專利名稱:轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米或飼料中植酸酶基因的定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因種子或含有該轉(zhuǎn)基因種子的飼料中轉(zhuǎn)基因含量的檢測方法，尤其涉及一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料中植酸酶基因的定量檢測方法，屬于轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的定量檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1996至2010年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在十五年間增長了 87倍，截止2010年達(dá)到I. 48億公頃，且每年都以10%以上的速度增長。迄今為止，共有59個國家批準(zhǔn)種植或進(jìn)口生物技術(shù)作物用于食物和飼料，其中包括29個國家批準(zhǔn)了生物技術(shù)作物的本地化種植，全世界75%的人口居住在這59個國家。截至目前所發(fā)展的轉(zhuǎn)基因植物中，轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、油菜籽和馬鈴薯等都與飼料有關(guān)，用于動物的日糧中，其中占轉(zhuǎn)基因植物總種植面積80%以上的玉米和大豆在飼料中廣泛應(yīng)用。世界上每年約有4000萬噸轉(zhuǎn)基因玉米用于飼喂動物。大豆和豆柏是飼料中的主要蛋白原料，因此用作飼料的轉(zhuǎn)基因大豆也有約7400多萬噸。加上棉籽柏和油菜籽柏，每年用于飼料的轉(zhuǎn)基因植物約為I. 2億噸以上。并且由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，目前已有60 70%的飼料原料與轉(zhuǎn)基因植物相關(guān)，例如抗蟲的轉(zhuǎn)基因玉米和棉花，抗草甘膦的玉米和大豆等。正是由于轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展迅猛，因此對轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測方法也成為當(dāng)今關(guān)注的技術(shù)。
玉米為中國的第一大糧食作物。2011年，中國玉米播種面積已達(dá)到4. 8億畝，位居世界第二。中國玉米總需求量的近80%作為飼料，并且這個比例還在不斷增加。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米于2009年8月獲中國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書》，獲準(zhǔn)進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用，它是中國第一例批準(zhǔn)生產(chǎn)應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因玉米。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米是以玉米種子作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)植酸酶,通過生物技術(shù)和傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合,將具有自主知識產(chǎn)權(quán)的植酸酶基因轉(zhuǎn)化到玉米中，培育出具有高活性植酸酶并穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因玉米。植酸酶在動物的胃中釋放出來而降解飼料中的植酸磷，從而解決了飼料中植酸磷不能被動物吸收利用和導(dǎo)致環(huán)境污染等諸多問題。正是由于植酸酶所具有的安全、環(huán)保、高效、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)以及很好的社會生態(tài)環(huán)境效益，因此，在歐洲大部分國家已強(qiáng)制在飼料中使用植酸酶，目前中國市場上的單胃動物飼料中已經(jīng)有90 %添加了植酸酶，植酸酶的推廣應(yīng)用可使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷的排出量減少40%，從而減少飼料中無機(jī)磷的添加量，降低飼料成本，減少高磷糞便造成的環(huán)境污染，還可降低植酸鹽的抗?fàn)I養(yǎng)作用，因此對提高畜牧生產(chǎn)效益及降低其對環(huán)境的污染有重要意義。在轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米誕生之前，在飼料中廣泛使用的植酸酶是通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)的，而轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米使用將更為經(jīng)濟(jì)、方便、有效。按照目前的飼料工業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的市場需求量為每年5000萬噸(1000單位植酸酶/公斤玉米種子)，應(yīng)用后可替代飼料中所添加的磷酸氫鈣80萬噸，減少動物糞便中磷的排除量100萬噸并降低飼料成本20億元。
隨著轉(zhuǎn)基因玉米的不斷商品化，針對該類產(chǎn)品的檢測方法也需要盡快完善。目前，轉(zhuǎn)基因作物的檢測方法主要包括核酸水平和蛋白質(zhì)水平的檢測。其中，核酸水平檢測分為定性和定量檢測，定性常用的方法是PCR檢測技術(shù)，通過對樣品中可能含有的外源基因進(jìn)行擴(kuò)增，再利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，如果電泳結(jié)果含有特異條帶，說明樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分。定量檢測常用的是實(shí)時熒光定量PCR檢測，通過收集熒光信號判斷待測樣品的初始拷貝數(shù)，從而判斷待測樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。
對于轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米核酸水平上的檢測，現(xiàn)有技術(shù)(中國專利申請公開號CN101792811A.CN101792812A等)僅僅能夠?qū)崿F(xiàn)定性檢測，有待改進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種定量檢測轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料中植酸酶基因含量的方法。
本發(fā)明的主要目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子的飼料中植酸酶基因的定量檢測方法，包括以下步驟
(I)建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程；(2)以待檢測樣品的DNA為模板，以擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因的一對特異引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得待檢測樣品的DNA中內(nèi)參基因的Ct值；以待檢測樣品的DNA為模板，以擴(kuò)增植酸酶基因的一對特異引物或者是擴(kuò)增植酸酶基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與植酸酶基因結(jié)合區(qū)域的一對特異引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得待檢測樣品的DNA中植酸酶基因的Ct值；計(jì)算出二次實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增的Ct值差值，將Ct值差值代入步驟(I)所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程，得到待檢測樣品中植酸酶基因的含量。
其中，所述轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立
(I)制備轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的標(biāo)準(zhǔn)品DNA或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA ； (2)以所制備的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，以擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因的一對特異引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值；以所制備的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，以擴(kuò)增植酸酶基因的一對特異引物或者是擴(kuò)增植酸酶基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與植酸酶基因結(jié)合區(qū)域的一對特異引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得標(biāo)準(zhǔn)品DNA中植酸酶基因的Ct值；(3)建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程；
所述轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按照以下方法制備得到將轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA與非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA按梯度比例混合，混合后控制轉(zhuǎn)基因玉米DNA含量(按質(zhì)量百分比計(jì))分別為O. 5%，1%，2%，5%，10% ；
所述含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按照以下方法制備得到將添加有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料基因組DNA與未添加轉(zhuǎn)基因玉米的飼料基因組DNA按照梯度比例混合，混合后控制轉(zhuǎn)植酸酶基因飼料的基因組DNA含量(按質(zhì)量百分比計(jì))分別為2%，5%，10%，20%，50%。
優(yōu)選的，步驟(3)所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR儀中的軟件記錄下檢測得到的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值和轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品DNA中植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值為縱坐標(biāo)，以轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品DNA中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA含量(O. 5%，1%，2%，5%，10%)(按質(zhì)量百分比計(jì))含量為橫坐標(biāo)，建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
步驟(3)所述的含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR儀中的軟件記錄下檢測得到的含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)DNA中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的基因組DNA含量(2%，5%，10%，20%，50% )(按質(zhì)量百分比計(jì))為橫坐標(biāo)，建立含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
本發(fā)明中所述的玉米內(nèi)參基因優(yōu)選是Maize actin I (MAcl) (Genbank登錄號No. J01238);所述植酸酶基因優(yōu)選是PhyAO基因(Genbank登錄號No. HQ233651)。
本發(fā)明中用于擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因的一對特異引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示；所述的擴(kuò)增植酸酶基因的一對特異引物選自由SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示核苷酸序列組成的引物對或由SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示核苷酸序列組成的引物對；所述擴(kuò)增植酸酶基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與植酸酶基因結(jié)合區(qū)域的一對特異引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示。
至于本發(fā)明中所述的實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系以及擴(kuò)增條件，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員根據(jù)擴(kuò)增時所用到的引物對的具體序列以及待擴(kuò)增的產(chǎn)物的長度等很容易確定得到PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系以及相應(yīng)的擴(kuò)增條件，這些技術(shù)手段為均本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟練掌握，作為參考，本發(fā)明中所述的實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系可參照以下體系建立
2 X SYBR Green Realtime PCR Mix 10 μ L，待測樣品 DNA 或者標(biāo)準(zhǔn)品 DNA I μ L,4μ mol/L的上游引物I μ L,4y mol/L的下游引物I μ L,加入雙蒸水至總體積為20 μ L ;
本發(fā)明中所述的實(shí)時熒光定量PCR的反應(yīng)條件優(yōu)選為95° C預(yù)變性3分鐘，然后反應(yīng)40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95° C 15秒，56° C 15秒，72° C 30秒。
本發(fā)明所提供的PCR檢測用特異引物序列包括轉(zhuǎn)入玉米中的植酸酶基因PhyAO特異序列以及植酸酶PhyAO基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與基因結(jié)合區(qū)域的特異序列，保證了定量檢測轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的特異性和有效性。本發(fā)明方法能夠快速、準(zhǔn)確、高通量的測定轉(zhuǎn)基因玉米以及添加了轉(zhuǎn)基因玉米飼料中的轉(zhuǎn)基因成分的含量，具有操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、避免交叉污染等優(yōu)點(diǎn)。
圖I引物對A/B檢測玉米種子的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
圖2引物對C/D檢測玉米種子的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
圖3引物對E/F檢測玉米種子的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
圖4引物對A/B檢測添加有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
圖5引物對C/D檢測添加有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
圖6引物對E/F檢測添加有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
一、試劑與溶液
I. SDS 溶液配制IOOmM EDTA (pH 8. O), 20mM Tris-HCl (pH8), 500mM NaCl, I. 5%SDS。
2. RNA 酶母液將 RNA 酶溶于 10mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 5)、15mmol/L NaCl 中，配成濃度為10mg/mL的溶液，100°C加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于_20°C。3.酚 / 氯仿 / 異戊醇(25 24 I)
4.氯仿/異戊醇(24 I)
5. TE 緩沖液:IOOmL 去離子水中加入 O. 010mol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0),0. 001mol/LEDTA (pH 8. 0)，定容至200mL，高壓滅菌，4°C保存。
6. SYBR Green Realtime PCR Mix (東洋紡(上海)生物科技有限公司)
二.檢測用特異引物的設(shè)計(jì)及序列
查找獲得玉米看家Maize actin I (MAcl)基因序列，設(shè)計(jì)特異引物對CKl (5，ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT3’ ) (SEQ ID No. I)和 CK2(5’ GCATCACAAGCCAGTTTAACC3’ )(SEQ ID No. 2)，作為內(nèi)參基因檢測樣品模板量。
依據(jù)轉(zhuǎn)入玉米中的植酸酶PhyAO基因序列設(shè)計(jì)特異引物對A (5，TTCGCATGATAACGGCATC3’ )(SEQ ID No. 3)和 B(5，CCAAAGCATCAACCGGACAG3’ ) (SEQID No. 4)，擴(kuò)增片段長度為 248bp。C (5，AACATTGTCCCGTTCATCCG3 ’ ) (SEQ ID No. 5)和 D (5，GTGAAATTGGCTTCGATGTC3’ ) (SEQ ID No. 6)，擴(kuò)增片段長度為 239bp。同時，依據(jù)轉(zhuǎn)化玉米時所用載體中表達(dá)框序列信息設(shè)計(jì)終止子與基因結(jié)合區(qū)域的特異引物對E(5’ATAGCTTCGTGAAGGGITTG3’)(SEQ ID No. 7)和 F(5’CACGCAGITTAACCATGAGC3’)(SEQ IDNo. 8)，擴(kuò)增片段長度為170bp。
實(shí)施例I轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子中植酸酶基因定量測定方法的建立
I、玉米種子基因組DNA提取
操作步驟
(I)將轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子或非轉(zhuǎn)基因玉米種子研磨成粉末
(2)研磨管中裝入玉米種子，加入鋼珠，放置在研磨儀中，速度定為HOOstrokes/min，每次30sec，每個樣品要至少進(jìn)行兩次研磨。兩次進(jìn)行完畢后，取出查看研磨程度，假如不能達(dá)到要求，繼續(xù)時每進(jìn)行一次就要查看研磨程度是否達(dá)到要求。繼續(xù)研磨時速度酌情增加至1500、1600、1700strokes/min,但最大不能超過1700strokes/min,研磨后的樣品通過0. 45mm的標(biāo)準(zhǔn)篩,充分混勻。
(3)取玉米粉末5g，加入預(yù)冷的研缽，加入液氮再次研磨。
(4)研磨后的粉末使用植物基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組DNA。
2、檢測轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米中植酸酶基因含量的標(biāo)準(zhǔn)品DNA的制備[0048]將提取的轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA和非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA各取I微升，用NanoDrop分光光光度計(jì)測定DNA濃度，然后用TE緩沖液調(diào)整這兩種DNA濃度到50ng/ μ 1，再將轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA與非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA按梯度比例混合，混合后控制轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA含量(按質(zhì)量百分比計(jì))分別為O. 5%，1%，2%，5%，10%。
3、實(shí)時熒光定量PCR檢測
PCR檢測的反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子的飼料中植酸酶基因的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (I)建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程；(2)以待檢測樣品的DNA為模板，分別以擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因的一對特異引物、擴(kuò)增植酸酶基因的一對特異引物或者是擴(kuò)增植酸酶基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與植酸酶基因結(jié)合區(qū)域的一對特異引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算出二次實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增的Ct值差值，將Ct值差值代入步驟(I)所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程，得到待檢測樣品中植酸酶基因的含量。
2.按照權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立 (I)制備轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的標(biāo)準(zhǔn)品DNA或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA ；(2)以所制備的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，以擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因的一對特異引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值；以所制備的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，以擴(kuò)增植酸酶基因的一對特異引物或者是擴(kuò)增植酸酶基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與植酸酶基因結(jié)合區(qū)域的一對特異引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)品DNA中植酸酶基因的Ct值；(3)建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
3.按照權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于步驟(3)所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR儀中的軟件記錄下檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品DNA中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA含量為橫坐標(biāo)，建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程； 步驟(3)所述的含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR儀中的軟件記錄下檢測得到的含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)DNA中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的基因組DNA含量為橫坐標(biāo)，建立定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
4.按照權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于步驟(3)所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR儀中的軟件記錄下檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值為縱坐標(biāo)，以轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品DNA中植酸酶基因組DNA含量的O. 5 %，I %，2 %，5 %，10 %為橫坐標(biāo)，建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程; 步驟(3)所述的含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR儀中的軟件記錄下檢測得到的含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)DNA中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的基因組DNA含量的2%，5%，10%,20%，50%為橫坐標(biāo)，建立定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。
5.按照權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按照以下方法制備得到將轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA與非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA按梯度比例混合，即得； 所述含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按照以下方法制備得到將添加有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料基因組DNA與未添加轉(zhuǎn)基因玉米的飼料基因組DNA按照梯度比例混合，即得。
6.按照權(quán)利要求
5所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按照以下方法制備得到將轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA與非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA按梯度比例混合，控制轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶基因DNA含量分別為O. 5%，1%，2%，5%，10% ; 所述含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按照以下方法制備得到將添加有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料基因組DNA與未添加轉(zhuǎn)基因玉米的飼料基因組DNA按照梯度比例混合，控制轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料基因組DNA含量分別為2%，5%，10%，20%，50 %。
7.按照權(quán)利要求
I或2所述的方法，其特征在于所述的玉米內(nèi)參基因是Maizeactin.1 ;所述植酸酶基因是PhyAO基因。
8.按照權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于用于擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因的一對特異引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示；所述的擴(kuò)增植酸酶基因的一對特異引物選自由SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示核苷酸序列組成的引物對或由SEQ IDNo. 5和SEQ ID No. 6所示核苷酸序列組成的引物對；所述擴(kuò)增植酸酶基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與植酸酶基因結(jié)合區(qū)域的一對特異引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. 7和SEQID No. 8 所示。
9.按照權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述的實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為2XSYBR Green Realtime PCR Mix 10 μ L，待測樣品DNA或者玉米標(biāo)準(zhǔn)品DNA I μ L, 4 μ mol/L的上游引物I μ L, 4 μ mol/L的下游引物I μ L,加入雙蒸水至總體積為.20 μ L0
10.按照權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述的實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95° C預(yù)變性3分鐘，然后反應(yīng)40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95° C 15秒，56° C.15 秒，72。C 30 秒。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子或含有該玉米種子的飼料中植酸酶基因的定量檢測方法，包括以下步驟(1)建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程；(2)以待檢測樣品的DNA為模板，分別以擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因的一對特異引物、擴(kuò)增植酸酶基因的一對特異引物或者擴(kuò)增植酸酶基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與基因結(jié)合區(qū)域的一對特異引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算出Ct值差值，將Ct值差值代入所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程，得到待檢測樣品中植酸酶基因的含量。本發(fā)明方法能夠快速、準(zhǔn)確、高通量的測定轉(zhuǎn)基因玉米或添加了轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料中的轉(zhuǎn)植酸酶基因的含量，具有操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、避免交叉污染等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GKCN102876800SQ201210400763
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月19日
發(fā)明者楊文竹, 初曉宇, 陳茹梅, 伍寧豐, 范云六, 姚斌 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan