專利名稱:一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法
技術領域：
本發明涉及一種以革蘭氏陰性菌外膜孔蛋白為靶點篩選藥物的方法，尤其是涉及一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法。
背景技術：
當前，人們對病原細菌的控制主要是通過幾種不同殺菌機制的抗生素藥物來進行的，目前常用抗生素的殺菌作用機制主要有以下4種(I)抑制細菌細胞壁的合成抑制細胞壁的合成會導致細菌細胞破裂死亡，以這種方式作用的抗菌藥物包括青霉素類和頭孢菌素類。(2)干擾蛋白質的合成干擾蛋白質的合成意味著細胞存活所必需的酶不能被合成。干擾蛋白質合成的抗生素包括福霉素類、氨基糖苷類、四環素類和氯霉素。(3)抑制核酸的轉錄和復制抑制核酸的功能阻止了細胞分裂和/或所需酶的合成。以這種方式作用的抗生素包括萘啶酸和二氯基吖啶。(4)與細胞膜相互作用一些抗菌素與細胞的細胞膜相互作用而影響膜的滲透性，這對細胞具有致命的作用。以這種方式作用的抗生素有多粘菌素和短桿菌素。
由于抗生素的大規模應用和不合理的臨床使用，而使得細菌產生耐藥性，不僅導致藥物失去抗菌作用，甚至致使“超級細菌”的出現，這使得感染性疾病治療及疫情控制面臨困境，已在全球范圍成為嚴重的公共衛生危機。但因具新型抗菌機制的藥物的研發日益困難，且針對已有抗菌機制開發的藥物的生命周期大大縮短等原因，近年來罕有新型抗菌藥物上市。因此，本領域非常有必要尋找與細菌介導的感染性疾病相關的新的藥物作用靶點和開發新的藥物或研制新型疫苗，為更有效地控制和治療感染性疾病提供新的途徑。
已知大多數感染性疾病及歷史上大規模爆發的傳染病都是由革蘭氏陰性菌引起，研究認為這主要與其復雜的外膜有關。革蘭氏陰性菌外膜主要由外膜孔蛋白、脂質及脂多糖等成分組成，其中外膜孔蛋白為主要成分，約占50%，主要由具β_桶狀結構的孔蛋白(porin)和脂蛋白兩類蛋白組成，外膜孔蛋白是革蘭氏陰性菌特有的成分，直接與外環境接觸，不僅在維持外膜結構、細胞表面識別、信號轉導和物質轉運(尤其是鐵的運輸)等生理功能方面起重要作用，而且更為重要的是，某些外膜孔蛋白還與病原菌的毒力有關，且研究認為病原菌的毒力與機體內鐵的調控有關。鐵是病原菌感染發病和機體的免疫防御這一相互作用過程中的關鍵調控因子，病原菌經長期進化已發展了多種機制從宿主體內奪取鐵來增強其毒力和致病性，同時損傷機體的免疫防御能力，是病原菌感染以及致病的關鍵因素之
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中國專利公開號CN1699573A，
公開日2005年11月23日，公開了一種溶藻酸弧菌外膜孔蛋白W基因與制備方法及其應用，提供一種新的溶藻酸弧菌ompW蛋白質活性的多肽的核苷酸序列和溶藻酸弧菌ompW蛋白的氨基酸序列及其利用重組技術制備溶藻酸弧菌ompW基因的方法，提供溶藻酸弧菌和副溶血弧菌ompW蛋白和編碼序列的應用，其步驟為將編碼具有溶藻酸弧菌ompW蛋白活性多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成溶藻酸ompW蛋白表達載體,將表達載體轉入宿主細胞,形成溶藻酸弧菌ompW蛋白的重組細胞，培養重組細胞，分離。不足之處是用于篩選藥物可靠性差、篩選藥物效率低，不適用于作為靶點篩選細菌介導的感染性疾病的新藥物。
發明內容
本發明的目的在于解決現有技術的藥物篩選方法可靠性差、效率低、不適用于作為靶點篩選細菌介導的感染性疾病的新藥物的不足，提供了一種操作簡單、篩選可靠性好、效率高的以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為新型靶點的篩選藥物的方法，用于篩選細菌介導的感染性疾病的新藥物。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案是
一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法，所述方法包括下列步驟
(1)基因的克隆及重組載體的構建；
(2)重組載體的轉化、篩選誘導表達得外膜孔蛋白OmpW高表達菌；
(3)以高表達菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點進行細胞水平的藥物篩選，用5(Γ80μg/ml的待篩選化合物作用于高表達菌，培養O. 5-lh，采用Western-blot分析檢測高表達菌外膜孔蛋白OmpW的表達量變化，Ompff的表達量降低，待篩選化合物具有藥物作用，Ompff的表達量不變或增加，待篩選化合物不具有藥物作用。
作為優選，步驟(I)中利用大腸桿菌K12的ompW基因序列設計合成引物，引物合成后，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板擴增基因0耶1經聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定并回收目的基因，利用T4-DNA連接酶將目的基因與載體連接得重組載體。從NCBI數據庫中查找大腸桿菌K12的ompW基因序列(序列號No. _415772),然后根據pLLP-OmPA載體和pET_28a載體分別設計引物對ompW-pL-F/ompW-pL-R和引物對ompW-pE-F/ompW-pE-R,見表I。
作為優選,所述載體為質粒或粘粒載體。
作為優選，步驟(2)中篩選是指采用氨芐青霉素抗性平板篩選外膜孔蛋白OmpW表達量高的菌株，誘導表達是指將外膜孔蛋白OmpW表達量高的菌株培養至對數生長期，加入IPTG誘導得到相應的外膜孔蛋白OmpW高表達菌。
作為優選，誘導劑IPTG的濃度為0. 3^0. 4mmol/l。
本發明的有益效果是(1)本發明確立了以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點的藥物篩選方法，通過高表達菌外膜孔蛋白OmpW的表達量變化來判斷待測化合物是否具有藥物特性，操作簡單，可靠性高；(2)本發明通過克隆基因和構件重組載體，然后經過轉化及誘導表達得到外膜孔蛋白OmpW高表達量高的高表達菌，待測化合物作用于高表達菌來進行細胞水平的藥物篩選，靈敏度高，效率高。
圖1是正常菌及經吞噬細胞處理后外膜孔蛋白樣品的SDS-PAGE (上部分)及以Ompff抗體為一抗的Western-blot分析圖譜(下部分)；
圖2是正常菌及經血漿處理后外膜孔蛋白樣品的SDS-PAGE (上部分)及以OmpW抗體為一抗的Western-blot分析圖譜(下部分)；
圖3是以OmpW抗血清為一抗對經血漿被補體消化的菌外膜孔蛋白樣品進行Western-blot 分析圖譜；圖4是正常菌與補體滅活的血漿孵育Ih后的菌的外膜孔蛋白以OmpW抗體為一抗的ffestern-blot 分析圖譜；
圖5是正常菌及OmpW基因敲除菌(Nompimi SDS-PAGE及Western-blot分析驗證圖
譜；
圖6是正常菌及OmpW基因敲除菌(komPW、的生長曲線圖；
圖7是THP-1細胞分別與FITC標記的野生型及OmpW基因敲除菌(Λο耶/f)孵育Ih后細胞觀察圖；
圖8是熒光亮點計數及統計分析圖；
圖9是小鼠巨噬細胞分別與FITC標記的野生型及OmpW基因敲除菌(&ompW、孵育Ih后細胞觀察圖；
圖10是熒光亮點計數及統計分析；
圖11是小鼠巨噬細胞與野生型及OmpW基因敲除菌(進行孵育Ih后裂解細胞的裂解液涂平板示意圖；
圖12是平板計數及統計分析圖。
具體實施方式
下面通過具體實施例，并結合附圖，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。
實施例1 :
以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法
(1)基因的克隆及重組載體的構建以質粒為載體，引物合成后，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板擴增基因omPW,經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定并回收目的基因，利用T4-DNA連接酶將目的基因與載體連接；
(2)重組載體的轉化及誘導表達得高表達菌采用氨芐青霉素抗性平板篩選外膜孔蛋白表達量高的菌株，然后培養至對數期，加入O. 3mmol/l的IPTG誘導得到相應的外膜孔蛋白OmpW聞表達囷；
(3)進行以高表達菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點的藥物的篩選，用50μ g/ml的待篩選化合物作用于高表達菌，培養O. 5h，采用Western-blot分析檢測高表達細胞OmpW的表達量變化，Ompff的表達量降低，待篩選化合物具有藥物作用，Ompff的表達量不變或增加，待篩選化合物不具有藥物作用。
實施例2:
以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法
(1)基因的克隆及重組載體的構建以粘粒為載體，引物合成后，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板擴增基因omPW,經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定并回收目的基因，利用T4-DNA連接酶將目的基因與載體連接；
(2)重組載體的轉化及誘導表達得高表達菌采用氨芐青霉素抗性平板篩選外膜孔蛋白表達量高的菌株，然后培養至對數期，加入O. 5mmol/l的IPTG誘導得到相應的外膜孔蛋白OmpW聞表達囷；
(3)進行以高表達菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點的藥物的篩選，用80μ g/ml的待篩選化合物作用于高表達菌，培養O. 5h，采用Western-blot分析檢測高表達細胞OmpW的表達量變化，Ompff的表達量降低，待篩選化合物具有藥物作用，Ompff的表達量不變或增加，待篩選化合物不具有藥物作用。
實施例3:
以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法
(1)基因的克隆及重組載體的構建以質粒為載體，引物合成后，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板擴增基因omPW,經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定并回收目的基因，利用T4-DNA連接酶將目的基因與載體連接；
(2)重組載體的轉化及誘導表達得高表達菌采用氨芐青霉素抗性平板篩選外膜孔蛋白表達量高的菌株，然后培養至對數期，加入O. 4mmol/l的IPTG誘導得到相應的外膜孔蛋白OmpW聞表達囷；
(3)進行以高表達菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點的藥物的篩選，用65μ g/ml的待篩選化合物作用于高表達菌，培養45分鐘，采用Western-blot分析檢測高表達細胞OmpW的表達量變化，Ompff的表達量降低，待篩選化合物具有藥物作用，Ompff的表達量不變或增加，待篩選化合物不具有藥物作用。
高表達菌經新鮮的人血漿處理后，部分高表達菌被補體系統裂解消化，存活高表達菌的OmpW表達量顯著增加(如圖2所示)，而被補體消化的高表達菌中檢測不到OmpW (如圖3所示);而當高表達菌與補體滅活的血漿處理后，OmpW的表達量未見明顯變化(如圖4所示)。此外，高表達菌被吞噬后仍存活的高表達菌的OmpW表達量也明顯增加(如圖1所示)，該結果表明OmpW在 抗先天免疫過程中具有重要作用，用于篩選治療細菌感染的藥物可靠性高。
為進一步證實OmpW抗免疫作用，構建了基因敲除菌(Λο耶F)。經提取膜蛋白樣品并進行SDS-PAGE和Western-blot分析表明ompW未見表達(如圖5所示)。另夕卜，比較分析菌和正常菌外膜孔蛋白，發現兩外膜孔蛋白Fiu和CirA的表達量明顯增加(如圖5所示),而二者均為TonB依賴的受體蛋白，可攝取各種含鐵化合物(如enterochelin、aerobactin等)。這表明細菌在缺失OmpW后,通過上調表達Fiu和CirA來維持對鐵攝取和需求的平衡。而這很可能也是的生長未受明顯影響的原因。的生長曲線表明敲除后生長未受明顯影響(如圖6所示)。
在構建了 Λο耶r之后，進一步分析了人單核巨噬細胞(THP-1細胞系，實驗時經PMA誘導為巨噬細胞)和取自小鼠的巨噬細胞對與正常菌的吞噬率差異。實驗從以下2各方面進行分析
I)將正常及菌利用熒光試劑進行標記，分別取相同數量的此二種細菌與等量的巨噬細胞在37°c下進行孵育。Ih后，充分洗滌細胞，并利用臺盼藍淬滅極少數仍粘附在細胞膜上的熒光。最后在熒光顯微鏡下觀察細胞內的細菌數量。結果顯示，菌的吞噬率顯著高于正常菌(如圖7、圖8、圖9和圖10所示)。
2)正常及菌與巨噬細胞孵育Ih后，充分洗滌細胞，利用純水裂解細胞，取適量裂解液涂平板，觀察并計數細菌的菌落數。結果證實巨噬細胞對菌的吞噬率高于正常菌(如圖11和圖12所示)，該結果表明，OmpW可促進細菌抗吞噬作用，用于篩選治療細菌感染藥物效率高。
權利要求
1.一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟(1)基因的克隆及重組載體的構建；(2)重組載體的轉化、篩選和誘導表達得外膜孔蛋白OmpW高表達菌；(3)以高表達菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點進行細胞水平的藥物篩選，用5(Γ80μg/ml的待篩選化合物作用于高表達菌，培養O. 5-lh，采用Western-blot分析檢測高表達菌的外膜孔蛋白OmpW的表達量變化，Ompff的表達量降低，待篩選化合物具有藥物作用，Ompff的表達量不變或增加，待篩選化合物不具有藥物作用。
2.根據權利要求
1所述的一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法，其特征在于步驟(I)中利用大腸桿菌K12的ompW基因序列設計合成引物，引物合成后，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板擴增基因ompW，經聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定并回收目的基因，利用T4-DNA連接酶將目的基因與載體連接得重組載體。
3.根據權利要求
2所述的一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法，其特征在于，所述載體為質粒或粘粒載體。
4.根據權利要求
1或2或3所述的一種以大腸桿菌外膜孔蛋白為靶點篩選藥物的方法，其特征在于步驟(2)中篩選是指采用氨芐青霉素抗性平板篩選外膜孔蛋白OmpW表達量高的菌株，誘導表達是指將外膜孔蛋白OmpW表達量高的菌株培養至對數生長期，加入IPTG誘導得到相應的外膜孔蛋白OmpW高表達菌。
5.根據權利要求
3所述的一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法，其特征在于誘導劑IPTG的濃度為O. 3^0. 4mmol/l。
專利摘要
本發明涉及一種以革蘭氏陰性菌外膜蛋白為靶點篩選藥物的方法，尤其是涉及一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點篩選藥物的方法，旨在為了解決現有技術的藥物篩選方法可靠性差、效率低的不足，所述方法包括下列步驟(1)基因的克隆及重組載體的構建；(2)重組載體的轉化、篩選及誘導表達得高表達菌；(3)以高表達菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點進行細胞水平的藥物篩選。該方法具有操作簡單、篩選可靠性好、效率高的優點。
文檔編號C12Q1/02GKCN103031358SQ201210275708
公開日2013年4月10日 申請日期2012年8月6日
發明者潘建義, 吳賢斌, 鄒海杰 申請人:浙江理工大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan