專利名稱:優(yōu)化的甘露聚糖酶基因及其重組植物表達載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及優(yōu)化的甘露聚糖酶基因以及含有該優(yōu)化基因的重組植物表達載體，本發(fā)明進一步涉及它們在制備表達甘露聚糖酶轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，屬于轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘露聚糖是植物半纖維素的主要成份之一，以β -I, 4-D-吡喃甘露糖苷鍵連接而成的線性多糖，分為甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖。在飼料作物(如麥類、豆柏、玉米)中不能被單胃動物分解，是目前大量應(yīng)用的玉米/豆柏型飼料中主要的抗營養(yǎng)因子。它們能結(jié)合大量的水，使采食動物消化道中食糜的體積增大、粘度增加、養(yǎng)分與消化道內(nèi)源酶的作用降低、營養(yǎng)物質(zhì)的消化率下降。造成動物生長受阻、飼料轉(zhuǎn)化率降低，從而使其代謝受到抑制(Liepman AH, et al. , Plant Physiol 143:1881β-甘露聚糖酶(EC3. 2. 1.78):水解β _1，4_D_吡喃甘露糖為主鏈的內(nèi)切水解酶，作用底物主要是甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、以及半乳葡萄甘露聚糖。主要來源于低等動物、植物、微生物，微生物來源的β_甘露聚糖酶具有活力高、成本低、來源穩(wěn)定、提取方便等明顯優(yōu)點，已在實際生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究中得到廣泛應(yīng)用。在飼料行業(yè)上的應(yīng)用，有如下功效降解甘露聚糖為甘露寡糖，降低抗營養(yǎng)作用；甘露寡糖具有免疫原性，刺激和增強免疫反應(yīng)；調(diào)控動物胃腸道微生態(tài)環(huán)境，促進有益菌生長，抑制有害菌黏附能(McCleary BV, Method Enzymol 160:596現(xiàn)在生產(chǎn)上通常需要添加甘露聚糖酶制劑來改善動物對飼料的利用效率，減輕動物黏性糞便造成的環(huán)境污染問題。已經(jīng)利用微生物發(fā)酵進行飼用甘露聚糖酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并在飼料工業(yè)中廣泛應(yīng)用。
利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)飼用酶，其優(yōu)勢在于1)轉(zhuǎn)基因植物尤其是轉(zhuǎn)基因玉米用作飼料原料，可以直接飼喂，而省去目前酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)和添加過程；2)生產(chǎn)規(guī)模不受限制，成本比較低。農(nóng)作物的生產(chǎn)、運輸、加工和貯藏等各種基礎(chǔ)設(shè)施及技術(shù)早已具備，轉(zhuǎn)基因植物高水平表達生產(chǎn)重組蛋白可以通過大規(guī)模種植來完成；3)目前初步的研究發(fā)現(xiàn)，在植物，尤其是種子中表達的非淀粉多糖酶具有更好的貯存穩(wěn)定性和抗逆性；4)安全性好，用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑，細胞培養(yǎng)過程中污染極其普遍，但在植物表達系統(tǒng)中沒有這種污染。
玉米為“飼料之王”，是中國最主要的能量飼料糧之一，也是畜禽生產(chǎn)肉、蛋、奶的重要來源，其用量占配合飼料成份的60-70%玉米籽粒作為動物飼料最主要的成分，在作為生物反應(yīng)器這一層面上，與其它飼料作物相比，轉(zhuǎn)基因玉米有更好的經(jīng)濟效益和應(yīng)用前景。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和新技術(shù)的綜合應(yīng)用，玉米已成為最重要的糧食、飼料和經(jīng)濟兼用作物。所以，加強優(yōu)質(zhì)、專用和資源高效飼用型玉米新品種的培育和推廣具有十分重要的現(xiàn)實意義。[0007]來源于Bispora sp. MEY-1的甘露聚糖酶具有較優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)(Luo H, etal. , Appl Microbiol Biotechnol 82:453-461，2009)。它是目前分離到的比較好的能適用于飼料產(chǎn)業(yè)中的酸性甘露聚糖酶，但是該酶在玉米等農(nóng)作物中表達仍然存在表達效率低、穩(wěn)定性差等缺陷。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種能夠在玉米等農(nóng)作物種子中高效表達、穩(wěn)定性好的優(yōu)化的甘露聚糖酶基因；
本發(fā)明的目的之二是提供含有原始甘露聚糖酶基因或優(yōu)化的甘露聚糖酶基因的重組植物表達載體；
本發(fā)明的目的之三是提供一種制備表達甘露聚糖酶轉(zhuǎn)基因植物的方法。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的·
為了提高甘露聚糖酶基因在作物(尤其是玉米)中的表達效率和穩(wěn)定性，本發(fā)明將來源于 Bispora sp. MEY-1 的原始甘露聚糖酶基因(MAN5A_SST)(SEQ ID NO. 2XEU919724)通過密碼子優(yōu)化以及提高mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等措施，得到SEQ ID NO. I所示的優(yōu)化的甘露聚糖酶基因(MAN5AS)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有原始甘露聚糖酶基因或優(yōu)化的甘露聚糖酶基因的重組植物表達載體，該重組植物表達載體包括啟動子序列、原始甘露聚糖酶基因或優(yōu)化的甘露聚糖酶基因，信號肽和蛋白體定位序列以及終止子序列。
其中所述的啟動子可以為單子葉植物組成型啟動子，如Ubi啟動子或CaMV35S啟動子，也可以是單子葉植物誘導(dǎo)型啟動子，還可以是單子葉植物組織特異性啟動子；所述的玉米胚特異表達的啟動子和終止子可分別根據(jù)GenBank登記號L22344和L22345設(shè)計引物，分別擴增得到來自于玉米基因組DNA中玉米胚芽蛋白的啟動子和終止子片段。所述的玉米胚乳特異表達的啟動子和終止子序列可根據(jù)文獻(Woo, et al. 2001，Plant cell.Oct. 13(10) :2297-317)來設(shè)計引物分離得到。優(yōu)選的，本發(fā)明中所述的啟動子序列是專利申請公開號為CN 101153285A (發(fā)明名稱為“一種表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中所公開的SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
所述的優(yōu)化的甘露聚糖酶基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示；所述的原始甘露聚糖酶基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
所述的信號肽和蛋白體定位序列可以是專利申請公開號為CN 101153285A (發(fā)明名稱為“一種表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中所公開的SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列(引導(dǎo)基因產(chǎn)物分泌和定位的信號肽序列，控制基因產(chǎn)物的定位，該信號肽和蛋白體定位序列可以引導(dǎo)植酸酶定位到細胞的蛋白體中)。
所述的終止子序列可以是專利申請公開號為CN 101153285A (發(fā)明名稱為“一種表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中所公開的SEQ IDNO 4或SEQ ID NO :6所示的序列。
本發(fā)明的再一目的是提供一種制備表達甘露聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括以下步驟
(I)構(gòu)建含有SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示基因的重組植物表達載體；[0020](2)將所構(gòu)建的重組植物表達載體轉(zhuǎn)化到受體農(nóng)作物中，篩選獲得高效表達甘露聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物。
優(yōu)選的，步驟(I)中所述的重組植物表達載體的構(gòu)建方法包括將信號肽和蛋白體定位序列，SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示的甘露聚糖酶基因和終止子序列連接在一起后，可操作的連接到啟動子序列之后。
作為一個具體的實施方案，可以將SEQ ID NO. I所示的基因可操作的與植物表達載體pHP20754連接，即得到能在玉米等植物中高效表達甘露聚糖酶的重組植物表達載體；其中，所述植物表達載體PHP20754的構(gòu)建方法已在專利申請公開號為CN101153285A (發(fā)明名稱為“一種表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中詳細公開。
其中，所述“可操作的連接”是指兩個或更多個元件之間功能性的連接，可操作連接的元件可為鄰接或非鄰接的；所述的植物表達載體可以由Y端非編碼區(qū)，SEQID No. I 所示的核苷酸和3'非編碼區(qū)組成，其中，所述的5'端非編碼區(qū)可以包括啟動子序列、增強子序列或/和翻譯增強序列；所述的啟動子可以是組成性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織或器官特異性啟動子；所述的3'非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等。合適的終止子序列可取自根癌農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒，例如章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶終止區(qū)。
所述的植物重組表達載體轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物的方法可為植物工程領(lǐng)域常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、PEG介導(dǎo)法、種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)法、電擊穿孔法或微注射法，本發(fā)明優(yōu)選為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法或基因槍法，最優(yōu)選為基因槍法。
所述的受體農(nóng)作物優(yōu)選為油菜、玉米、大豆或小麥，更優(yōu)選為玉米。
本發(fā)明所述的植物外植體優(yōu)選為玉米幼胚或幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織。
為了便于篩選陽性植株同時為了確保安全性的要求，本發(fā)明同時選用了植株選擇標記基因的表達載體。將本發(fā)明的重組植物表達載體與植物選擇標記基因表達載體共同轉(zhuǎn)化受體作物，選育得到表達甘露聚糖酶而不含篩選標記基因的轉(zhuǎn)基因作物。通過共轉(zhuǎn)化策略，將抗性選擇基因和甘露聚糖酶分別構(gòu)建于不同的表達載體上。在轉(zhuǎn)基因植物的后代選育中，可以利用后代分離得到表達甘露聚糖酶且不含篩選標記基因的轉(zhuǎn)基因植物。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的選擇標記基因表達載體為pHP17042Bar ;所述選擇標記基因表達載體pHP17042Bar的構(gòu)建方法已在專利申請公開號為CN 101153285A (發(fā)明名稱為“一種表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中詳細公開。
本發(fā)明將來源于Bispora sp. MEY-I的原始甘露聚糖酶基因(SEQ ID NO. 2)通過優(yōu)化密碼子、提高mRNA 二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等措施，得到SEQ ID NO. I所示的優(yōu)化的甘露聚糖酶基因(MAN5AS);本發(fā)明進一步構(gòu)建了含有所述優(yōu)化的甘露聚糖酶基因的重組植物表達載體并將其轉(zhuǎn)化到玉米中，通過PCR、Southern blot、Western blot等方法篩選得到陽性轉(zhuǎn)甘露聚糖酶基因植株。所得到的轉(zhuǎn)甘露聚糖酶基因玉米植物可以在種子中高效表達甘露聚糖酶，轉(zhuǎn)基因玉米中甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)測定表明，優(yōu)化后的甘露聚糖酶基因(MAN5AS)能在轉(zhuǎn)基因玉米中穩(wěn)定表達及遺傳，優(yōu)化的甘露聚糖酶MAN5AS酶活顯著高于未經(jīng)優(yōu)化的甘露聚糖酶MAN5A-SST。甘露聚糖酶的穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，優(yōu)化后的甘露聚糖酶基因MAN5AS在玉米中所表達的穩(wěn)定性較原始的甘露聚糖酶基因MAN5A-SST在玉米中的穩(wěn)定性有顯著的提聞。[0030]本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義
除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
術(shù)語“基因” “核苷酸”或“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制， 否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J. Biol.Chem. 260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ; Rossolini 等人，Mol Cell. Probes8:91-98(1994))。
術(shù)語“表達”指外源基因在宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將外源基因引入到宿主細胞中的方法。
圖I原始的甘露聚糖酶基因(MAN5A-SST)的有關(guān)GC含量、CFD等信息。
圖2優(yōu)化后的甘露聚糖酶基因(MAN5AS)的有關(guān)GC含量、CFD等信息。
圖3甘露聚糖酶基因密碼子優(yōu)化前后的mRNA的二維結(jié)構(gòu)。
圖4甘露聚糖酶植物重組表達載體示意圖。
圖5pHP20754_MAN5AS 表達盒示意圖。
圖6轉(zhuǎn)基因植株(BCl代)PCR檢測結(jié)果；A)1，Ikb分子量標準；2_10，轉(zhuǎn)基因植株；11，陽性對照；12，陰性對照。B)內(nèi)參基因act in PCR檢測結(jié)果。
圖7轉(zhuǎn)基因事件22玉米植株的Southern-blot結(jié)果；I, Ikb分子量標準；
2-4HindIII酶切；7圖8轉(zhuǎn)基因玉米表達甘露聚糖的Western blot分析；A)SDS_PAGE結(jié)果，1-3轉(zhuǎn)基因植株；2分子量標準，4陰性對照，5陽性對照；B)對應(yīng)的Western blot結(jié)果；C)組織特異性Western blot檢驗，I :分子量標準，2-3 :植株T042-5及EndoH處理，4-5 :植株T041-20及EndoH處理，6 :陰性對照，7 :陽性對照，8_10 :分別為陽性植株的根莖葉。
圖9轉(zhuǎn)基因玉米表達甘露聚糖酶的性質(zhì)分析。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。[0045]實驗材料
I、載體合成的基因MAN4AS保存于pUC57MCS上。植物表達載體為中國專利申請公開號為CN 101153285A的專利申請公布文件中所公開的植物表達載體pHP20754 ;選擇標記基因表達載體也為公開號為CN 101153285A的專利申請公布文件中所公開的選擇標記基因表達載體pHP17042Bar。
2、試劑盒膠回收試劑盒購自Takara及Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司。
3、化學(xué)試劑甘露聚糖及角豆膠購自于Sigma公司。
4、基因槍購自于 BIO-RAD 的 SPEX Geno/Grinder 201OHigh-throughput tissuehomogenizer
5、抗血清由中國科學(xué)院遺傳所實驗動物中心完成；堿性磷酸酶標記羊抗兔IgG購自于北京中原公司；BCIP/NBT試劑盒購自于北京莊盟國際生物基因科技有限公司。
6、本發(fā)明中所涉及到的引物及其序列見表I :
表I
權(quán)利要求
1.優(yōu)化的甘露聚糖酶基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQID NO. I所示。
2.含有權(quán)利要求
I所述優(yōu)化的甘露聚糖酶基因的重組表達載體；優(yōu)選的，所述重組表達載體是重組植物表達載體。
3.—種重組植物表達載體，其特征在于，包括啟動子序列、原始的甘露聚糖酶基因或權(quán)利要求
I所述的優(yōu)化的甘露聚糖酶基因，信號肽和蛋白體定位序列以及終止子序列。
4.按照權(quán)利要求
3所述的重組植物表達載體，其特征在于所述的啟動子為單子葉植物組成型啟動子、單子葉植物誘導(dǎo)型啟動子或單子葉植物組織特異性啟動子。
5.一種構(gòu)建權(quán)利要求
3或4所述重組植物表達載體的方法，包括將信號肽和蛋白體定位序列，原始的甘露聚糖酶基因或權(quán)利要求
I所述的優(yōu)化的甘露聚糖酶基因和終止子序列連接在一起后，可 呆作的連接到啟動子序列之后。
6.一種制備表達甘露聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括以下步驟 (1)構(gòu)建含有原始甘露聚糖酶基因或權(quán)利要求
I所述優(yōu)化的甘露聚糖酶基因的重組植物表達載體； (2)將所構(gòu)建的重組植物表達載體轉(zhuǎn)化到受體農(nóng)作物中，篩選獲得表達甘露聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物。
7.按照權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于所述的重組植物表達載體的構(gòu)建方法包括將信號肽和蛋白體定位序列，原始的甘露聚糖酶基因或權(quán)利要求
I所述的優(yōu)化的甘露聚糖酶基因和終止子序列連接在一起后，可操作的連接到啟動子序列之后；所述的啟動子為單子葉植物組成型啟動子、單子葉植物誘導(dǎo)型啟動子或單子葉植物組織特異性啟動子。
8.按照權(quán)利要求
6所述的方法,其特征在于將所構(gòu)建的重組植物表達載體與植物選擇標記基因表達載體共同轉(zhuǎn)化受體作物，選育得到表達甘露聚糖酶而不含篩選標記基因的轉(zhuǎn)基因作物。
9.按照權(quán)利要求
8所述的方法，其特征在于所述的選擇標記基因表達載體為pHP17042Bar。
10.按照權(quán)利要求
6或8所述的方法，其特征在于所述的受體農(nóng)作物為玉米、油菜、大豆或小麥。
專利摘要
本發(fā)明公開了優(yōu)化的甘露聚糖酶基因及其重組植物表達載體和應(yīng)用。本發(fā)明將甘露聚糖酶基因通過密碼子優(yōu)化以及提高mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等措施得到SEQ ID NO.1所示的優(yōu)化甘露聚糖酶基因；本發(fā)明進一步構(gòu)建了含有原始甘露聚糖酶基因或優(yōu)化甘露聚糖酶基因的重組植物表達載體并將其轉(zhuǎn)化到玉米中篩選得到種子中高效表達甘露聚糖酶的轉(zhuǎn)甘露聚糖酶基因玉米植株；酶學(xué)性質(zhì)測定表明，優(yōu)化的甘露聚糖酶基因能在玉米中穩(wěn)定、高效的表達及遺傳，所表達的甘露聚糖酶酶活以及穩(wěn)定性顯著高于原始甘露聚糖基因在玉米中所表達的甘露聚糖酶的酶活及穩(wěn)定性。
文檔編號C12N15/56GKCN102888419SQ201210431932
公開日2013年1月23日 申請日期2012年11月1日
發(fā)明者姚斌, 楊培龍, 孟昆, 張宇宏, 徐曉露, 袁建華, 陳茹梅, 孟慶長, 張偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan