抗人巨細(xì)胞病毒(hcmv)的抗體的制作方法

專利名稱:抗人巨細(xì)胞病毒(hcmv)的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從對感染人細(xì)胞的病毒具有特異性生物活性的人B細(xì)胞分離的新型抗體序列。
背景技術(shù)：
人巨細(xì)胞病毒(hCMV)是ー種分布廣泛、高度種類特異性的皰疹病毒，在免疫抑制或免疫不成熟的個體中造成很高的發(fā)病率和死亡率。
最近的幾篇文獻(xiàn)綜述分析了 hCMV的生物和臨床表現(xiàn)(Landolfo S et al,2003 ；Gandhi M and Khanna R, 2004 ；Soderberg-NaucIer C, 2006a)。這種病韋病原體感染世界上大多數(shù)人口，兒童期時在接觸了體液后獲得，因為該病毒通過上消化道或呼吸系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞進(jìn)入，或通過生殖泌尿系統(tǒng)進(jìn)入。hCMV的血清陽性在發(fā)展中國家或低收入?yún)^(qū)域中中更加普遍。
在原發(fā)感染之后，hCMV可以以潛伏的狀態(tài)在骨髓細(xì)胞系統(tǒng)的特異性宿主細(xì)胞中存在，在許多不同類型的細(xì)胞(造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)中復(fù)制和傳播，并且避開宿主的免疫系統(tǒng)。hCMV在健康人中通常是無癥狀的，因為hCMV感染和傳播是被保持在免疫系統(tǒng)的控制之下的，但是很少達(dá)到全部hCMV的清除。實際上，hCMV病毒已經(jīng)發(fā)展了使病毒的基因組以潛伏的狀態(tài)保留在選擇的位點的有效機制。
任何削弱免疫功能的情況，如壓カ狀態(tài)或特殊的治療，可以導(dǎo)致hCMV激活。hCMV臨床表現(xiàn)(如視網(wǎng)膜炎、小腸結(jié)腸炎、肺炎、胃炎或肝炎)會在病毒的原發(fā)感染、再感染或激活之后發(fā)生。大約1 0%的嬰兒在從其母親經(jīng)由胎盤、在分娩中或通過哺乳傳播之后的6個月被感染。
hCMV病毒由二十面的核殼體構(gòu)成，其含有線形、230kb長的雙鏈DNA基因組。hCMV基因組的表達(dá)是由復(fù)雜的級聯(lián)轉(zhuǎn)錄事件控制，其引起超過200種與多種涉及病毒感染、潛伏和復(fù)制的生物活性相關(guān)的蛋白質(zhì)的合成(Britt W and Mach M，1996)。
結(jié)構(gòu)蛋白形成非常復(fù)雜并且仍未完全確定的病毒體包膜。它包括與在其它皰疹中確定的結(jié)構(gòu)蛋白同族的糖蛋白，其可以在病毒體中形成ニ硫鍵連接的蛋白質(zhì)復(fù)合物:gCI (只包括gB)、gCII (包括gM和gN)和gCIII (包括gH、gL和g 9 )。gB, gH和gN還已被用于基因分型 hCMV 菌株(Coaquette A et al.，2004 ；Dar L，2007)。
糖蛋白gN和gM是最豐富的，并且與gH和gB —起顯示出是hCMV包膜和宿主細(xì)胞表面之間的最初的相互作用所必需的，因此對于產(chǎn)生感染性的hCMV是必需的。基于這個原因，以gB、gH、gN和/或gM為靶標(biāo)的化合物可以通過在hCMV感染、再感染或激活之后阻止循環(huán)的hCMV進(jìn)入細(xì)胞來有效地抑制hCMV的感染。
因為可用的治療選擇很少，因此hCMV感染的治療是比較困難的。目前可用的抑制病毒復(fù)制(Ganciclovir、Cidofivir、Foscarnet、Maribavir和其它的還在開發(fā)中的藥物)的藥物化合物產(chǎn)生了顯著的臨床進(jìn)展，但是可能會出現(xiàn)到了口腔生物活性低、效カ低、出現(xiàn)hCMV抗性(由于病毒目標(biāo)中的突變)和劑量限制性毒性的問題(DeClercq E，2003 ；Baldanti F and Gerna G,2003 ；Gilbert C and Boivin G,2005)。
在移植安置(transplantation setting)和產(chǎn)前預(yù)防中需要預(yù)防和治療hCMV感染的新方法，特別是對于免疫功能低下的個體。事實上，在HIV患者和器官移植接受者體內(nèi)，hCMV是臨床上重要的機會致病菌，其會造成不同于移植排斥的移植失敗，導(dǎo)致發(fā)病和死亡(Puius Y and Snydman D，2007)。骨髓和實體器官移植接受者數(shù)量量的增加使hCMV臨床表現(xiàn)的可能性提高，如hCMV視網(wǎng)膜炎(ffiegand T and Young L，2006)。此外，hCMV是出生缺陷(如聽覺喪失 、發(fā)育延緩或智力遲鈍)的主要感染原因，這些出生缺陷是由于通過hCMV感染的母親傳播的先天的或圍產(chǎn)期的hCMV感染(Griffiths P and Walter S，2005)。
因此，提供用于普遍的事先性、預(yù)防性的hCMV特異性治療的藥物是重要的，例如用于預(yù)防移植接受者中(Hebart H and Einsele H, 2004 ；KaKl A et al., 2005 ；Snydman D,2006)、患有hCMV相關(guān)的神經(jīng)病的患者(Griffiths P，2004)中或高危妊娠(Schleiss M，2003)中的hCMV疾病從而預(yù)防垂直傳播并危及胎兒和新生兒生命的hCMV感染。
此外，抗hCMV的藥物組合物可以用于治療其它的傳播更廣泛的疾病(如心血管疾病和自身免疫疾病，或某些類型的癌癥)，其中hCMV是潛在的輔助因子并且/或在免疫抑制治療中可被激活。例如，目前hCMV是如腫瘤入侵和免疫逃避中的長期并發(fā)癥的疾病的越來越重要的人類病原，因為hCMV感染對于細(xì)胞凋亡、分化和遷移具有腫瘤調(diào)節(jié)作用。在自體免疫或血管疾病中，hCMV感染可以改變免疫和炎癥反應(yīng)(Cinatl J et al.,2004 ；Soderberg-Naucler C,2006b)。
一種預(yù)防hCMV感染的可替代的方法是在高?；颊呷巳褐刑峁┍Ｗo(hù)的范圍內(nèi)接種疫苗。但是，還未完全了解接種疫苗和產(chǎn)生的免疫反應(yīng)之間的關(guān)系，并且最佳的hCMV疫苗法(使用特異性的候選抗原或活的減毒疫苗)看起來取決于要被保護(hù)的患者人群。因此，預(yù)防接種法仍然在評價之中(McLean G et al.,2006 ；Schleiss M，2005)。
由于目前hCMV感染的藥理學(xué)策略的局限，對于宿主與hCMV的關(guān)系，尤其是hCMV特異性免疫反應(yīng)的認(rèn)識越來越多，使得基于免疫的療法成為取代或補充現(xiàn)有的用于成功治療hCMV相關(guān)并發(fā)癥的療法的良好選擇(Gandhi M and Khanna R，2004)。最近，通過輸入(transfer,移植)病毒特異性記憶B細(xì)胞，在免疫缺陷小鼠中獲得了對于CMBV感染的致死過程的長期保護(hù)，這表示這樣的細(xì)胞具有治療效用(Klenovsek K et al.，2007)。
對于基于細(xì)胞的療法的一種更簡單備選方法是被動免疫療法，該療法是將包含具有確定的抗人或病毒抗原(例如hCMV)的中和活性的治療抗體的藥物組合物給予個體。
已經(jīng)根據(jù)針對人類或病毒治療目標(biāo)的抗體和抗體片段的抗原結(jié)合和生物特性來設(shè)計該療法(Dunman P and Nesin M, 2003 ；KellerM and Stiehm E,2000)。被動免疫療法已經(jīng)被引入到臨床實踐中，迅速増加了治療各種疾病(包括感染性疾病、免疫調(diào)節(jié)疾病和癌癥)的機率。在其免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生阻止和/或消滅目標(biāo)分子所需的量和/或特異性抗體的患者中，該方法是尤其有效的(Chatenoud L, 2005 ；Laffly E and Sodoyer R, 2005)。
在hCMV治療的領(lǐng)域中，該方法是通過靜脈給藥人免疫球蛋白制劑來實施的，人免疫球蛋白制劑是通過收集具有高滴定量的抗hCMV抗體的人血清而獲得的，并且被商業(yè)化以用于臨床應(yīng)用(名稱為Cytotect或CytoGam)。但是對于抑制hCMV感染，這些產(chǎn)品只是部分滿足要求的解決方案。事實上，在免疫功能低下的患者中使用這種療法，主要是為了事先性治療和預(yù)防，其中通常同時給予抗病毒劑(Marasco W and Sui J,2007 ；Nigro G etal.,2005 ；Bonaros Net al.,2004 ；Kocher A et al.,2003 ；Kruger R et al.,2003)。此夕卜，如文獻(xiàn)(Bayry J et al, 2007 ；Hamrock D, 2006)中所報道的,這樣的制劑的安全問題和短缺越來越弓I起人們的關(guān)注。
具有對hCMV包膜上表達(dá)的抗原具有高親和性并且能夠中和感染的人類重組抗體可能會成為被動免疫的更適合的藥物。事實上，盡管包膜蛋白的化學(xué)計量是可變的，并且會發(fā)生改變從而逃避宿主免疫反應(yīng)，但幾種hCMV糖蛋白仍會引起包括產(chǎn)生病毒中和抗體的強烈宿主免疫反應(yīng)。該反應(yīng)被認(rèn)為是宿主免疫力的關(guān)鍵組成，并且代表了抗體和疫苗開發(fā)的目標(biāo)。
由于鼠單克隆抗體的固有局限，人單克隆抗體是用于臨床應(yīng)用的最優(yōu)選的抗體。但是由于在評價這樣的抗體的效カ的研究中，例如在造血干細(xì)胞移植(Boeckh M et al.，2001)，或視網(wǎng)膜炎(GilpinA et al.，2003)，并沒有發(fā)現(xiàn)臨床有效性，因此用于hCMV治療的先前確定的人類抗體的發(fā)展(Matsumoto Y et al., 1986)已經(jīng)中斷。這些失敗的試驗使得人們有理由進(jìn)行g(shù)在選擇更有效中和最廣泛的hCMV病毒株的人類單克隆抗體的進(jìn)ー步研究。CMV感染的治療可能受益于具有更有效的包含從培養(yǎng)的人類B細(xì)胞純化的單克隆抗體或作為通過引入到哺乳動物細(xì)胞系中的人類序列表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)生的單克隆抗體的藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了新型的抗體序列， 其結(jié)合并且中和hCMV，并且可以被用于檢測、治療、抑制、預(yù)防和/或改善hCMV感染或hCMV相關(guān)疾病。
從hCMV血清反應(yīng)陽性的個體獲得人B細(xì)胞，并且使其永生化。分離該永生化人B細(xì)胞的多克隆群體從而產(chǎn)生次培養(yǎng)物(繼代培養(yǎng)物，subculture)，檢測該次培養(yǎng)物以確定在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中是否存在體外中和hCMV感染性的抗體(免疫球蛋白G，IgG)。尤其是，確定命名為26A1的次培養(yǎng)物分泌的抗體的中和活性類型、同種型和無性繁殖能力?？贵w被從兩種原始細(xì)胞培養(yǎng)物上清液親和純化并作為重組人單克隆抗體，使用體外模型來確定對于hCMV感染的hCMV特異性中和活性。該抗體可以被用于鑒定hCMV包膜上的中和抗原。
擴增、克隆并編碼26A1次培養(yǎng)物分泌的抗體可變區(qū)的DNA序列，并且進(jìn)行測序。分析對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列從而確定負(fù)責(zé)hCMV特異性生物活性的互補決定區(qū)(CDR)。使用產(chǎn)生重組蛋白的合適技術(shù)，這些序列可以被用于產(chǎn)生完整抗體、抗體片段或任何其它的功能蛋白形式(例如生物活性肽、融合蛋白)的具有hCMV特異性結(jié)合和中和特性的蛋白質(zhì)。
可以使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)來制備在治療hCMV感染和hCMV相關(guān)素亂中具有治療、預(yù)防和/或診斷功效的組合物，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者是重組蛋白，或者是從26A1次培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物純化的天然抗體。這樣的組合物可以被用于補充或替代現(xiàn)有的基于抗病毒化合物和/或靜脈免疫球蛋白(IVIg)制劑的hCMV療法。
在以下的詳細(xì)介紹中提供了本發(fā)明的其他實施方式。


圖1 JA)如文獻(xiàn)(Rothe M et al，2001)中所描述的被組裝并且用于gB_特異性ELISA中的CG3抗原的圖示。重組雜交融合CG3抗原對應(yīng)于來自hCMV病毒株AD169 (SwissProt Ace.N0.P06473 ;氨基酸 27-84)和 Towne (SwissProt Ace.N0.P 13201 ；氨基酸27-84)的gB抗原區(qū)2(AD2 ；SEQ ID NO:1和2)的組合。AD2區(qū)包含在不同的病毒株中都是保守的并且顯示被中和抗體識別的位點(具有下劃線的氨基酸70-81) (Qadri Iet al., 1992 ；KropffB et al.，1993)。(B)用于 gH 特異性 ELISA 檢測的 gH (Ag)-GST 融合蛋白中包括的gH抗原的圖示。重組抗原gH(Ag)-GST相當(dāng)于hCMV病毒株VR1814(ReVelloM et al.,2001)的gH氨基末端區(qū)(氨基酸16-144 ;SEQID NO:3)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)之間的符合讀框的融合。gH氨基末端包含被中和抗體識別的線性抗體結(jié)合位點(具有下劃線的氨基酸 34-43) (Urban M et al.，1992)。
圖2:識別并且表征含有結(jié)合并且中和hCMV的IgG抗體的次培養(yǎng)物(孔)的選擇過程總覽。通過使用PCT/EP2005/056871公開的基于EBV的永生化方法來將hCMV患者的B細(xì)胞永生化獲得次培養(yǎng)物。在hCMV微量中和試驗中直接篩選顯示出顯著細(xì)胞生長的次培養(yǎng)物(孔)的上清液。然后使用gB-和gH-特異性ELISA來篩選顯示出中和活性的上清液。在灰色橢圓形中指出了每次篩選試驗的陽性孔的數(shù)量。
圖3:天然26A1抗體的hCMV中和活性，使用蛋白A通過親和層析從生長在無血清培養(yǎng)基中的源于26A1次培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物來純化該天然26A1抗體。在hCMV中和試驗(包括人胚胎成纖維細(xì)胞(HELF)與hCMV病毒株AD169(1，000PFU/反應(yīng)；IC50 0.82 u g/ml)，或包括人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)與hCMV病毒株VR1814(1，000PFU/反應(yīng)；IC50
0.67 u g/ml)中進(jìn)行計量響應(yīng)曲線。
圖4:永生化人B細(xì)胞的含IgG上清液的gH(Ag)-特異性(A)和CG3抗原-特異性(B)結(jié)合活性。只使用細(xì)胞培養(yǎng)基(培養(yǎng)基，陰性對照)或使用次培養(yǎng)物26A1、1F7(如專利申請EP07111741介紹的，從CMV5供體獲得的永生細(xì)胞中鑒別的)和8C10 (如本專利申請和專利申請EP07115410中介紹的，從CMV7供體獲得的永生細(xì)胞中鑒別的)的上清液來進(jìn)行ELISA。點線代表了認(rèn)為次培養(yǎng)物為陽性的閾值(0.D.=0.1)。
圖5: (A) 26A1 IgG(VH 26A1 ；SEQ ID N0.:4和 5)的重鏈可變區(qū)的DNA(小寫字母，393個堿基對)和蛋白質(zhì)(大寫字母，131個氨基酸)共有序列的比對。(B)顯示了預(yù)測的CDR(HCDR1、HCDR2 和 HCDR3 ;下劃線；SEQ ID N0.:6、7 和 8)的 VH26A1 的蛋白質(zhì)共有序列。在共有蛋白質(zhì)序列之下顯示了由分離的大腸桿菌(E.coli)轉(zhuǎn)化株的質(zhì)粒中克隆的DNA序列編碼的可選氨基酸。
圖6:26A1 IgG (VL 26A1 ；SEQ ID N0.:9 和 10)的輕鏈可變區(qū)的 DNA (小寫字母，330個堿基對)和蛋白質(zhì)(大寫字母，110個氨基酸)共有序列的比對。(B)顯示了預(yù)測的VL 26A1 的 CDR(LCDR1、LCDR2 和 LCDR3 ;下劃線；SEQ ID N0.:11、12 和 13)的 VL26A1 的蛋
白質(zhì)共有序列。
圖7:重組人2 6A1單克隆抗體(SEQ ID N0.:15)的重鏈的DNA (小寫字母，1449個堿基對；SEQ ID N0.:14)和蛋白質(zhì)(大寫字母，482個氨基酸)共有序列的比對。如使用SignalP 3.0在線預(yù)測程序確定的，信號肽最可能的切割位點是在位置19和20 (VLS-QV)之間(Bendtsen J et al，2004)。在26A1次培養(yǎng)物中的細(xì)胞產(chǎn)生的cDNA中最初識別的序列具有下劃線(見圖5)。氨基酸153-482相當(dāng)于人IgGl的重鏈恒定區(qū)(SwissProtAce.N0.P01857)。[0032]圖8:重組人26A1 IgG (SEQ ID N0.:17)的重鏈的DNA (小寫字母，705個堿基對；SEQ ID N0.:16)和蛋白質(zhì)(大寫字母，234個氨基酸)共有序列的比對。使用SignalP 3.0在線預(yù)測程序確定了信號肽最可能的切割位點是在位置16和17 (CTG-SV)之間(BendtsenJ et al，2004)。在26A1次培養(yǎng)物中的細(xì)胞中最初識別的序列具有下劃線(見圖5)。氨基酸 1-19 和 131-234 對應(yīng)于人 Ig 入鏈的 1-19 和 131-234 (SwissProt Ace.N0.Q8N355)。
圖9:與蛋白A純化的天然26A1抗體相比較的重組人26A1抗體的hCMV中和活性。在微量中和試驗(A ；1000PFU/反應(yīng)，感染后72小時)或在空斑減數(shù)實驗(B)中使用HELF細(xì)胞和AD169hCMV病毒株來測試活性。
圖10:與蛋白A純化的天然26A1抗體相比較的重組人26A1單克隆抗體的hCMV中和活性。在微量中和試驗(A;1000PFU/反應(yīng))中使用HUVEC人細(xì)胞和VRI814hCMV病毒株，或在空斑減數(shù)試驗(B ；1000PFU/反應(yīng))中使用LELF人細(xì)胞和AL-1hCMV病毒株來檢測活性。
具體實施方式
PCT/EP2005/056871中描述的方法可以使從血液中含有具有生物活性的抗體(例如結(jié)合和/或中和人或病毒靶標(biāo)的抗體)的個體獲得的同種型特異性人B細(xì)胞，在獲得分泌表現(xiàn)上述生物活性的抗體的細(xì)胞的多克隆群體的范圍內(nèi)有效地永生化。然后，在低細(xì)胞密度(例如，每孔50、20細(xì)胞或者更少)克隆的単一步驟之后，可以使用通過這些方法獲得的次培養(yǎng)物的上清液來進(jìn)行廣泛的篩選試驗。以這種方式可以獲得永生化B細(xì)胞的多克隆群體，其中可以表征分泌IgG的次培養(yǎng)物的所有組成成分，并且由此可以識別大量具有理想的抗原結(jié)合特異性和/或生物活性的人單克隆IgG。
在這種情況下，從 其血清表現(xiàn)出作為生物活性的很強的hCMV中和活性的hCMV患者的血液獲得了分泌IgG 的永生化B細(xì)胞的多克隆群體。在20個細(xì)胞每孔的単一亞克隆步驟和合適的培養(yǎng)條件下，該多克隆群體被用于產(chǎn)生數(shù)千的含有永生化人B細(xì)胞的次培養(yǎng)物。然后，在選擇那些表現(xiàn)更強活性的范圍內(nèi)，在其中有數(shù)百個有效生長的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中檢測特異性生物活性，隨后確定同種型和(如果可能的話)分泌抗體的抗原表位。
最有前景的次培養(yǎng)物之一被命名為26A1，其被用于從大規(guī)模培養(yǎng)物純化天然的人抗體和從永生化B細(xì)胞分離編碼這樣的抗體的DNA。該DNA序列被用于產(chǎn)生作為重組人抗體的天然人抗體。天然和重組人26A1單克隆抗體被用于進(jìn)行更廣泛的生物試驗并評價它們在hCMV相關(guān)臨床應(yīng)用中的可能功效。
實施例顯示出細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、天然人抗體和重組人抗體怎樣表現(xiàn)出相同的生物活性，該生物活性是在原始血清和人EBV永生細(xì)胞的多克隆群體中確定的。這些證據(jù)證實了 PCT/EP2005/056871中描述的方法可以能夠識別、鑒定和產(chǎn)生生物活性的、同種型-持異性的、天然和重組的人單克隆抗體。事實上，細(xì)胞永生和在細(xì)胞培養(yǎng)條件下生長的完整方法可以以快速有效和直接的方式獲得人抗體的全部組成(repertoire)。此外,可以將由此方法產(chǎn)生的細(xì)胞冷凍并其它時間或平行地進(jìn)行不同的生物活性和/或抗原的篩選。
在一種實施方式中，本發(fā)明提供了包含與26A1抗體(SEQ IDN0.:8)HCDR3(重鏈可變區(qū)的⑶R3)序列具有至少90%的同一性的序列的蛋白質(zhì)。連同HCDRl和HCDR2(SEQ IDN0.:6 和 SEQ ID N0.:7)，該 HCDR3 包括在 26A1 抗體(VH 26A1 ;圖 5 ；SEQID N0.:5)的重鏈的可變區(qū)內(nèi)。該序列由DNA序列(圖5A ; SEQ IDN0.:4)編碼，使用從分泌26A1抗體的原始次培養(yǎng)物獲得的細(xì)胞來擴增和克隆該DNA序列。因此本發(fā)明的蛋白質(zhì)含有26A1抗體(圖 5B)的 HCDRl 的序列(SEQ ID N0.:6)和/或 HCDR2 (SEQ ID N0.:7)，以及 26A1 抗體的H⑶R3(SEQ ID N0.:8)。這樣的蛋白質(zhì)可包含與26A1抗體的重鏈可變區(qū)的完整序列至少90%的同一性的序列。
26A1抗體還含有輕鏈可變區(qū)，對于此，使用相同的方法，已經(jīng)確定了 DNA(SEQ IDN0.:9)和蛋白質(zhì)(SEQ ID N0.:10)序列，以及特異性 LCDR(SEQ ID N0.:11、SEQ ID N0.:12和SEQ ID N0.:13)(圖6)。因此本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以包含選自由26A1抗體的單ーLCDR(SEQ ID N0.=IUSEQ ID N0.:12 和 SEQ ID N0.:13)構(gòu)成的組中的ー種或多種序列，其可以作為包含具有與VL 26A1(圖6B;SEQ ID N0.:10)至少90%的同一性的序列的蛋白質(zhì)序列來提供。當(dāng)需要包含作為輕鏈和重鏈的天然VL 26A1和VH 26A1的人重組抗體(以包含兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體復(fù)合物的天然構(gòu)造形式，或以作為天然抗體的重組變異體的単一蛋白質(zhì)形式)時特別應(yīng)用此蛋白。
無論如何指征同一性水平，都應(yīng)該在本發(fā)明的相關(guān)序列的整體長度上確定該同一性水平。
`[0042]如實施例中所示，26A1抗體的HCDR3可以被認(rèn)為是表征能夠結(jié)合和中和hCMV的特異性人抗體的抗原結(jié)合區(qū)。盡管如此，通常需要抗體的幾種或者全部CDR從而獲得抗原結(jié)合表面，HCDR3是抗體之間不僅在序列上而且在長度上表現(xiàn)出最高差異性的CDR。這樣的多樣性是用于通過體液免疫系統(tǒng)識別任何必要的抗原的結(jié)合區(qū)的基本要素(Xu and Davis,2000 ；Barrios Y et al.2004 ；Bond C etal.，2003)。或者，如最近的綜述，在保留了原始的結(jié)合特性的非常短的蛋白質(zhì)中，⑶R的組合可以彼此連接(Ladner R，2007)。
因此可以使用作為hCMV結(jié)合部分(moiety)的26A1抗體的HCDR，聯(lián)合或不聯(lián)合26A1抗體的其它⑶R，來產(chǎn)生hCMV中和蛋白，其可以在抗體蛋白質(zhì)框架內(nèi)(KnappikA etal.,2000)被表達(dá)，或在與抗體無關(guān)的蛋白質(zhì)框架內(nèi)(Kiss C et al.，2006)被表達(dá)。
形成26A1抗體(或選擇的區(qū)域，如分離的HCDR和LCDR)的重鏈和輕鏈的可變區(qū)可以包括在設(shè)計為功能抗體片段的任何其它蛋白質(zhì)中，如在文獻(xiàn)中以不同的名字描述的，如Scfv (單鏈可變片段)、Fab (可變重鏈/輕鏈異源ニ聚體)、雙價抗體、多聚肽體(peptabody)、VHH(重鏈抗體的可變區(qū))、分離的重鏈或輕鏈、雙特異抗體，或用于臨床應(yīng)用的其它工程抗體變異體(Jain M et al., 2007 ；Laff Iy E and Sodoyer R, 2005)。
可以使用26A1抗體的序列通過輕鏈可變區(qū)(VL)改組(shuffling)的方法來產(chǎn)生備選的抗體。事實上，可以產(chǎn)生幾種不同的抗體，并且在確定具有提高的親和力、穩(wěn)定性和/或重組產(chǎn)量的特性的VH/VL組合的范圍內(nèi)，使用單一重鏈可變區(qū)VH(如26A1的ー個)與VL區(qū)文庫的組合來檢測hCMV特異性活性(Ohlin M etal.，1996 ;Rojas G et al.,2004 ；Watkins N et al.,2004)。
開發(fā)新型的生物活性肽的新方法還顯示了合成含有L-氨基酸和/或D-氨基酸的CDR衍生的多肽的可行性，該多肽保持了原始的活性，并且可能具有更合適的藥理學(xué)分布(Smith J et al., 1995 ；LeviM et al., 2000 ；ffijkhuisen A et al.,2003)。
因此，26A1抗體的HCDR3以及與26A1抗體的HCDR3高度相似的序列、包含其的融合蛋白以及源自其的合成多肽(例如含有L-氨基酸、D-氨基酸，以正常的或以逆反構(gòu)造)可以被檢測并且被用作hCMV結(jié)合和中和蛋白質(zhì)。
此外，已知可在特定的位置修飾抗體從而產(chǎn)生具有改良特性的抗體，尤其是對于臨床應(yīng)用(如更好的藥物動力學(xué)特性或?qū)乖叩挠H和力)?？梢栽贑DR和/或26A1抗體的框架中制造這些變化，可以通過應(yīng)用任何利用親和カ成熟的抗體合理設(shè)計的專用技術(shù)和其它方法來選擇序列(Kim S et al.，2005 ；Jain M et al，2007)。
一般而言，本發(fā)明的蛋白質(zhì)被提供作為抗體，如具有特異性同種型的完整人單克隆抗體。例如，IgG同種型是幾乎所有經(jīng)批準(zhǔn)的治療抗體的抗體形式(LafTly E andSodoyer R, 2005)。但是，將分離自HIV中和IgGl的抗原表位轉(zhuǎn)移到人IgA序列上，得到的抗體也能夠抑制HIV感染(Mantis N et al.，2007)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以被提供作為抗體片段、生物活性肽或融合蛋白。即使不提高的話，所有的這些備選分子也應(yīng)該保持被確定用于26A1抗體的原始的hCMV結(jié)合和中和特性。在融合蛋白的情況中 ，異源蛋白質(zhì)序列可以位于26A1衍生的序列的N-或C-末端，而不影響hCMV特異性部分(moiety)(例如，抗體片段)的正確表達(dá)和生物活性。
術(shù)語“異源蛋白質(zhì)序列”表示不是天然存在于hCMV特異性部分(例如，抗體片段)的N-或C-末端位置的蛋白質(zhì)序列。一般通過重組DNA技術(shù)來融合編碼該蛋白質(zhì)的DNA序列，并且該DNA序列包含編碼至少5個氨基酸的序列。
通常選擇這樣的異源蛋白質(zhì)序列用于提供hCMV特異性抗體片段附加的特性來進(jìn)行特異性診斷和/或治療使用。這樣的附加特性的實例包括:更好的檢測或純化方式、附加的結(jié)合部分(moiety)或生物配體或融合蛋白的翻譯后修飾(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、SUMO化修飾或內(nèi)部蛋白水解切割)。
可替代地(或除了與異源蛋白質(zhì)序列融合)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性可以通過與不同的化合物，如治療、穩(wěn)定或診斷制劑的結(jié)合來被提高。這樣的制劑的實例是可檢測到的標(biāo)記(舉例來說，放射性同位素、熒光化合物、毒素、金屬原子、化學(xué)發(fā)光化合物、生物冷光化合物或者酶)，其可以使用化學(xué)連接物或聚合物來被結(jié)合。可以通過與其它的治療蛋白質(zhì)(如改變診斷或治療應(yīng)用中的代謝和/或穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)或聚合物)結(jié)合來提高h(yuǎn)CMV特異性生物活性。
在文獻(xiàn)(NilssonJ et al, 1997 ； " Applications Of Chimeric GenesAnd HybridProteins " Methods Enzymol.Vol.326-328, Academic Press, 2000 ;W0 01/77137)中提供了選擇和設(shè)計蛋白質(zhì)部分、配體和合適的連接物的方法，以及用于構(gòu)造、純化、檢測和使用融合蛋白的方法和策略，并且這些方法和策略在臨床和研究實驗室中是普遍可獲得的。例如，融合蛋白可以含有被市售抗體識別的序列(包括多聚組氨酸、FLAG、c-Myc或HA的標(biāo)簽蛋白)，其能夠有助于體內(nèi)和/或體外融合蛋白的識別，或其純化。
其它的蛋白質(zhì)序列可以通過直接的熒光分析(如在綠色熒光蛋白的情況下)，或通過特異性的底物或酶(舉例來說，使用解蛋白位點)來識別?？梢酝ㄟ^與載體蛋白融合來提高h(yuǎn)CMV特異性抗體、抗體片段、生物活性肽和融合蛋白的穩(wěn)定性，載體蛋白如噬菌體外殼蛋白(cp3或cp8)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、牛血清白蛋白(BSA)或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。
26A1抗體是本發(fā)明的主要目標(biāo)，在特定次培養(yǎng)物的上清液中，它已經(jīng)被鑒定為人IgGl單克隆抗體，其由于中和hCMV的能力而被選擇。該特性通過使用細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液(表I)在體外進(jìn)行中和試驗來確定，并且隨后確定為蛋白A純化的(圖3)和重組的(圖9和10 ；SEQ ID N0.:15和17)人單克隆抗體。
使用病毒抗原中已知的多個hCMV中和抗原表位沒有確定出被26A1抗體識別的特異性hCMV抗原(圖1、圖2和圖4)。因此，該IgG抗體可以被用于確定hCMV中和抗原表位和結(jié)合這樣的抗原的蛋白質(zhì)(例如，以抗體、抗體片段、生物活性肽、融合蛋白或任何天然/重組蛋白質(zhì)的形式)，該蛋白質(zhì)能夠通過識別這樣的抗原表位來中和hCMV感染。
過去，還使用利用hCMV特異性截短蛋白或合成多肽的ELI SA或蛋白質(zhì)印跡(Greijer A et al.，1999 ;0hlin M et al.，1993)，以這種方法，針對于 hCMV 的抗體根據(jù)它們的抗原被限定為糖蛋白H(TO94/16730、TO 94/09136、TO 92/1 1018)、糖蛋白B(EP248909、W0 93/21952)或糖蛋白 M/糖蛋白 N(Shimamura M et al.,2006) 此外 hCMV病毒的其他組成不僅影響病毒嗜性，而且可以成為hCMV中和抗體的目標(biāo)，如在pUL130和pUL128(ffang D and ShenkT，2005)的情況中。因此，被26A1抗體識別的CMV抗體/抗原表位可以通過根據(jù)以上所引的文獻(xiàn)的不同的體外試驗來被識別。
本發(fā)明的另外ー種實施方式是由26A1次培養(yǎng)物分泌的人IgGl抗體，其可以作為結(jié)合和中和hCMV的蛋白A純化的天然抗體來被提供。該IgGl抗體可以被用于識別也能夠結(jié)合并中和hCMV的競爭蛋白。在以上的描述和實施例中提供了相似的蛋白，尤其是作為重組人抗體和抗體片段。
與被26A1抗體和以上所確定的其它蛋白識別的病毒抗原表位相關(guān)的hCMV中和的機制可以通過現(xiàn)有的對特異性結(jié) 構(gòu)hCMV蛋白和/或病毒株的試驗來表征，如在使用人血清組(Navarro D et al,1997 ；Klein M et al.,1999 ；ffeber B et al.,1993 ；Rasmussen L etal, 1991 ； Mar shall G et al., 2000)或單克隆抗體組(Schoppel K et al., 1996 ；SimpsonJ et al., 1993 ；Gicklhorn D et al.，2003)的文獻(xiàn)中指出的。
本發(fā)明的其它目的是編碼任一以上確定的抗體、抗體片段、融合蛋白、生物活性肽或分離的HCDR和LCDR的核酸。實施例提供了這樣的序列，尤其是作為編碼26A1重鏈(SEQID N0.:4)和輕鏈(SEQ ID N0.:9)的完整可變區(qū)的(圖5A和6A)。這些DNA序列(或選擇的區(qū)域，如那些編碼特異性HCDR和LCDR的；圖5和6)可以轉(zhuǎn)移到載體中從而以抗體的可選形式(舉例來說，完整的、親和力-成熟的或CDR移植的或抗體片段)之一或融合蛋白來進(jìn)行表達(dá)。這些核酸可以包含與SEQ ID N0.:4具有至少90%同一性的序列，根據(jù)僅需要來自于26A1的重鏈的序列，還是需要來自于重鏈和輕鏈的序列，這些核酸具有或不具有還包含了與SEQ IDN0.:9具有至少90%同一性的序列的序列。
當(dāng)需要的是完整的人抗體的時候，該抗體應(yīng)該還包含從IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定區(qū)構(gòu)成的組中選擇的重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選，重鏈恒定區(qū)是人IgA、IgGl (如在26A1次培養(yǎng)物鑒定的天然26A1抗體中的)、IgG2或IgG4。編碼26A1重鏈和輕鏈的完整可變區(qū)的核酸序列已經(jīng)通過PCR反應(yīng)和含有得到的PCR產(chǎn)物的載體(其被用于轉(zhuǎn)化E.coli細(xì)胞)被克隆并且鑒定。這樣的序列可以被轉(zhuǎn)移到(部分或者完全)到其它的載體中，尤其是到載體的表達(dá)框中或可操作地連接到合適的調(diào)節(jié)序列(舉例來說，啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子)的其它載體的表達(dá)框中。
可以使用這樣的載體來轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，人26A1單克隆抗體或任何源自這種抗體的其它蛋白質(zhì)序列能夠表達(dá)為重組蛋白。包含本發(fā)明的核酸的宿主細(xì)胞可以為原核或真核宿主細(xì)胞，并且應(yīng)該能使理想的重組蛋白被分泌。產(chǎn)生這樣蛋白質(zhì)的方法包括:在合適蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了包含其編碼序列的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收該蛋白質(zhì)。該載體應(yīng)該包括啟動子、核糖體結(jié)合位點(如果需要的話)、起始/終止密碼子、前導(dǎo)/分泌序列，其可以驅(qū)使理想蛋白質(zhì)的單或雙順反子轉(zhuǎn)錄的表達(dá)。該載體應(yīng)該允許重組蛋白質(zhì)在原核或真核宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。然后可以分離基本上在這樣的細(xì)胞中富集的細(xì)胞系從而提供穩(wěn)定的細(xì)胞系。
通過應(yīng)用常規(guī)的重組DNA技術(shù)可以使用核酸和宿主細(xì)胞來產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)。簡單地說，理想的DNA序列可以通過限制酶來消化初始的克隆載體來提取，或者使用這樣的載體作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板和用于特異性擴增重鏈和輕鏈的完整可變區(qū)或只是其部分(舉例來說HCDR3序列)的PCR引物來擴增。然后，如在如何克隆和產(chǎn)生重組蛋白的書籍和文獻(xiàn)綜述中描述的，包括牛津大學(xué)出版社出版的“A Practical Approach”系列(“DNA Cloning 2 !Expression Systems”，1995 ;“DNA Cloning 4:MammaIian Systems”，1996 ； " Protein Expression" ,1999; " Protein Purification Techniques" ,2001),這些DNA片段可以被轉(zhuǎn)移到用于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的更為合適的載體中。
對于真核宿主(例如，酵母、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞)，根據(jù)宿主的特性可以使用不同的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列。它們可以來自病毒源，如腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、猴病毒等，其中調(diào)節(jié)信號與具有高水平表達(dá)的特殊基因相關(guān)。實例為皰疹病毒的TK啟動子、SV40早期啟動子、酵母gal4基因啟動子等。可以選擇轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)信號，其能夠瞬時(或組成性)阻遏和激活以及調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
編碼重組蛋白的序列可以被改造并且再克隆從而在DNA水平進(jìn)行修飾，僅DNA水平的修飾能夠例如使用其中密碼子選擇和限制性內(nèi)切位點是最適合于在特定載體和宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)的選擇DNA序列的軟件來確定(Grote A et al, 2005 ；Carton J et al.,2007)。
在其它的克隆步驟中，可以蛋白質(zhì)序列與理想的抗體形式相連(Scfv、Fab、抗體片段、完整的人抗體等等)而添加或插入、取代或去除的ー個或多個內(nèi)部氨基酸。這些技術(shù)還可以用于進(jìn)ー步表征結(jié)構(gòu)和功能以及一般蛋白質(zhì)和特殊抗體的治療性能的優(yōu)化(Kim Setal.，2005)，以及用于產(chǎn)生可以使它們在體內(nèi)穩(wěn)定傳送的載體(Fang J et al.，2005)。例如，通過選擇特異性的Fe區(qū)從而融合到可變區(qū)中(Furebring C et al.,2002 ；LogtenbergT，2007)，通過產(chǎn)生單鏈抗體片段(Gilliland L et al.，1996)，和通過添加穩(wěn)定肽序列(W001/49713)、聚合物或放射化學(xué)藥品來化學(xué)修飾殘基(Chapman A etal.，1999)，重組抗體還可以在結(jié)構(gòu)和/或活性水平被改進(jìn)。
編碼重組蛋白的DNA序列，一旦插入到合適附加型或非同源或同源整合載體中，可通過任何合適的方法(轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、結(jié)合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射)被引入到合適的宿主細(xì)胞中從而轉(zhuǎn)化它們。選擇特殊的載體時要考慮的重要因素包括:含有該載體的宿主細(xì)胞可被識別和選擇的難易程度；理想的載體拷貝數(shù)量；和該載體是否能夠在不同種類的宿主細(xì)胞之間“穿梭”。
可以通過引入ー種或者多種的標(biāo)記(其可使含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞被選擇)選擇已經(jīng)被引入的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞。該標(biāo)記還可以提供營養(yǎng)缺陷型宿主光養(yǎng)性、殺生物劑抗性，舉例來說抗生素，或重金屬，如銅等，并且如果需要的話，可以為可裂解的或阻遏的?？蛇x的標(biāo)記基因可以直接連接到要被表達(dá)的DNA基因序列，或通過共轉(zhuǎn)染被引入到同ー細(xì)胞中。還可以需要其它的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)組件以用于最佳的表達(dá)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。在原核宿主細(xì)胞中，優(yōu)選的為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和大腸桿菌(E.coli)。在真核宿主細(xì)胞中，優(yōu)選的是酵母、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞。尤其是，例如人、猴、小鼠、昆蟲(使用基于桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng))和中國倉鼠卵巣(CHO)細(xì)胞(如實施例中所示)，提供給蛋白質(zhì)分子進(jìn)行翻譯后修飾，包括正確的折疊或者在正確位置某些形式的糖基化。酵母細(xì)胞也可以進(jìn)行包括糖基化的翻譯后肽修飾。存在多種重組DNA策略，該策略使用強啟動子序列和可用于在酵母中產(chǎn)生理想蛋白質(zhì)的高拷貝數(shù)質(zhì)粒。酵母識別克隆的哺乳動物基因產(chǎn)物中的前導(dǎo)序列并且分泌含有前導(dǎo)序列的多肽(也就是前肽)。
可利用作為表達(dá)宿主的哺乳動物細(xì)胞系在所屬領(lǐng)域中是已知的，并且包括很多可從美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)獲得的永生化細(xì)胞系，包括但是不限于中國倉鼠卵巣細(xì)胞(CHO)、Hela、幼倉鼠腎臟細(xì)胞(BHK)、猴腎臟細(xì)胞(COS)、C 127、3T3、BHK、HEK 293、Per.C^、人黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞和人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如Hep G2)和多種其他細(xì)胞系。在桿狀病毒系統(tǒng)中，用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料是以可試劑盒的形式商購獲得的(例如，可從Invitrogen購得)。
對于長期的、高產(chǎn)量的重組多肽，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以使用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達(dá)所需要的多肽的細(xì)胞系，該表達(dá)載體可含有復(fù)制的病毒源和/或內(nèi)源表達(dá)組件和在相同或不同載體上可選擇的標(biāo)記基因。在引入載體之后，被轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基之前，可使細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長一天或多天。 選擇性標(biāo)記的目的是賦予選擇抗性，其存在可以使成功表達(dá)被引入序列的細(xì)胞生長和回收。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗性克隆可以使用合適于細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)來増殖。然后分離富含這樣的細(xì)胞的細(xì)胞系從而提供穩(wěn)定的細(xì)胞系。
在完整重組人免疫球蛋白的情況中，ー個重要的步驟是選擇特異性的同種型和穩(wěn)定區(qū)。在文獻(xiàn)中廣泛描述了專門用于表達(dá)具有理想的同種型和亞型(例如human IgA、IgGl、IgG2或IgG4)的抗體的載體。那么，在可以作為瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞高水平地表達(dá)(Dinnis D and James D, 2005)的原核生物(例如，大腸桿菌(Escherichia coli)；Sorensen H and Mortensen K, 2005 ；Venturi M etal, 2002)、植物(Ma J et al, 2005)或真核細(xì)胞中，完整抗體或融合蛋白可作為重組蛋白被表達(dá)。當(dāng)必須使用包括體內(nèi)試驗的更精密的試驗進(jìn)行抗體的鑒定(其中可確定抗體的半衰期)時，這尤其是必需的?？梢曰谥亟M蛋白的表達(dá)水平進(jìn)ー步選擇宿主細(xì)胞。
另外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)，特別是作為抗體，在真核宿主細(xì)胞中(尤其是哺乳動物細(xì)胞系)表達(dá)時，已設(shè)計了不同的載體和表達(dá)系統(tǒng)以產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系庫(Aldrich T et al.,2003 ；Bianchi A andMcGrew J, 2003) 還由于細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化(Grunberg J et al.,
2003；Yoon S et al.,2004)和通過選擇或工程改造具有更高水平的抗體產(chǎn)生和分泌的克隆(Bohm E et al., 2004 ；Butler M, 2005 ；),已獲得了重組抗體的高水平、優(yōu)化的穩(wěn)定表達(dá)(Schlatter S et al.,2005)。
以上所確定的能夠結(jié)合和中和hCMV的抗體、抗體片段、生物活性肽、融合蛋白和任何其它的蛋白可以使用為人熟知的技術(shù)(其可以使重組或非重組蛋白從細(xì)胞培養(yǎng)物或從合成制備中被分離)純化。這些技術(shù)應(yīng)該提供足夠量的蛋白(微克到毫克的范圍)從而進(jìn)行用于hCMV相關(guān)的預(yù)防、診斷和治療用途的更廣泛鑒定和確認(rèn)?；诖四康?，重組或天然抗體的制劑在體內(nèi)或體外試驗中被檢測(生物化學(xué)、組織或細(xì)胞試驗，在嚙齒動物或靈長動物中建立的疾病模型，親和カ測量的生物物理學(xué)方法，抗原表位分析等)，尤其是使用實施例或文獻(xiàn)中公開的那些用于研究hCMV發(fā)病機理和免疫生物學(xué)的任何試驗。
可以使用文獻(xiàn)中已知的基于器官或細(xì)胞的體外試驗來確認(rèn)作為人B細(xì)胞上清液的純化制備物或作為重組蛋白表達(dá)的抗體(Eggers M et al.1998 ；Lam V et al, 2006 ；Reinhardt B et al., 2003 ；Forthal D et al., 2001 ；Goodrum F et al.,2002)。此外，可以在hCMV感染的動物中，尤其是在人宿主細(xì)胞可被移植的模型中，進(jìn)行相關(guān)的臨床前試驗(Barry P et al., 2006 ；Gosselin J et al., 2005 ；ThomsenM et al.,2005)。
可以通過任何一個常規(guī)的已知用于純化目的的方法來進(jìn)行本發(fā)明的重組蛋白的純化，也就是包括提取、沉淀、層析等的任何方法。尤其是，抗體純化的方法可以使用裝于柱中的固定凝膠基質(zhì)(Nisnevitch M and Firer M, 2001 ；Huse K et al., 2002 ；HorensteinAet al.,2003),利用抗體對基質(zhì)如蛋白A、蛋白G或合成的基質(zhì)(Verdoliva A et al.,2002 ；Roque A et al.，2004)的強親和力，或?qū)τ谔禺愋缘目乖蚩乖砦坏膹娪H和力(Murray A et al., 2002 ；JensenL et al.,2004)。在沖洗之后,通過pH值或離子強度的變化，蛋白被從凝膠上洗堤?；蛘?，可以使用HPLC(高效液相色譜)。使用通常用于蛋白質(zhì)純化的水-こ腈溶液來進(jìn)行洗堤。
以上所確定的使用26A1抗體序列的抗體、抗體片段、生物活性肽、融合蛋白和任何其它的化合物可被用于檢測、治療、抑制、預(yù)防和/或減輕hCMV感染?；诖四康?，這樣的化合物可以被用于制備用于處理hCMV感染的診斷、治療或預(yù)防組合物。
尤其是，這樣的化合物可與任何的藥物可接受媒介或載體一起來被用于制備藥物組合物。這些組合物還可以包含任何其它的治療或預(yù)防的藥物,如疫苗、hCMV中和抗體、靜脈免疫球蛋白制劑、免 疫調(diào)節(jié)化合物和/或抗病毒化合物。文獻(xiàn)提供了ー些作用于hCMV復(fù)制(Foscarnet、Vanganciclovir、Fomivirsen 或 Ganciclovir)并且已經(jīng)在人中單獨或與浄脈免疫球蛋白一起被試驗的化合物的實施例(De Clercq E, 2003 ；Nigra G et al, 2005)
此外，最近的文獻(xiàn)表明人單克隆抗體可被用于補充(如果可能的話，代替)現(xiàn)有的療法，如靜脈免疫球蛋白制劑和/或抗病毒化合物，提供了減少這樣的藥物組合物的頻率和/或劑量的機會(Bayry Jet al.,2007)。
這些組合物可以包含以上所確定的基于人26A1單克隆抗體序列的序列和活性的抗體、抗體片段、生物活性肽、融合蛋白或任何其它化合物。該組合物還可以包含不同的hCMV中和抗體、靜脈免疫球蛋白(IVIg)制劑和/或抗病毒化合物。不同的hCMV中和抗體應(yīng)該以不同的抗原表位為特征，如文獻(xiàn)或?qū)＠暾圗P07114782、EP07115410和EP07111741(分別為10B7、8C10和1F7)中已經(jīng)介紹的與gH|、gB或其它hCMV抗原相關(guān)的那些。事實上，文獻(xiàn)顯示了許多實施例，其中，當(dāng)兩種或多種針對于病毒或人目標(biāo)的抗體被組合到藥物組合物中時，得到的組合物可能具有提高的治療效能，不是由于簡單的附加效果而是由于特殊的協(xié)同效果(Logtenberg T, 2007)
包含任一以上確定的蛋白質(zhì)(例如，抗體、抗體片段、融合蛋白、生物活性肽)和核酸的組合物可出于hCMV相關(guān)的診斷、治療或預(yù)防的目的而使用并給予個體。這些組合物可以作為hCMV特異性的被動免疫的方式來給藥，其提供治療化合物，該治療化合物能通過以hCMV病毒為靶標(biāo)來抑制接受治療的患者體內(nèi)該病毒的増殖，并且潛在地阻止病毒感染在人群中的爆發(fā)。
根據(jù)特異性的應(yīng)用，該組合物應(yīng)該長期或短期提供化合物給人類受治療者(尤其是懷孕婦女或任何其他的感染了 hCMV或被認(rèn)為由于接觸hCMV感染個體而具有hCMV風(fēng)險的個體)?；诖四康?，可以單劑量或多劑量和/或使用合適的裝置，通過不同的途徑來進(jìn)行給藥:肌肉、靜脈、皮下、局部、黏膜，通過噴霧器或吸入器，作為滴眼液，以生物不能降解或可降解的基質(zhì)材料，或使用微粒藥物遞送系統(tǒng)。尤其是，該組合物可以進(jìn)行局部或眼部給藥，其提供了使hCMV存在于粘膜和眼部中的有效的方法。此外，當(dāng)被局部施用于傷ロ(Streit M et al, 2006)、角膜(Brereton H et al., 2005)或陰道(Castle P et al., 2002)時，抗體和抗體片段是有效的。
本發(fā)明的藥物組合物應(yīng)該為受治療者提供在治療或預(yù)防上有效劑量的化合物，以使該化合物的活性發(fā)揮足夠長的時間。理想的效果是通過控制hCMV的感染、激活和/或再感染，以及通過至少減少ー些hCMV感染的臨床表現(xiàn)，如視網(wǎng)膜炎或肺炎，來改善hCMV患者的病況(Landolfo S et al.，2003)。例如，根據(jù)給藥的途徑、給藥劑數(shù)和個體的狀態(tài)，該組合物可以約0.005mg/Kg體重到約50mg/Kg體重的有效量給藥。
在具有診斷用途的組合物的情況中，或當(dāng)體內(nèi)給予受治療者時，至少在給藥之后
1、2、5、10、24或更多小時之后，使用在臨床和研究實驗室普遍使用的用于檢測生物樣品中的病毒的技術(shù)來檢測化合物(例如，ELISA或其它的血清學(xué)檢測)。使用本發(fā)明的蛋白可以進(jìn)行hCMV的檢測，取代或結(jié)合已知的已經(jīng)建立的用于監(jiān)控免疫活性和免疫低下宿主的危險人群中的慢性或急性hCMV感染的方法和規(guī)程，其中存在體外產(chǎn)生的數(shù)據(jù)和臨床狀態(tài)之間的相互關(guān)系(Gilbert G, 2002 ；Gerna G and Lilleri D,2006 ；Lazzarotto T et al,2007)。
治療、預(yù)防或診斷hCMV、或hCMV相關(guān)疾病的方法可以包含以上所確定的蛋白或核酸的給藥。該方法還可以進(jìn) ー步包含給藥不同的hCMV中和抗體、靜脈免疫球蛋白(IVIg)制劑和/或抗病毒化合物。
臨床發(fā)展和應(yīng)用應(yīng)該基于抗體的藥物代謝動力學(xué)和藥效學(xué)(Lobo E et al.，
2004；Arizono H et al., 1994)、臨床前期和臨床安全數(shù)據(jù)(Tabrizi M and Riskos L,2007)并遵守用于治療和人的體內(nèi)診斷的單克隆抗體的生產(chǎn)和質(zhì)量控制的國際標(biāo)準(zhǔn)(Harris R et al.2004)。
本發(fā)明的蛋白還可以用于制備檢測、治療、抑制、預(yù)防和/或減輕被確定為hCMV相關(guān)或與hCMV有關(guān)的疾病的其它更廣泛分布的疾病(如心血管疾病和自身免疫疾病，或某些類型的癌癥)的組合物。在這些情況下，hCMV被認(rèn)為是可能的輔助因子，因為該病毒與細(xì)胞/免疫學(xué)炎癥過程(通過刺激Fe受體、細(xì)胞黏附分子、趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá))、自身免疫活性(例如，在動脈粥樣硬化、心瓣手術(shù)后的再狹窄)、以及導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、分化和遷移(例如在血管中和活躍増殖的細(xì)胞中)的抗原呈遞途徑(通過MHC類I和II的表達(dá))的改變有關(guān)是公知的(Cinatl J et al,2004 ；Soderberg-NaucIer C,2006b)。
此外，還發(fā)現(xiàn)hCMV感染與細(xì)胞代謝的改變(Munger J et al.，2007)、阻遏(或抑制，depression) (Phillips A et al., 2007)或血栓形成事件的危險因素(Fridlender Zet al.,2007)有夫。還在癌癥患者(Sandherr M et al.，2006 ；Han X，2007)或患有結(jié)締組織炎癥的患者(Yoda Y et al.，2006)，以及總體說來在接受如皮質(zhì)固醇類的免疫抑制治療(Yamashita M et al.，2006)或化學(xué)療法或其它的抗體免疫抑制治療方案(O' Brien Set al.,2006 ；Scheinberg P et al.，2007)的患者中發(fā)現(xiàn)了 hCMV的激活和相關(guān)的并發(fā)癥。
通過以下的實施例來描述本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明。
實施例
實施例1:分泌中和hCMV感染性的人單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)生
材料與方法
血清中具有中和hCMV的IgG抗體的人供體的選擇
根據(jù)PCT/EP2005/056871中和以下總結(jié)的文獻(xiàn)中概述的來進(jìn)行hCMV特異性檢測。
根據(jù)基于人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF細(xì)胞)和hCMV AD 169病毒株(ATCC的hCMV實驗室病毒株，編號為VR-538)的hCMV微量中和試驗來檢測hCMV中和抗體。
還可以使用作為從懷孕婦女的宮頸拭子回收的臨床分離物的后代的促內(nèi)皮功能的(endotheliotropic) hCMV VR1814 病韋株(Revello M et al., 2001)和人胳浄脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)來進(jìn)行hCMV微量中和試驗。通過臍帶靜脈的酶處理和在添加了 2%胎牛血清(FBS)、人重組血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、人表皮生長因子(hEGF)、胰島素生長因子(IGF-1)、氫化可的松、抗壞血酸、肝磷脂、慶大霉素和兩性霉素B(姆一種均為Iii g/ml)的內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(EGM-2, Cambrex BioScience)中進(jìn)行培養(yǎng)來獲得這些細(xì)胞。以傳代培養(yǎng)2-6代的細(xì)胞進(jìn)行實驗。
用于研究使用臨床和實驗室病毒株的hCMV感染和復(fù)制的HELF和HUVEC細(xì)胞的使用已經(jīng)在許多文章中進(jìn)行了描述(GernaG et al.,2002) 在這種情況中，細(xì)胞被放置于IOOu I生長培養(yǎng)基中的96孔板的平底孔上(2.0-2.5 X IO4/孔)，該培養(yǎng)基含有具有10%胎牛血清(FCS)、ImM丙酮酸鈉(NaP)和GPS (2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 U g/ml鏈霉素)的最低基本培養(yǎng)基(MEM ;Gibco-BRL)。細(xì)胞在37°C培養(yǎng)24小時。
將50 ill的含抗體樣品(人血清、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或指定濃度的蛋白A-純化的天然或重組IgG)與實驗室病毒株hCMV AD169 [在50iU具有5% FCS的MEM中500個空斑形成単位(Pfu);混合物的總體積是IOOiU] —起在37°C孵育I小吋。然后將抗體制備物與病毒的混合物加入到ffiLF細(xì)胞單層(用于hCMV AD 169和AL-1病毒株)或HUVEC細(xì)胞單層(用于hCMV VR 1814)中，并且孵育I小吋。從細(xì)胞單層中棄除生長培養(yǎng)基，并且用抗體-病毒混合物置換。然后在2000g將板離心30分鐘，并且于37°C下在5% CO2中孵育90分鐘。添加生長培養(yǎng)基(100 u I)，培養(yǎng)物再在孵育器中保持72小吋。
以間接免疫過氧化物酶染色，通過染色hCMV中間早期抗原(IEA，IE1+IE2)來測量B細(xì)胞上清液對hCMV感染性的作用。細(xì)胞單層用丙酮/甲醇溶液(儲存在_20°C )固定I分鐘，然后以PBS清洗。將細(xì)胞在具有I % H2O2的PBS的0.1 % Triton X-100中在冰上透化5分鐘，然后用PBS清洗。在室溫下黑暗中，用含有50%甲醇和0.6% H2O2的PBS封閉內(nèi)生過氧化物酶30分鐘，然后用PBS洗滌。在室溫下用10分鐘的時間內(nèi)加入50 u I 的蛋白封閉劑(UltraTech HRP 500-600 Test ；Streptavidin-Biotin UniversalDetectionSystem ；PN頂2391)，然后用PBS洗掉。在室溫下，在60分鐘內(nèi)將鼠抗hCMVIEA(克隆E13 ；Argene Biosoft ；ref.1ト003)加入到孔中。在清洗之后，細(xì)胞與50 U I的生物素標(biāo)記的抗人IgGニ抗(UltraTech HRP 500-600 Test ;抗生蛋白鏈菌素-生物素通用檢測系統(tǒng)(Streptavidin-Biotin Universal Detection System) ；PN IM2391)或過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Ultratech HRP) 一起孵育10分鐘。在20°C，在黑暗中，在30-45分鐘內(nèi)加入0.1% H2O2中的DAB底物(Merck ；n0.1.02924.0001)，通過用PBS稀釋來停止反應(yīng)。在顯微鏡下計數(shù)IEA-陽性的核。[0101]將僅培養(yǎng)基或者含有不相關(guān)的IgG抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液作為陰性對照。通過從125 V- g/ml開始的梯度稀釋，WAhCMV血清反應(yīng)陽性患者的血清中純化的人IgG的市售制劑(Cytotect ；Biotest)被用作陽性對照。與陰性對照孔進(jìn)行比較，將大于等于40%的IEA-陽性細(xì)胞的抑制定義為陽性。
使用Reed-Milnch法計算的50%抑制終點被認(rèn)為是中和滴定量(NT):
NT =交叉抗體稀釋[> 50%抑制]X [(大于50% -50%的抑制％ ) / (大于50%的抑制％ -小于50 %的抑制％ )]。
根據(jù)血清中結(jié)合hCMV糖蛋白gB或gH區(qū)域的IgG的存在選擇人供體
根據(jù)PCT/EP2005/056871或制造商的說明進(jìn)行hCMV-特異性結(jié)合試驗，并且通過CMV特異性的市售IgG抗體混合物(Cytotect ;Biotest)來進(jìn)行確證。在市售的結(jié)合hCMV病毒蛋白的人IgG特異性的ELISA(BEIA-CMV IgG Quant ;Bouty，編號為21465)和同樣市售的 gB(AD2)hCMV IgG ELISA(CG3 antigen Biotest AG，編號為 807035 ;圖 1A)中測試血清。
簡言之，將覆蓋有失活的hCMV蛋白混合物(來自實驗室病毒株AD169)的可破碎的碎片(strip)放置到微孔板中，并且和稀釋到1: 81的B細(xì)胞上清液(IOiU的上清液加入到800 ii I的BEIA系統(tǒng)的樣品稀釋液中)一同孵育,板在室溫下孵育30分鐘。在一輪清洗之后，加入預(yù)先稀釋的標(biāo)記了辣根過氧化物酶(IOOiU)的單克隆抗人IgG抗體，并且板在室溫下再孵育30分鐘。在第二輪清洗之后，加入預(yù)先稀釋的底物-TMB溶液(100 u I)，并且板在室溫下孵育15分鐘。使用終止溶液(100 U I/孔)使反應(yīng)停止,在450/620納米處測量雙著色(bichromatism)的光密度。
永生化人B細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)生
從急性hCMV感染(CMV7)復(fù)原的患者獲得外周血單核細(xì)胞(PBMC)，選擇這些患者是因為hCMV中和抗體存在于其血清中。隨后CMV7患者的PBMC要進(jìn)行的EBV永生化過程是根據(jù)PCT/EP2005/056871的教導(dǎo)進(jìn)行的。簡單來說，以常規(guī)的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficol 1/Hypaque)密度梯度離心來從外周血純化PBMC。根據(jù)生產(chǎn)商說明的VarioMACS技術(shù)(Miltenyi Biotec Inc.)以抗人⑶22涂覆的微珠從新鮮的PBMC (> 90%的純度)分離CD-22 陽性細(xì)胞。以 CpG2006 (Coley, I u g/ml)和 IL-2 (Roche, 200U/ml)的組合來刺激純化細(xì)胞。在4天的刺激之后，用新鮮的培養(yǎng)基(RPM1-1640)來清洗細(xì)胞，根據(jù)生產(chǎn)商說明，通過使用VarioMACS技術(shù)(Miltenyi Biotec Inc.)，用涂覆有抗人IgG的微珠將B細(xì)胞高度富集于IgG陽性細(xì)胞中。
在37°C和5% CO2中，將選擇的和經(jīng)刺激的細(xì)胞懸浮保持在24孔板中的添加了10% (v/v)熱失活FCS (胎牛血清)、ImM丙酮酸鈉、IOOii g/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPML-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中。使用B95.8細(xì)胞上清液(I: lv/v，16小時)來進(jìn)行EBV永生化。[0110]在該過程的結(jié)尾，用新鮮的培養(yǎng)基(加入了 10%胎牛血清的RPMI 1640)清洗永生化細(xì)胞，并且將其以1.5 X IO6細(xì)胞/ml的密度在具有飼養(yǎng)層(feeder layer)(放射性的異源PBMC以5X IO5細(xì)胞/孔接種)而沒有CpG2006(沒有PCT/EP2006/069780中所描述的用于從CMV5供體獲得的PBMC開始的方法的CPG2006)的24孔板中培養(yǎng)3周。
分泌hCMV中和抗體的永生人B細(xì)胞的次培養(yǎng)物的選擇
在暴露于EBV 15天之后，通過以上所描述的基于AD169/HELF的微量中和試驗在擴大的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中證實hCMV中和活性。然后，細(xì)胞以20細(xì)胞/孔接種在添加了 10% FCS和非必要氨基酸(NEAA，從100X的市售母液稀釋到IX ；EuroClone)并且沒有CpG2006和IL-2的100 u I IMDM中的放射性的(30Gy)異源PBMC (50，000/孔)上。產(chǎn)生了總共4224的次培養(yǎng)物，2周后，添加50 Ul相同的培養(yǎng)基。再培養(yǎng)1_2周之后，使用基于HELF細(xì)胞和hCMV病毒株AD 169的hCMV微量中和試驗來平行測試呈現(xiàn)正在生長的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液和收集的細(xì)胞。
使用以上描述的用于檢測人IgG結(jié)合到gB hCMV包膜糖蛋白區(qū)域或總hCMV蛋白的ELSA來檢測表現(xiàn)出hCMV中和活性的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
或者產(chǎn)生作為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白的gB-或gH抗原。在gB (Ag)-GST抗原的情況下，hCMV病毒株C 194的gB免疫優(yōu)勢區(qū)被融合到GST (BioDesign，Cat.N0.Rl 8102 ;GS_4B瓊脂糖親和純化，lmg/ml)。在gH (Ag)-GST抗原的情況中，hCMV病毒株VRl 814的gH糖蛋白片段通過PCR被克隆，融合到GST基因，在E.coli中產(chǎn)生，并且在GST親和カ的基礎(chǔ)上從細(xì)菌細(xì)胞裂解物中純化。重組gH (Ag)-GST抗原相當(dāng)于hCMV病毒株VR1814的gH氨基末端區(qū)(氨基酸16-144 ;圖1B)與GST的符合讀框的融合。GST単獨被用作陰性對照。
通過在96孔板中應(yīng)用具有小改變的普通ELISA方法進(jìn)行這些ELISA。簡單來說，抗原在PBS中稀釋到g/ml，50iil這樣的蛋白溶液(含有IOOng細(xì)菌表達(dá)的融合蛋白)被用于包被EIA聚苯こ烯板(Nunc ；Cat N0.469949)。于4°C進(jìn)行ELISA板的包被過夜，然后，在去除蛋白溶液之后，用150 ill的Wash緩沖液(含有0.05%的TWeen20的PBS)將板清洗4次。然后通過于37°C在每個孔中分入100 ill含有I %的牛奶的PBS來進(jìn)行抑制非特異性結(jié)合處理達(dá)I小吋。在用150 ill的Wash緩沖液進(jìn)行4輪清洗之后，以每孔50 U I的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液在37°C孵育2小吋，使用50 u I/孔的細(xì)胞培養(yǎng)基作為陰性對照。在四輪清洗之后，50 Ul的ニ抗[標(biāo)記了辣根過氧化物酶的羊抗人IgG (Fe特異性)抗體；在wash緩沖液中稀釋到I: 30,000 ;Sigma，Cat.N0.AO 170]分散到每個孔中，在室溫下將板孵育I小吋。在再進(jìn)行四輪清洗之后，通過室溫下在每個孔中添加50 Ul的底物-TMB (3，3'，5，5'四甲基聯(lián)苯胺；Sigma，Cat.N0.T0440)來進(jìn)行酶反應(yīng)再達(dá)30分鐘。通過在每個孔中加入100 ill的終止溶液(IN硫酸)來終止顯色反應(yīng)，并且在450nm處讀取光密度。
益果
人PBMC是從在血清中表現(xiàn)出顯著的hCMV中和滴定量(以1: 105稀釋的50%的中和)，以及在基于結(jié)合到糖蛋白B的AD2區(qū)的ELISA(以1: 64稀釋的陽性樣品被認(rèn)為是對以1/4或更高程度稀 釋的IgG抗gB的存在陽性)表現(xiàn)出強烈反應(yīng)性的hCMV患者(CMV7)獲得，糖蛋白B被認(rèn)為最適合誘導(dǎo)血清中和抗體的hCMV抗原之一(Qadri I et al，1992;KropffB et al.，1993)，并且被克隆到CG3抗原之中(圖1A)。此外，CMV7血清在另外ー個使用總hCMV病毒蛋白的ELISA中是陽性的，其中測量到了 74AU/ml的活性(當(dāng)結(jié)果是至少10AU/ml時，樣品被認(rèn)為是對于抗-hCMVIgG的存在是陽性的)。
使用PCT/EP2005/056871 和 PCT/EP2006/069780 中公開的 EBV 永生化的方法，CMV7患者的B細(xì)胞被用于產(chǎn)生高度富集分泌IgG的B細(xì)胞的永生化的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物。與后一文獻(xiàn)相比，公開了從另外的供體(CMV5)選擇抗hCMV抗體，在沒有CpG2006的情況下從原始大量的多克隆永生化細(xì)胞群體制備次培養(yǎng)物，并且首先選擇，并且僅在選擇結(jié)合于所選擇的hCMV抗原之后，選擇上清液通過微量中和試驗來中和存在的hCMV感染性的抗體。
hCMV微量中和試驗只應(yīng)用于次培養(yǎng)物，其在培養(yǎng)3周時證明生長旺盛具有多簇細(xì)胞。首先在hCMV中和試驗中篩選了 324孔中的上清液，發(fā)現(xiàn)其中的20個上清液至少降低40%的hCMV AD 169感染性。當(dāng)鑒定這些孔中的hCMV結(jié)合活性時，只發(fā)現(xiàn)了兩個對gB為陽性(為CG3抗原或gB (Ag) -GST融合蛋白)，對于gH不呈陽性(作為gH(Ag) -GST融合蛋白；圖1B)，18個孔對任何一個都不呈陽性(圖2)。
由于起始接種在每個孔的細(xì)胞數(shù)量少(20細(xì)胞/孔)，每個表現(xiàn)hCMV中和活性的次培養(yǎng)物都可能產(chǎn)生單克隆抗體(也就是由單一特異性永生化細(xì)胞克隆產(chǎn)生的多個細(xì)胞分泌的)，尤其是假設(shè)被期望生長和分泌hCMV中和IgG的永生化多克隆細(xì)胞群體中的低頻率細(xì)胞。設(shè)計進(jìn)一歩的實驗活性以驗證這個設(shè)想。
實施例2:26A1抗體的鑒定
材料和方法
26A1次培養(yǎng)物的擴培和鑒定
來自原始的次培養(yǎng)26A1的細(xì)胞在頂DM培養(yǎng)基(添加了 10% FCS和NEAA)中的放射異源PBMC上擴培(expand)，在這個擴培步驟的過程中使用如實施例1中所描述的hCMV微量中和試驗證實hCMV中和活性至少兩次(見表I)。
根據(jù)制造商的使用說明，使用市售定量人IgG ELISA試劑盒(Immunotek ;編號為0801182 ；Zeptometrix Corp.)來確定在24、48和72小時由26A1次培養(yǎng)物分泌的抗體數(shù)量。使用市售化驗(PeliClass人IgG亞類ELISA組合試劑盒(PeliClass humanIgGsubclass ELISA comb1-kit);編號為 #RDI_M1551cib, RDI Divison ofFitzgeraldIndustries Intl.)來確定26A1抗體的亞類。
通過在添加了 5 % FCS的頂DM中的放射異源PBMC上將96孔板中的I個孔中含有的細(xì)胞I X IO5)接種到48孔板的一個孔中對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行逐步擴培。在5-7天之后，在添加了 5% FCS的IMDM中的沒有飼養(yǎng)層的24孔板中的一個孔中對細(xì)胞進(jìn)行擴培。然后，將細(xì)胞(5 X105/ml)置于添加了 2.5%的FCS的50%頂DM和50 %的雜種瘤-SFM(Gibco，編號為12045-084)中的沒有飼養(yǎng)層的6孔板中。在這樣的條件下，培養(yǎng)細(xì)胞至少一周。然后清洗指數(shù)生長的細(xì)胞，并且以5X IO5至106/ml的濃度在T75瓶的雜種瘤-SFM中進(jìn)行培養(yǎng)。收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，在蛋白A柱上定量和純化IgG，以PBS緩沖液透析并且過濾(0.2 ii M)。
26A1次培養(yǎng)物分泌的抗體的鑒定
實施例1中描述了 BEIA_CMV、gB和gH的ELISA試驗(圖1和圖2)。根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行 HSV 試驗(Laquerre S et al, 1998)。
使用hCMV AD 160病毒株進(jìn)行hCMV空斑減數(shù)試驗。簡單來說，病毒被稀釋到IOOOPFU/反應(yīng)。等量(0.1ml)的病毒和每種抗體或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液混合，并且在37°C下孵育I小吋。混合物被添加到ffiLF單細(xì)胞層(在24孔板中)并且使其在37°C吸收I小吋。去除掉抗體-病毒混合物，將I %甲基纖維素覆蓋層-MEM-2% FCS加入到被感染的細(xì)胞。在感染后10或12天對空斑進(jìn)行計數(shù)作為感染性的測量值。
以免疫熒光在未感染的HELF或HUVEC細(xì)胞上檢測26A1細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。簡言之，將細(xì)胞(7X 104/ml)接種到添加了 10% FCS的MEM中的24孔板中的膠質(zhì)包被的玻璃蓋玻片上，然后生長到半?yún)R合(sem1-cofluence)的狀態(tài)。然后用溫?zé)岬腜BS清洗細(xì)胞兩次，并且在50%丙酮/50%甲醇的預(yù)冷(_20°C)的混合物中于室溫(RT)下固定I分鐘，然后用PBS清洗。固定的細(xì)胞用PBS中的0.2% TritonX-1OO在冰上透化20分鐘，用PBS清洗，并且在室溫下用封閉液(添加了 2% FCS的PBS)孵育15分鐘?；蛘?，固定細(xì)胞不被透化從而確定抗體識別細(xì)胞表面組成的能力。在這種情況下，以PBS清洗固定的細(xì)胞，在室溫下用封閉液(添加了 2% FCS的PBS)孵育15分鐘，并且在37°C下與26A1細(xì)胞培養(yǎng)物上清液(80 u I) 一起孵育2小吋。然后用溫?zé)岬腜BS清洗細(xì)胞(3次)，并且和80 ill的FITC標(biāo)記的兔抗人IgG(ab' ) 2 ( Jackson ImmunoResearch) 一起孵育，人IgG染色示蹤為綠色。在添加了 0.05% Tween 80的PBS中將ニ抗稀釋到1: 50，并且于37°C在黑暗中將其加入到細(xì)胞中。然后，用溫?zé)岬腜BS清洗細(xì)胞(3次)，碘化丙啶染色計數(shù)(在PBS中的濃度0.25 Ug/ml ;Sigma)。使用封固劑(Vector Laboratories)將蓋玻片封固在顯微鏡載玻片上。用Olympus Fluoview-1X70倒置共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行圖像記錄。
26A1 IgG DNA/蛋白質(zhì)序列的鑒定和重組表達(dá)
根據(jù)Fusion Antibodies Ltd建立的技術(shù),從最初的26A1細(xì)胞培養(yǎng)物的擴大得到的細(xì)胞培養(yǎng)物等分試樣被用于26A1抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)的測序。冷凍細(xì)胞球(至少含有50，000個細(xì)胞)被用于提取總RNA。通過用寡聚脫氧胸苷酸(oligo(dT))引物的反轉(zhuǎn)錄獲得對應(yīng)的cDNA。建立使用IgG特異性引物的混合物的PCR反應(yīng)來擴增VH區(qū)，以Igk/入引物的混合物來擴增VL區(qū)。使用Eco RI限制性內(nèi)切位點將兩個擴增反應(yīng)的PCR產(chǎn)物克隆到測序載體(pCR2.1 ；Invitrogen)中并且被用于轉(zhuǎn)化T0P10 E.coli細(xì)胞。
挑出從兩個轉(zhuǎn)化獲得的至少10個所選菌落，并且通過測序進(jìn)行分析。得到的DNA序列進(jìn)行比對，并且翻譯成產(chǎn)生VH 26A1 (分別為SEQ ID N0.:4和SEQ ID N0.:5)和VL26A1 (分別為SEQ IDN0.:9和SEQ ID N0.:10)共有DNA和蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列。VH26A1和VL 26A1蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較,并且和與公眾領(lǐng)域的數(shù)據(jù)庫(使用GenomeQuest、GeneSeq和EBI數(shù)據(jù)庫)中的序列進(jìn)行比對。通過IMGT數(shù)據(jù)庫(Giudicelli V et al, 2004)預(yù)測表現(xiàn) VH26A1(SEQ ID N0.:5、7 和 8)和 VL 26A1 (SEQ ID N0.:11、12 和 13)蛋白質(zhì)序列特征的⑶R。
通過將共有26A1重鏈和輕鏈可變區(qū)序列克隆到同一表達(dá)載體(已經(jīng)含有了對應(yīng)的恒定區(qū)(對于人IgG重鏈和人Ig入鏈))和能夠使兩條抗體鏈都表達(dá)的雙啟動子載體中，在真核細(xì)胞中表達(dá)重組人26A1單克隆抗體。載體中的重組人26A1單克隆抗體的完整序列通過DNA測序來證實，并且被用于瞬時轉(zhuǎn)染CHO DG44細(xì)胞，該CHO DG44細(xì)胞適合于在無血清懸浮培養(yǎng)基中生長并且在125ml攪拌瓶中以IX IO6細(xì)胞/ml接種(Derouazi M et al,2006)。用300 ii g的表達(dá)載體和900 u g的線性25kDa聚(こ烯亞胺)的混合物來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在收獲培養(yǎng)基之前，細(xì)胞在攪拌瓶中于37°C在5% CO2中孵育6天。根據(jù)制造商的標(biāo)準(zhǔn)程序，使用Akta基本層析單元上的蛋白G柱來進(jìn)行重組抗體的純化。
結(jié)果
在含有生長的和分泌IgG的細(xì)胞的次培養(yǎng)物中，其中幾種的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液含有中和hCMV感染的抗體，但是通過ELISA測試未表現(xiàn)出對特異性重組抗原gB和gH的顯著結(jié)合(圖1和2)。尤其是，分泌IgG的26A1次培養(yǎng)物顯示更強的和更可復(fù)制的hCMV中和活性，選擇其進(jìn)行更詳細(xì)的細(xì)胞和生物鑒定。
使用含有hCMV蛋白(BEIA-CMV)混合物的ELISA來證實26A1次培養(yǎng)物的上清液中存在的IgG與hCMV的結(jié)合。同時，該上清液表現(xiàn)出對兩種人宿主細(xì)胞系統(tǒng)中的不同hCMV病毒株的hCMV的顯著中和活性(如表I所示)。當(dāng)該上清液被用于HSV-特異性中和試驗吋，則不能觀察到該活性。
此外，擴大26A1次培養(yǎng)物，并且進(jìn)ー步以10個細(xì)胞/孔進(jìn)行亞克隆，從而在hCMV中和人IgGl的表達(dá)方面證實其單克隆性。事實上，在顯示細(xì)胞生長的孔中，在基于原始AD169的實驗中都表現(xiàn)出了 50%至98%的中和活性，證實了從原始26A1次培養(yǎng)物獲得的結(jié)果。
原始26A1次培養(yǎng)物中的細(xì)胞被用于擴大IgG的生產(chǎn)，逐漸產(chǎn)生更多的培養(yǎng)物，從其中純化IgG并且在hCMV試驗中進(jìn)行測試。通過逐步擴大26A1培養(yǎng)物并且去除在細(xì)胞培養(yǎng)過程中生長的某些需要(如飼養(yǎng)層、胎牛血清)來獲得更多的培養(yǎng)物。使用這種方法，證實了從原始26A1次培養(yǎng)物產(chǎn)生的擴大的培養(yǎng)物以大約16ii g/ml/106細(xì)胞的濃度分泌IgGl。這些擴大的培養(yǎng)物顯示了即使沒有飼養(yǎng)層，在4天的加倍時間，并且在超過2個月的培養(yǎng)中保持hCMV中和活性。
以通過親和層析從大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)物純化的IgG的形式，用26A1抗體重復(fù)進(jìn)行hCMV中和試驗。使用hCMV病毒株和人靶細(xì)胞的不同組合的兩種實驗，在劑量反應(yīng)實驗中測試26A1 IgG從而評價達(dá)到50 %的hCMV感染性抑制所需要的濃度(抑制濃度50或IC50)。結(jié)果顯示蛋白A純化的26A1 IgG的潛在中和活性既不是細(xì)胞型的也不是病毒株特異性的，并且定量評價為大約I U g/ml的設(shè)定的IC50值，并且在兩個實驗中中和效果都達(dá)到100%(圖 3)。
將蛋白A純化的天然26A1 IgG的抗HUVEC細(xì)胞的臨床分離物的中和活性與市售的抗hCMV的超免疫IgG(IVIg) (Cytotect, Biotest)制劑進(jìn)行比較時，26A1的IC50值比市售制劑所需的IC50值要低25倍，證明26A1抗體的較強的中和活性。
為了排除由于結(jié)合到細(xì)胞表面分子而在26A1次培養(yǎng)物的上清液中存在的中和活性，以未感染的HELF或HUVEC細(xì)胞在免疫熒光法中檢測上清液。該試驗顯示由26A1培養(yǎng)物產(chǎn)生的IgGl不結(jié)合到未感染的人細(xì)胞。當(dāng)相同的上清液在抗相關(guān)hCMV抗原的ELISA中進(jìn)行試驗時，該抗體不結(jié)合到這樣的蛋白(圖4)，顯示了 26A1可能識別hCMV包膜上另外ー個未確定的誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的抗原。
通過將26A1來源的細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的IgG特異性PCR產(chǎn)物測序，進(jìn)ー步證實該26A1來源的細(xì)胞培養(yǎng)物中分泌的hCMV中和抗體的單克隆性。使用來自26A1次培養(yǎng)物的細(xì)胞，制備細(xì)胞球用于RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。然后分別使用人IgG重鏈和輕鏈可變區(qū)的特異性引物，將得到的cDNA用于擴增VH和VL序列。然后將PCR產(chǎn)物克隆到用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒中。隨機選擇細(xì)菌轉(zhuǎn)化子，并且用于克隆的PCR產(chǎn)物的測序。所有的克隆都顯示了相同的DNA序列，除了可能由于PCR引起的錯誤造成微小差別，從而可以確定人26A1單克隆抗體的重鏈(圖5)和輕鏈(圖6)的可變區(qū)的共有序列和CDR。
編碼26A1抗體的VH和VL區(qū)的序列可以再克隆到用于作為抗體片段的26A1可變區(qū)的正確表達(dá)(Fab或ScFv)的表達(dá)載體或到具有特異性同種型和亞類的完整人重組抗體中(例如，IgA、IgGl或IgG4)。在合適的試驗中測試這些重組抗體來證實特異性的hCMV中和活性。
通過將編碼重鏈(圖7)和輕鏈(圖8)的DNA克隆到合適的表達(dá)載體中(該載體已被用于在瞬時表達(dá)實驗中轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞)來在真核細(xì)胞中產(chǎn)生作為重組人IgGl的重組人26A1單克隆抗體。該重組人26A1單克隆抗體從細(xì)胞培養(yǎng)物上清夜通過親和純化，并且在不同的hCMV中和試驗中進(jìn)行檢測。以AD169/HELF細(xì)胞系統(tǒng)，在微量中和試驗和空斑減數(shù)實驗中進(jìn)行測試。重組人26A1單克隆抗體能以與蛋白A純化的天然21A1抗體相比的方式有效地中和hCMV感染，計算的IC50值大概是I U g/ml (圖9)。基于hCMV病毒株不同的組合和目標(biāo)細(xì)胞同樣在中和和空斑減數(shù)試驗中進(jìn)行測試，所有的都證實了天然的和重組的人26A1單克隆抗體可比較的功效(圖10)。
因此，26A1抗體，無論是以天然或重組的人單克隆抗體的形式，都是可被用于hCMV感染和hCMV相關(guān)疾病的臨床處理的抗體。
表I
權(quán)利要求
1.ー種抗體，由重鏈和輕鏈構(gòu)成，其中，所述重鏈由SEQ ID N0.:15表示，所述輕鏈由SEQ ID N0.:17 表示。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的抗體，其中，所述抗體是人重組抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1至2中任一項所述的抗體，其中，所述抗體結(jié)合并中和人巨細(xì)胞病毒(hCMV)。
4.一種編碼前述權(quán)利要求
中任一項所述的抗體的核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的核酸，其中，所述核酸的序列由SEQID N0.:14和SEQ IDN0.:16的序列組成。
6.—種包含權(quán)利要求
4或5所述的核酸的載體。
7.ー種包含權(quán)利要求
4或5所述的核酸的原核或真核宿主細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的宿主細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞分泌權(quán)利要求
1至3中任一項所述的抗體。
9.權(quán)利要求
4或5所述的核酸用于產(chǎn)生權(quán)利要求
1至3中任一項所述的抗體的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求
7或8所述的宿主細(xì)胞用于產(chǎn)生權(quán)利要求
1至3中任一項所述的抗體的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求
1至3中任一項所述的抗體用于制備檢測、治療、抑制、預(yù)防和/或減輕hCMV感染或hCMV相關(guān)疾病的組合物的應(yīng)用。
12.一種用于hCMV感染或hCMV相關(guān)疾病的治療、預(yù)防或診斷的組合物，包含權(quán)利要求
1至3中任一項所述的抗體，或權(quán)利要求
4或5所述的核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的組合物，其中，所述組合物用于眼部或局部給藥。
14.根據(jù)權(quán)利要求
12或13所述的組合物，還包含不同的hCMV中和抗體、靜脈免疫球蛋白制劑和/或抗病毒化合物。
15.權(quán)利要求
1至3中任一項所述的抗體在制造用于治療、預(yù)防或診斷hCMV感染或hCMV相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15所述的應(yīng)用，所述藥物包含不同的hCMV中和抗體、靜脈免疫球蛋白制劑和/或抗病毒化合物。
17.權(quán)利要求
4或5所述的核酸在制造用于治療、預(yù)防或診斷hCMV感染或hCMV相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17所述的應(yīng)用，所述藥物包含不同的hCMV中和抗體、靜脈免疫球蛋白制劑和/或抗病毒化合物。
專利摘要
本發(fā)明提供了新型抗體序列，其與人巨細(xì)胞病毒(hCMV)結(jié)合并中和hCMV感染。該新型序列能夠用于hCMV感染的醫(yī)學(xué)處理，尤其是用于制備用于預(yù)防或治療hCMV感染的的藥物組合物。
文檔編號C12N5/071GKCN101627115SQ200780051422
公開日2013年5月29日 申請日期2007年12月17日
發(fā)明者阿達(dá)·富納羅, 喬治·格里包多, 桑托·蘭多爾福 申請人:里博瓦克斯生物工藝有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),