專利名稱：:一種流感病毒的培養方法一種流感病毒的培養方法發明領域本發明涉及一種流感病毒的培養方法，具體涉及一種用細胞培養技術培養流感病毒的方法，屬于流感病毒疫苗生產領域。
背景技術：
：目前，包括高致病性禽流感病毒在內，流感疫苗的生產還主要靠雞胚培養技術，學者們一直在探討用細胞培養技術生產流感疫苗，但一直沒有找到合適的細胞。某些細胞能夠用于疫苗生產，如中國專利公開號C歸53172，公開日2005.08.10，名稱為"用于病毒培養的棉鼠肺細胞"的發明專利公開了棉鼠細胞系，棉鼠細胞用于生長、繁殖、或培養生物體、病原體或病毒諸如PRRSV以及由此產生的生物體、病原體或病毒的用途。但是其卻不能用于流感病毒的培養。到目前為止，人們僅發現了原代猴腎細胞(PMK)和細胞系MDCK、Vero、A549、HEK等少數幾種細胞能夠用于培養流感病毒。H1N1型等低致病性流感病毒更是只能首選在MDCK細胞系上培養。但是，這些細胞或細胞系，有的如猴腎原代細胞獲取代價太高，有的如細胞系可能有癌變性質，不適合用于疫苗尤其是人用疫苗的生產。即便這些細胞或細胞系能夠用于疫苗生產，其培養所得的流感病毒毒價往往較低，通過直接血凝法測定，一般只能達到25左右，尚不足以達到生產優質疫苗的毒價水平。另外，流感病毒尤其是H1N1等型流感病毒，在進行培養前必須進行預處理，目前預處理的方法主要是將病毒溶解于含有胰蛋白酶的溶液中再接種。添加胰蛋白酶等酶類制劑對雞胚培養流感病毒的繼續生長可能沒有影響，但在用細胞培養流感病毒，尤其是用貼壁生長的細胞培養流感病毒時，其流感病毒的凝血效價始終不高。因此尋找高效、低成本、安全的培養流感病毒用細胞源以及與其配套的培養技術成為目前流感疫苗生產領域中主攻方向之一。
發明內容本發明的目的是尋找更高效、更適用于流感疫苗生產的，流感病毒培養用新細胞源及其培養技術，提出了一種更高效價，無癌變危險的流感病毒培養方法。本發明的目的是通過以下方式實現的一種流感病毒的培養方法，即用山羊胎兒腎細胞培養作為流感病毒培養的細胞源，具體操作步驟如下-A、選取懷孕2月齡以上的母山羊，在無菌條件下采用剖腹手術將羊胎兒連同胎膜一起取出，剝離胎膜，取出羊胎兒放入盛有無菌PBS溶液的培養皿中，洗滌2—3次，用手術器械剖開羊胎兒腹腔，取出腎臟，按照組織細胞原代培養方法，將羊胎兒腎組織制備培養成原代細胞；B、對采用雞胚培養的流感病毒進行預處理；C、將預處理后的流感病毒接種于由羊胎兒腎組織培養成的原代細胞中，先按每個細胞瓶培養流感病毒所需培養基總量的1/4加入經預處理后的病毒液，37'C下，培養2-3小時后補足培養基，繼續培養48-72小時，收集細胞培養液并在1500-2000轉/分下離心10-20分鐘取上清，得到含流感病毒的上清液。本發明所述步驟B中采用細胞凍融提取物對雞胚培養的流感病毒進行預處理，所述細胞凍融提取物是動物成纖維細胞、小鼠胚胎干細胞的上皮樣分化細胞的凍融提取物，其制備和預處理方法如下A.細胞凍融物的制備無菌環境下，將培養好的動物成纖維細胞或小鼠胚胎干細胞的上皮樣分化細胞除去培養液，經兩次凍融，讓細胞充分破裂，成為細胞凍融碎片，培養瓶中按照每個100毫升瓶中加入3-5毫升的比例加入PBS溶液，吹打細胞培養面，將細胞凍融碎片吹入溶液中，將溶液吸入離心管內，經2500-3000轉/分離心，取上清，經0.22微米過濾膜過濾除菌，即成細胞凍融提取物；B.流感病毒的預處理先將準備接種的雞胚培養的流感病毒，用PBS溶液配成10倍于接種細胞所需濃度的病毒液，然后將該病毒液與上述凍融提取物按l:l比例混合，靜置5-IO分鐘，再進行接種。與現有技術相比本發明具有以下明顯的優點1、用直接血凝法測定本發明技術所培養的H1N1型流感病毒，其毒價可達到28以上，山羊胎兒腎原代細胞傳代到第七代后依然可以用于流感病毒培養，此時培養的H1N1型流感病毒的毒價也可以達到26以上。用原代細胞培養的流感病毒，其毒價顯著高于用現行技術培養的流感病毒。2、所用細胞為原代細胞，用于疫苗生產不存在癌變物質危險性。43、所用細胞來源較廣，獲取成本較低，與一般的山羊屠宰加工企業聯系即可。4、流感病毒的預處理不用胰蛋白酶，避免了胰蛋白酶對產毒細胞的影響。圖1是本發明中未接種H1N1型流感病毒時山羊胎兒腎細胞的顯微圖片；圖2是本發明接種H1N1型流感病毒24小時后山羊胎兒腎細胞的顯微圖片；圖3是本發明接種H1N1型流感病毒病變后山羊胎兒腎細胞的顯微圖片；具體實施方式以下結合具體實施例對本發明作進一步的詳細描述一種流感病毒的培養方法，即用山羊胎兒腎細胞培養作為流感病毒培養的細胞源，具體操作步驟如下A、選取懷孕2月齡以上的母山羊，在無菌條件下采用剖腹手術將羊胎兒連同胎膜一起取出，剝離胎膜，取出羊胎兒放入盛有無菌PBS溶液的培養皿中，洗滌2—3次，用手術器械剖開羊胎兒腹腔，取出腎臟，按照組織細胞原代培養方法，將羊胎兒腎組織制備培養成原代細胞；B、對采用雞胚培養的流感病毒進行預處理；C、將預處理后的流感病毒接種于由羊胎兒腎組織培養成的原代細胞中，先按每個細胞瓶培養流感病毒所需培養基總量的1/4加入經預處理后的病毒液，37'C下，培養2-3小時后補足培養基，繼續培養48-72小時，收集細胞培養液并在1500-2000轉/分下離心10-20分鐘取上清，得到含流感病毒的上清液。本發明所述步驟B中采用細胞凍融提取物對雞胚培養的流感病毒進行預處理，所述細胞凍融提取物是動物成纖維細胞、小鼠胚胎干細胞的上皮樣分化細胞的凍融提取物，其制備和預處理方法如下A.細胞凍融物的制備無菌環境下，將培養好的動物成纖維細胞或小鼠胚胎干細胞的上皮樣分化細胞除去培養液，經兩次凍融，讓細胞充分破裂，成為細胞凍融碎片，培養瓶中按照每個100毫升瓶中加入3-5毫升的比例加入PBS溶液，吹打細胞培養面，將細胞凍融碎片吹入溶液中，將溶液吸入離心管內，經2500-3000轉/分離心，取上清，經0.22微米過濾膜過濾除菌，即成細胞凍融提取物B.流感病毒的預處理先將準備接種的雞胚培養的流感病毒，用PBS溶液配成10倍于接種細胞所需濃度的病毒液，然后將該病毒液與上述凍融提取物按l:l比例混合，靜置5-10分鐘，再進行接種。按本發明方法培養H1N1型流感病毒并與MDCK細胞作對比試驗，其結果如下1.MDCK和山羊胎兒腎細胞培養H1N1型流感病毒后其培養液的血凝效價檢測結果見表一<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.參見圖1、圖2、圖3，山羊胎兒腎細胞培養H1N1型流感病毒的病變過程，從上述照片中看出當H1N1型流感病毒接種于山羊胎兒腎細胞(GH)細胞上。24小時后幾乎全部的易感細胞都出現病變，即腫脹變大、空泡樣變化，并大量崩解成碎片脫落，脫落部分無細胞形態。其中的非易感細胞則繼續生長并且可以繼續傳代。這與MDCK細胞的網絡樣病變差別明顯。3.將在100ml細胞培養瓶中培養48小時、且已長滿瓶的上皮養分化細胞，棄去上清，-30'C下凍融2次，每瓶加2mlPBS反復吹打，離心取上清，0.22um過濾，凍存備用。進行細胞凍融物及胰蛋白酶對流感病毒培養的對比試驗，其檢測結果見表二表二、預處理物對流感病毒培養的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1、一種流感病毒的培養方法，其特征是用山羊胎兒腎細胞培養作為流感病毒培養的細胞源，具體操作步驟如下A、選取懷孕2月齡以上的母山羊，在無菌條件下采用剖腹手術將羊胎兒連同胎膜一起取出，剝離胎膜，取出羊胎兒放入盛有無菌PBS溶液的培養皿中，洗滌2-3次，用手術器械剖開羊胎兒腹腔，取出腎臟，按照組織細胞原代培養方法，將羊胎兒腎組織制備培養成原代細胞；B、對采用雞胚培養的流感病毒進行預處理；C、將預處理后的流感病毒接種于由羊胎兒腎組織培養成的原代細胞中，先按每個細胞瓶培養流感病毒所需培養基總量的1/4加入經預處理后的病毒液，37℃下，培養2-3小時后補足培養基，繼續培養48-72小時，收集細胞培養液并在1500-2000轉/分下離心10-20分鐘取上清，得到含流感病毒的上清液。2、根據權利要求1所述的一種培養流感病毒的新方法，其特征在于所述步驟B中采用細胞凍融提取物對雞胚培養的流感病毒進行預處理，所述細胞凍融提取物是動物成纖維細胞、小鼠胚胎干細胞的上皮樣分化細胞的凍融提取物，其制備和預處理方法如下A.細胞凍融物的制備無菌環境下，將培養好的動物成纖維細胞或小鼠胚胎干細胞的上皮樣分化細胞除去培養液，經兩次凍融，讓細胞充分破裂，成為細胞凍融碎片，培養瓶中按照每個100毫升瓶中加入3-5毫升的比例加入PBS溶液，吹打細胞培養面，將細胞凍融碎片吹入溶液中，將溶液吸入離心管內，經2500-3000轉/分離心，取上清，經0.22微米過濾膜過濾除菌，即成細胞凍融提取物；B.流感病毒的預處理先將準備接種的雞胚培養的流感病毒，用PBS溶液配成10倍于接種細胞所需濃度的病毒液，然后將該病毒液與上述凍融提取物按l:l比例混合，靜置5-10分鐘，再進行接種。專利摘要一種流感病毒的培養方法，用山羊胎兒腎細胞培養作為流感病毒培養的細胞源。采用細胞凍融提取物對雞胚培養的流感病毒進行預處理，所述細胞凍融提取物是動物成纖維細胞、小鼠胚胎干細胞的上皮樣分化細胞的凍融提取物。本發明培養的流感病毒其毒價顯著高于用現行技術培養的流感病毒。所用細胞為原代細胞，用于疫苗生產不存在癌變物質危險性；所用細胞來源較廣，獲取成本較低；流感病毒的預處理不用胰蛋白酶，避免了胰蛋白酶對產毒細胞的影響。文檔編號C12N7/00GKCN101260385SQ200810047297公開日2008年9月10日申請日期2008年4月11日發明者高其雙,黃海軍申請人:武漢市畜牧獸醫科學研究所導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan