶的基因，并解析其序列。
本發(fā)明的另一目的是獲得對L-賴氨酸脫敏的天冬氨酸激酶III和二氨基庚二酸合酶。
本發(fā)明的又一目的是表達L-賴氨酸生物合成途徑的酶的基因，提高L-賴氨酸的產(chǎn)量。
此外， 本發(fā)明的目的還包括提供一種大腸桿菌菌株，其中如下L-賴氨酸生物合成途徑的酶的活性得到增強:[0011]①IysC基因編碼的天冬氨酸激酶III ；
②dapA基因編碼的二氨基庚二酸合酶；
③PPC基因編碼的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；
④asd基因編碼的天冬氨酸-β-半醛脫氫酶；
⑤ddh基因編碼的二氨基庚二酸脫氫酶。
本發(fā)明的目的還包括提供一種發(fā)酵L-賴氨酸的方法。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術方案:
一種用于發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的重組DNA，包括解除了 L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III和二氫吡啶二羧酸合酶反饋抑制的編碼天冬氨酸激酶III和二氫吡啶二羧酸合酶的DNA序列、編碼天冬氨酸-β -半醛脫氫酶的DNA序列、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的DNA序列以及編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。
具體而言，所述解除了 L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III的反饋抑制的天冬氨酸激酶III從N端開始計算，該天冬氨酸激酶111催化亞基的第318位氨基酸由蛋氨酸變?yōu)楫惲涟彼?；?23位氨基酸由甘氨酸變?yōu)樘於彼?，其序列見SEQ ID NO: 14，且該二氫吡啶二羧酸合酶調(diào)節(jié)亞基的第118位氨基酸由組氨酸變?yōu)槔野彼?，其序列見SEQ ID NO:15。
所述天冬氨酸-β -半醛脫氫酶是來源于大腸桿菌的編碼天冬氨酸-β -半醛脫氫酶，其包含與SEQ ID NO: 16實質(zhì)相同的氨基酸序列。
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是來源于大腸桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其包含與SEQ ID NO: 18實質(zhì)相同的氨基酸序列。
所述二氨基庚二酸脫氫酶是來源于棒狀桿菌的二氨基庚二酸脫氫酶，其包含與SEQ ID NO: 17實質(zhì)相同的氨基酸序列。
包含如上所述重組DNA的表達質(zhì)粒pWG-aACPD。
一種大腸桿菌，包含如上所述的重組DNA。
一種大腸桿菌，是導入如上所述的重組DNA或表達質(zhì)粒pWG-aACPD而轉(zhuǎn)化過的。
如上所述大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸工藝中的應用。
一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括:在發(fā)酵培養(yǎng)基中對如上所述的大腸桿菌進行培養(yǎng)以生產(chǎn)L-賴氨酸。
作為特別優(yōu)選的實施方案，所述培養(yǎng)溫度在37°C，培養(yǎng)時間在48h左右。
根據(jù)本發(fā)明，在大腸桿菌中表達L-賴氨酸產(chǎn)生菌種的L-賴氨酸合成基因，根據(jù)L-賴氨酸生物合成酶的最適溫度，采用高溫短時發(fā)酵，菌株的代謝強度得到提高，L-賴氨酸生物合成酶的活性提高，L-賴氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率提高。
本發(fā)明可被運用于采用棒狀桿菌的L-賴氨酸的生產(chǎn)。
為達成上述目標，本案發(fā)明人進行了長期研究和大量實踐，并發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有技術相t匕，本發(fā)明采用表達L-賴氨酸產(chǎn)生菌L-賴氨酸生物合成基因，能大大提高L-賴氨酸的產(chǎn)量；且根據(jù)L-賴氨酸生物合成酶的最適溫度，構(gòu)建發(fā)酵模型，尤其是高溫短時發(fā)酵模型，菌株的代謝強度得到提高， L-賴氨酸生物合成酶的活性提高，L-賴氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率可得到進一步提聞。
[0032]圖1是由葡萄糖生物合成L-賴氨酸路線圖及其關鍵酶基因；
圖2是表達質(zhì)粒pWG-aACPD的構(gòu)建圖譜；
圖3是大腸桿菌JNU-11/pWG-aACPD發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的進程曲線圖。
具體實施方式
作為本發(fā)明的一種典型應用方式，本發(fā)明的技術方案可以包括:
1、用于提供L-賴氨酸生物合成基因的L-賴氨酸產(chǎn)生菌株的篩選
“L-賴氨酸產(chǎn)生菌株”是指在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌株時，有在培養(yǎng)基中積累L-賴氨酸的能力。L-賴氨酸產(chǎn)生菌株大多為從自然環(huán)境分離的微生物菌株并由此微生物菌株得到的人工突變株。如營養(yǎng)缺陷型突變株、結(jié)構(gòu)類似物抗性株或者代謝調(diào)節(jié)突變株等，且營養(yǎng)缺陷型突變、結(jié)構(gòu)類似物抗性或者代謝調(diào)節(jié)突變等特性可以單獨賦予或者兩項或多項聯(lián)合賦予。已知的高產(chǎn)人工突變株大多為S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、磺胺胍(SG)、賴氨酸乙酯鹽酸鹽(Lys-OEt)等抗性，且多為高絲氨酸缺陷型或蘇氨酸缺陷型和蛋氨酸缺陷型。
L-賴氨酸產(chǎn)菌大致有:大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)和乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)等誘變選育而來。
2、L-賴氨酸產(chǎn)生菌L-賴氨酸生物合成途徑關鍵酶基因的解析和制備
L-賴氨酸生物合成途徑關鍵酶來源于上述產(chǎn)L-賴氨酸大腸桿菌，具有營養(yǎng)缺陷型突變、結(jié)構(gòu)類似物抗性和代謝調(diào)節(jié)突變的特性。
(I)用于本發(fā)明方法中編碼天冬氨酸激酶III的基因IysCf:
用于本發(fā)明方法中的編碼突變體天冬氨酸激酶III具有突變，解除了 L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III的反饋抑制:從N端開始計算，該天冬氨酸激酶III催化亞基的第318位氨基酸由蛋氨酸變?yōu)楫惲涟彼?；?23位氨基酸由甘氨酸變?yōu)樘於彼帷?br>(2)用于本發(fā)明方法中編碼突變體二氫吡啶二羧酸合酶的基因dapA*:
用于本發(fā)明方法中的編碼突變體二氫吡啶二羧酸合酶具有突變，解除了 L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III的反饋抑制:從N端開始計算，二氫吡啶二羧酸合酶調(diào)節(jié)亞基的第118位氨基酸由組氨酸變?yōu)槔野彼帷?br>(3)用于本發(fā)明方法中編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的基因asd:
用于本發(fā)明方法中編碼天冬氨酸_β -半醛脫氫酶的asd是來源于大腸桿菌的編碼天冬氨酸半醛脫氫酶。
(4)用于本發(fā)明方法中編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc:
用于本發(fā)明方法中的編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是來源于大腸桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
(5)用于本發(fā)明方法中編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因ddh:
用于本發(fā)明方法中編碼二氨基庚二酸脫氫酶的ddh是來源于棒狀桿菌的二氨基
庚二酸脫氫酶。
3、表達質(zhì)粒pWG-aACPD的構(gòu)建
將上述獲得的 L-賴氨酸產(chǎn)生菌L-賴氨酸生物合成途徑的酶的基因與合適的表達載體相連，如PDXW-8 (參閱公開號為CN101693901A的發(fā)明專利)。在pDXW_8的基礎上構(gòu)建了表達質(zhì)粒pWG-aACPD，其含有雙Ptac啟動子，分別控制L-賴氨酸合成途徑的5個關鍵基因的表達，其中asd、IysCf和dapA*受一個Ptac啟動子的控制,ppc和ddh受另外一個Ptac啟動子的控制。前述Ptac啟動子是由Plac和Ptrp啟動子人工構(gòu)建的雜合啟動子，受Iac阻遏蛋白的負調(diào)節(jié)，其啟動能力要比Plac啟動子強的多，所以不用每個基因前面都加入啟動子。
4、大腸桿菌JNU-11/pWG-aACPD基因工程菌的構(gòu)建
將上述構(gòu)建的表達質(zhì)粒pWG-aACPD轉(zhuǎn)化大腸桿菌JNU-1l宿主菌，構(gòu)建JNU-1l/pWG-aACPD基因工程菌。
5、利用構(gòu)建的大腸桿菌JNU-11/pWG-aACPD基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸
可采用常規(guī)方法進行培養(yǎng)，采用典型培養(yǎng)基，其中含有碳源、氮源、礦物質(zhì)、以及所需要的諸如氨基酸、維生素等微量有機營養(yǎng)物。另外，合成或天然的培養(yǎng)基均可采用。只要菌株可以利用以進行培養(yǎng)，任何碳源和氮源均可采用。
就碳源而言，諸如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解糖，糖蜜等糖類，以及諸如醋酸、檸檬酸等有機酸均可采用。另外，乙醇等醇類也可以單獨或者與其他碳源組合使用。
就有機營養(yǎng)而言，氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸，酵母提取物，玉米漿、大豆蛋白分解產(chǎn)物等物質(zhì)均可采用。當某種營養(yǎng)缺陷型突變株的生長需要一種氨基酸或類似的物質(zhì)時，優(yōu)先添加該需要營養(yǎng)物。
就礦物質(zhì)而言，磷酸鹽、鎂鹽、鐵鹽、錳鹽等均可采用。
培養(yǎng)條件為好氧，相對溶氧20%-50%為宜。培養(yǎng)溫度控制在20-45°C，pH5_9，培養(yǎng)過程中PH下降時，可以加入氨水或氣氨之類的堿予以中和。用上述方法培養(yǎng)20-50h后，培養(yǎng)基中就會積累大量的L-賴氨酸。
培養(yǎng)結(jié)束后，可以采用常規(guī)方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中收集L-賴氨酸。
發(fā)酵過程中，檢測0D、殘?zhí)?、L-賴氨酸濃度，并控制殘?zhí)菨舛仍?0_15g/L左右，繪制發(fā)酵過程曲線。
以下結(jié)合若干較佳實施例對本發(fā)明的技術方案作更為詳細的說明:
實施例1大腸桿菌JM109感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化
①將用20%甘油冷凍保藏的菌液，在相應抗性的LB平板上劃線，于37°C恒溫箱隔夜培養(yǎng)，待長出單菌落后，接單菌于15mL相應抗性的LB液體培養(yǎng)基，于37°C，100r/min搖床隔夜培養(yǎng)；
②將隔夜培養(yǎng)物按I %的接種量轉(zhuǎn)接于50mL/500mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，于37°C，100r/min搖床培養(yǎng)約1.5_2h，待0D600約為0.5，冰浴IOmin ；
③4 °C, 5，000r/min離心IOmin,丟棄上清，收集菌體；將菌體重懸于20ml100mmol/L的CaCl2溶液中，冰浴20min ；4°C, 5, 000r/min離心IOmin,丟棄上清,收集菌體；
⑤取ImL IOOmmoI/L的CaCl2溶液(含有15%甘油)慢慢吹吸輕柔懸浮菌體；
⑥取70 μ L分裝于滅菌1.5mL離心管中，直接用于轉(zhuǎn)化或者_20°C保存；
⑦取2 μ L質(zhì)?；?0 μ L酶連產(chǎn)物,待感受態(tài)于冰上融化后，慢慢吹吸輕柔混勻后冰浴30min ；[0071]⑧42°C熱激90s后冰浴lmin，加入ImL新鮮LB或者SOC培養(yǎng)基，37°C復蘇Ih ；
⑨8，000 Xg離心lmin，棄上清，取100 μ L，吹吸混勻后涂布相應的抗性平板。
⑩于37°C恒溫箱培養(yǎng)10_12h，待長出轉(zhuǎn)化子后挑取轉(zhuǎn)化子于相應抗性的LB液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)12h后，抽提質(zhì)粒進行酶切驗證質(zhì)粒連接是否正確。
實施例2表達質(zhì)粒pWG-aACPD的構(gòu)建
①dapA*、lysC*、ddh、ppc、asd、XXXlysC 基因的克隆:以 E.coli JNU-1l 基因組作為模板，SEQ ID NO:1(含SD序列)和SEQ ID NO:2為引物，PCR獲得dapA ;以E.coliJNU-1l基因組作為模板，SEQ ID NO:3(含SD序列)和SEQ ID NO:4為引物，PCR獲得IysC ;以 C.glutamicum ATCC 13032 基因組作為模板，SEQ ID NO:5(含 SD 序列)和 SEQ ID NO:6為引物，PCR獲得ddh ;以E.coli JNU-1l基因組作為模板，SEQ ID N0:7(含SD序列)和SEQ ID NO:8為引物，PCR獲得ppc ;以E.coli JNU-11基因組作為模板，SEQ ID N0:3(含SD 序列)和 SEQ ID NO:13 為引物，PCR 獲得 XXXlysC0
②dapA*片段與T載體相連為pMD-19T_dapA ；asd片段與T載體相連為pMD-19T-asd ；dapA* 片段與 pMD-19T_asd 通過 Kpn I 切點連接，獲得 pMD-19T-asd_dapA* ；lysC* 和 pMD-19T-asd_dapA* 通過 Sac I 單切點進行連接，獲得 pMD-19T-asd_dapA*-lysC* ；用 EcoR I 酶切 pMD-19T-asd-dapA*-lysC* 獲得 EcoR 1-asd-dapA*-lysC*-EcoR I 片段。
③ddh片段與pUC19通過EcoR I單切點進行連接，獲得pUC19_ddh ；ppc片段與pUC19-ddh通過Sac I單切點進行連接，獲得pUC19_ddh-ppc。
④pDXW-8Nco I 切點的去除:XXXlysC 用 Kpn I 酶切后得到 Kpn 1-XXXlysC-KpnI，通過Kpn I單切點與pDXW-8連接，用EcoR I酶切去除包含Nco I在內(nèi)的大部分XXXlysC片段，得到去除Nco I切點的pDXW-8X。
⑤EcoR 1-asd-dapA*-lysC*-EcoR I 和 pDXff-8X 用 EcoR I 進行連接，命名為pDXW-8X-asd-dapA*-lysC*，并以之為模板，用 SEQ ID N0:11 和 SEQ ID NO:12 為引物，PCR得到 Ptac-asd_dapA*-lysC*。
⑥Ptac-asd-dapA*-lysC*片段和pDXW-8的連接通過BamH I和Xba I進行連接，獲得 pWG-aAC。
⑦以pUC19-ddh-ppc 為模板，SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:8 為引物，PCR 得到ddh-ppc ；ddh-ppc和pWG-aAC通過Nco I單切點進行連接,得到表達質(zhì)粒pWG-aACPD。
實施例3大腸桿菌JNU-1I/pWG-aACPD基因工程菌的構(gòu)建
(I)大腸桿菌JNU-1l感受態(tài)制備
①接單菌于相應抗性的15mL LB培養(yǎng)基,于合適溫度下隔夜培養(yǎng)；
②按I %的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的IOOmL液體LB培養(yǎng)基(如需要，則加入L-阿拉伯糖進行誘導)，于合適溫度下培養(yǎng)至0D600約為0.5 ；
③冰上冷卻IOmin, 4V, 5, 000r/min離心IOmin,丟棄上清，收集菌體；
④用20mL預冷的10 %甘油洗滌4次；
⑤用ImL 10%甘油重懸后，取合適體積的感受態(tài)細胞和適量pWG-aACPD于Imm電擊杯混勻，置冰IOmin ；
(2)轉(zhuǎn)化
①1800V，5ms 電擊一次， 電擊參數(shù):Tc (ms) 5，Volt(V) 1800, Cap (μ Fd) 25，Res(Q)200 ；
②立即加入預熱到37°C的SOC培養(yǎng)基lmL，37°C復蘇2h ；
③8，000 Xg離心lmin，留100 μ L，其余上清丟棄，吹吸混勻后涂布相應的抗性平板，37°C培養(yǎng)12h ；
④將長出的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h后抽提質(zhì)粒進行酶切鑒定是否為正確導入pWG-aACPD。
實施例4利用大腸桿菌JNU-11/pWG-aACPD基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸
經(jīng)液體種子培養(yǎng)基、液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基對上述大腸桿菌JNU-11/pWG-aACPD基因工程菌進行培養(yǎng)，生產(chǎn)L-賴氨酸，其中，
①液體種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖25，硫酸銨14，玉米漿45，KH2P040.5,MgSO4.7Η201，F(xiàn)eSO4.7Η20 0.01，MnSO4.4Η20 0.01、碳酸鈣 40。種子培養(yǎng)基裝液量 50mL/500mL，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，培養(yǎng)時間12h。
②液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40，硫酸銨40，玉米漿20，KH2PO40.5，MgS04*7H20 LFeSO4.7Η20 0.0LMnSO4.4Η20 0.01，生物素 0.1，甜菜堿 0.03，碳酸鈣 40。液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量25mL/500mL，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，發(fā)酵時間48h，接種量10%。
權利要求
1.用于發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的重組DNA，其特征在于:包括解除了L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III和二氫吡啶二羧酸合酶反饋抑制的編碼天冬氨酸激酶III和二氫吡啶二羧酸合酶的DNA序列、編碼天冬氨酸- β -半醛脫氫酶的DNA序列、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的DNA序列以及編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。
2.如權利要求
1所述的用于發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的重組DNA，其特征在于，所述解除了L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III的反饋抑制的天冬氨酸激酶III，從N端開始計算，該天冬氨酸激酶III催化亞基的第318位氨基酸由蛋氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔?23位氨基酸由甘氨酸變?yōu)樘於彼?；并且該二氫吡啶二羧酸合酶調(diào)節(jié)亞基的第118位氨基酸由組氨酸變?yōu)槔野彼帷?br>3.如權利要求
1所述的用于發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的重組DNA，其特征在于，所述天冬氨酸-β -半醛脫氫酶來源于大腸桿菌的編碼天冬氨酸-β -半醛脫氫酶。
4.如權利要求
1所述的用于發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的重組DNA，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶來源于大腸桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
5.如權利要求
1所述的用于發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的重組DNA，其特征在于，所述二氨基庚二酸脫氫酶來源于棒狀桿菌的二氨基庚二酸脫氫酶。
6.包含如權利要求
1-5中任一項所述重組DNA的表達質(zhì)粒pWG-aACPD。
7.一種大腸桿菌，其特征在于，它包含如權利要求
1-5中任一項所述的重組DNA。
8.一種大腸桿菌，其特征在于，其特征在于，它是導入如權利要求
1-5中任一項所述的重組DNA或如權利要求
6所述的表達質(zhì)粒pWG-aACPD而轉(zhuǎn)化過的。
8.如權利要求
7或8所述大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸工藝中的應用。
9.一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法,其特征在于,包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中對如權利要求
7或8所述的大腸桿菌進行培養(yǎng)以生產(chǎn)L-賴氨酸。
10.根據(jù)權利要求
9所述生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)溫度在37°C，培養(yǎng)時間在48h以上。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種用于發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的重組DNA、菌株及其應用。該重組DNA包含解除了L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III和二氫吡啶二羧酸合酶反饋抑制的編碼天冬氨酸激酶III和二氫吡啶二羧酸合酶的DNA序列、編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶的DNA序列、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的DNA序列以及編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。該菌株包含導入上述重組DNA而轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌。本發(fā)明采用表達L-賴氨酸產(chǎn)生菌L-賴氨酸生物合成基因，能大大提高L-賴氨酸的產(chǎn)量；且根據(jù)控制發(fā)酵過程中的葡萄糖和硫酸銨濃度使L-賴氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率可得到進一步提高。
文檔編號C12N15/54GKCN103215286SQ201210450748
公開日2013年7月24日 申請日期2012年11月12日
發(fā)明者張偉國, 宋燦輝, 錢和 申請人:江南大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan