在禽類中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)的制作方法

專利名稱:在禽類中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)的制作方法
在禽類中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)
相關(guān)申請信息
本申請要求享有2007年5月16日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/930,491和2007 年9月18日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/994,203的優(yōu)先權(quán)，并作為2007年1月 26日提交的美國專利申請?zhí)?1/699,257的連續(xù)部分。上述兩個(gè)臨時(shí)申請和一個(gè) 專利申請中每一個(gè)的內(nèi)容整體納入本文作為參考文獻(xiàn)。
發(fā)明范圍
本發(fā)明一般涉及在諸如轉(zhuǎn)基因雞的轉(zhuǎn)基因禽類細(xì)胞(如輸卵管細(xì)胞)發(fā)揮功 能的啟動(dòng)子和含此類啟動(dòng)子載體的用途。更具體的說，本發(fā)明涉及重組核酸和 表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如含有與編碼序列可操作連接的基因表 達(dá)控制區(qū)的載體的轉(zhuǎn)基因雞等轉(zhuǎn)基因禽類。
站旦 冃尿
最初轉(zhuǎn)基因?qū)W領(lǐng)域發(fā)展用于了解單個(gè)基因在整體動(dòng)物條件下的作用，以及 基因激活、表達(dá)和相互作用的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因技術(shù)也用于在產(chǎn)生人或其它動(dòng)物疾 病模型，在遺傳學(xué)研究、了解遺傳機(jī)制和功能的有力工具之一。從經(jīng)濟(jì)的角度， 使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將動(dòng)物轉(zhuǎn)變?yōu)?蛋白工廠"用于產(chǎn)生藥學(xué)感興趣的特定蛋白或 其它物質(zhì)(Gordon等，1987年，Biotechnology 5:1183-1187; Wilmut等，1990， Theriogenology 33:113-123)比常規(guī)用于蛋白生產(chǎn)的基因表達(dá)技術(shù)提供了更顯著 的優(yōu)勢。
一種用于表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)是禽類生殖系統(tǒng)。禽類卵的產(chǎn)生開始于在雌 鳥的卵巢中形成大的卵黃。未受精的卵母細(xì)胞或卵子位于卵黃囊的上部。排卵 后，卵子穿過輸卵管的漏斗，在此若存在精子則使其受精，接著穿過管狀腺體 細(xì)胞排列成的輸卵管分泌部。這些細(xì)胞分泌卵白蛋白，包括卵清蛋白、溶菌酶、 卵類粘蛋白、伴清蛋白和卵粘蛋白進(jìn)入分泌部內(nèi)腔，在此在禽胚和卵黃上沉積。
7過去曾在禽類生殖系統(tǒng)進(jìn)行特定靶向禽輸卵管的外源蛋白的產(chǎn)生。
靶向禽輸卵管表達(dá)外源蛋白的優(yōu)勢包括靶蛋白正確的折疊和翻譯后修飾，
易于回收產(chǎn)物，與其它動(dòng)物種屬相比鳥類如雞的發(fā)育期較短。
在轉(zhuǎn)基因禽類的輸卵管內(nèi)直接表達(dá)外源基因產(chǎn)物比在鳥體內(nèi)廣泛表達(dá)具有
顯著的優(yōu)勢。即，不期望在宿主動(dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá)生物活性基因產(chǎn)物的結(jié)果。
例如，在某些情況下重組蛋白的廣泛存在對于鳥類發(fā)育有害，殺死鳥類。此外，
鳥類的健康受到負(fù)面影響導(dǎo)致蛋白生產(chǎn)水平的降低。
在重量上，禽類卵的約60%由蛋白組成，其包括四種主要蛋白質(zhì)組分；卵
清蛋白、卵類粘蛋白、溶菌酶以及卵運(yùn)鐵蛋白，卵清蛋白和卵類粘蛋白大量存在。
過去已成功在轉(zhuǎn)基因禽類的輸卵管中使用卵清蛋白啟動(dòng)子、卵類粘蛋白啟 動(dòng)子和溶菌酶啟動(dòng)子表達(dá)異源(外源性)蛋白質(zhì)。參見，例如2005年4月5日發(fā) 表的美國專利號6,875,588; 2007年2月13日發(fā)表的7,176,300; 2007年4月3 日發(fā)表的7,199,279;以及2006年6月15日公開的美國專利公開號 2006/0130170(該三種發(fā)表專利和一種公開專利申請的每一公開文本均整體納 入本文作參考)，其公開了主要或僅在禽輸卵管中表達(dá)的不同禽類啟動(dòng)子利于 在禽類輸卵管外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。盡管這些發(fā)表的專利以及公開的申請中使用 啟動(dòng)子以及啟動(dòng)子片段的表達(dá)水平是可用的，但其產(chǎn)量仍低于0.1 mg/ml卵白。
需要在轉(zhuǎn)基因禽類的細(xì)胞尤其是輸卵管細(xì)胞(如管狀腺體細(xì)胞)中高水平表 達(dá)外源性編碼序列的系統(tǒng)。
發(fā)明概述
本發(fā)明滿足甚至超越這種需要。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過數(shù)年在轉(zhuǎn)基因禽類的 輸卵管組織中中等產(chǎn)量產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)使用本文公開的新組合物和方法 可使該表達(dá)水平提高約10倍到100倍甚至更高。
一個(gè)方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因禽類(如雞、火雞、鵪鶉)，在其基因組中含 有具有啟動(dòng)子組件和SIN載體的外源核苷酸序列。通常，啟動(dòng)子組件與禽外源 性編碼序列，即在禽體內(nèi)通?；蛱烊徊淮嬖诘木幋a序列連接。通常，外源核苷 酸序列整合入禽的基因組中。在一個(gè)尤其有用的實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子組件主要在禽類輸卵管(如管狀腺體細(xì)胞)中發(fā)揮功能或表達(dá)。例如，所述啟動(dòng)子組 件可為輸卵管特異性啟動(dòng)子。例如，所述啟動(dòng)子組件可為禽類卵類粘蛋白啟動(dòng) 子、禽類卵清蛋白啟動(dòng)子、禽類溶菌酶啟動(dòng)子和禽類卵抑制劑組件(即伴清蛋 白啟動(dòng)子組件)之一。
發(fā)明人已顯示SIN載體對于增加在禽輸卵管中外源蛋白的表達(dá)量尤其有 用。當(dāng)SIN載體也為SC負(fù)載體時(shí)(即載體不含具有功能性啟動(dòng)子的可選擇標(biāo)記 盒)，這種效應(yīng)可進(jìn)一步增強(qiáng)。
本發(fā)明還包括制造本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因禽類的方法以及利用本發(fā)明轉(zhuǎn)基因禽類 產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因禽類基因組的核苷酸序列
中包含載體，所述載體是SIN載體和SC負(fù)載體中的至少一種。通常，所述核
苷酸序列包含與外源性編碼序列連接的啟動(dòng)子組件。
在一個(gè)有用的實(shí)施方式中，外源性編碼序列在禽輸卵管細(xì)胞中表達(dá)，并從 輸卵管細(xì)胞中分泌。例如，外源性編碼序列可在管狀腺體細(xì)胞中表達(dá)。在一個(gè) 實(shí)施方式中，外源蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因禽類生出的硬殼卵中沉積。在一個(gè)實(shí)施方式 中，外源蛋白質(zhì)為人蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，外源蛋白質(zhì)為治療性蛋白，如 細(xì)胞因子。
在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因禽類在其基因組中包含外源核苷酸序列，其具
有sc負(fù)載體以及與編碼外源蛋白質(zhì)的外源性編碼序列相連的啟動(dòng)子組件。在 一個(gè)實(shí)施方式中，SC負(fù)載體也為SIN載體。
在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明可使用禽白血病毒載體(ALV)，鼠白血病毒 (MLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)和慢病毒載體。
本發(fā)明包含嵌合轉(zhuǎn)基因禽類和完全轉(zhuǎn)基因種系禽類，可通過家禽繁育領(lǐng)域 操作人員理解的種系嵌合體獲得。
本發(fā)明還包括具有與下列編號為1-8的序列相似或相同的核苷酸序列(即 DNA序列)的基因表達(dá)控制區(qū)或啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)尤其有用的實(shí)施方式 中，從片段的上部到下部以單鏈DNA分子中出現(xiàn)的5，-3，線性順序列出。例如， 序列1中3.5 kb OV片段的3'末端可共價(jià)連接于5' UTR-5'部分的5'末端，5' UTR-5'部分的3'末端可共價(jià)連接于5'UTR-3'部分的5'末端。然而，本發(fā)明不 限于片段的任意特定序列，并且在片段間可出現(xiàn)干擾序列。1. 3.5kbOV片段(包括DHSI， II和III) 5'UTR-5，部分(來自外顯子L) 5'UTR-3'部分(來自外顯子1);
2. 3.5kbOV片段(包括DHSI， II和III) 5'UTR-5，部分(來自外顯子L) 內(nèi)含子A
5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 3' UTR;
3. 3.5kbOV片段(包括DHSI， II和III) 5'UTR-5，部分(來自外顯子L) 內(nèi)含子A
5'UTR-3'部分(來自外顯子1);
4. 3.5kbOV片段(包含DHSI， II和III) 5' UTR-5，部分(來自外顯子L)
5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 3' UTR;
5. 3.5kbOV片段(包含DHSI， II和III) 5' UTR-5'部分(來自外顯子L) 內(nèi)含子A
5' UTR-3'部分(來自外顯子1) 3'UTR/DHSA(SEQIDNO: 22的13576-15163 bp)
6. 3.5kbOV片段(包含DHSI， II和III) 5' UTR-5'部分(來自外顯子L) 5'UTR-3'部分(來自外顯子1)3'UTR / DHS A(SEQ IDNO:22的13576-15163bp)
7. 3.5kbOV片段(包含DHSI， II禾口 III) 5'UTR-5'部分(來自外顯子L) 內(nèi)含子A
5'UTR-3，部分(來自外顯子1) 部分3'UTR
RRE(Rev應(yīng)答元件)圖9a
8. ALV CTE(圖9 b)插入3.5 kb OV片段5， 3.5kbOV片段(包含DHSI， II和III) 5'UTR-5，部分(來自外顯子L)
內(nèi)含子A
5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 部分3' UTR;
本文公開的特定卵清蛋白構(gòu)建物(如上述構(gòu)建物l-8)元件的坐標(biāo)(位置)如下 文SEQIDNO: 22中16051 bp卵清蛋白DNA區(qū)段所示
3.5 kb OV片段(包含DHS I， II和III):圖8中3199開始6659結(jié)束(SEQ ID NO: 22);
1.4 kb OV片段(包含DHS I和II):圖8中5209開始6659結(jié)束(SEQ ID NO:
22);
3.8 kb OV片段:圖8中2863開始6659結(jié)束(SEQ ID NO: 22); 5.2kbOV片段:圖8中1463開始6659結(jié)束(SEQ ID NO: 22);
5' UTR-5，部分(來自外顯子L):圖8中6659開始6705結(jié)束(SEQ ID NO: 22); 5' UTR-3，部分(來自外顯子l):圖8中8295開始8311結(jié)束(SEQ ID NO: 22); 3' UTR:圖8中13576開始14209結(jié)束(SEQ ID NO: 22); 部分3' UTR: 13576開始13996結(jié)束(SEQ ID NO: 22);內(nèi)含子A:圖8中6706開始8294結(jié)束(SEQIDNO: 22); 內(nèi)含子E:圖8中10010開始10968結(jié)束(SEQIDNO: 22);
外顯子L:圖8中6659開始6705結(jié)束(SEQ ID NO: 22); 外顯子l:圖8中8295開始8478結(jié)束(SEQIDNO: 22); 外顯子2:圖8中8731開始8781結(jié)束(SEQIDNO: 22); 外顯子3:圖8中9363開始9491結(jié)束(SEQIDNO: 22); 外顯子4:圖8中9892開始10009結(jié)束(SEQIDNO: 22); 外顯子5:圖8中10968開始11110結(jié)束(SEQIDNO: 22); 外顯子6:圖8中11442開始11597結(jié)束(SEQ ID NO: 22); 外顯子7:圖8中13180開始13575結(jié)束(SEQIDNO: 22);
+ 1位點(diǎn):圖8中6659開始6659結(jié)束(SEQ ID NO: 22); ATG:圖8中8312開始8312結(jié)束(SEQIDNO: 22); 聚A:圖8中14204開始14209結(jié)束(SEQ ID NO: 22); TATA:圖8中6627開始6632結(jié)束(SEQ ID NO: 22);
DHSA:圖8中13858開始15163結(jié)束(SEQIDNO: 22); DHS IV:圖8中459開始859結(jié)束(SEQ ID NO: 22); DHS III:圖8中3253開始3559結(jié)束(SEQ ID NO: 22); DHS II:圖8中5629開始6009結(jié)束(SEQ ID NO: 22);及 DHS I:圖8中6359開始6659結(jié)束(SEQ ID NO: 22).
同時(shí)考慮核苷酸序列與本文公開的每一啟動(dòng)子構(gòu)建物，如上文所述那些(即 上述l-8)具有80。/。相同性、85%相同性、90%相同性、91%相同性、92%相同 性、93%相同性、94%相同性、95%相同性、96%相同性、97%相同性、98%相 同性、99%相同性的啟動(dòng)子構(gòu)建物。
本發(fā)明也考慮與上述啟動(dòng)子構(gòu)建物1-8對應(yīng)的啟動(dòng)子構(gòu)建物，其中3.5 kb OV片段替換為3.8 kb OV片段。本發(fā)明也考慮與上述啟動(dòng)子構(gòu)建物1-8對應(yīng)的
12啟動(dòng)子構(gòu)建物，其中3.5kbOV片段替換為5.2kbOV片段。
也考慮其中DHS III從中省略的上述特定重組啟動(dòng)子(即l-8)的啟動(dòng)子構(gòu)建物。
也考慮對應(yīng)上述構(gòu)建物2、 3、 5、 7和8中每一個(gè)的啟動(dòng)子構(gòu)建物，其中內(nèi) 含子A被內(nèi)含子E替換，這將導(dǎo)致外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生水平的提高。內(nèi)含子A和 E具有誘導(dǎo)組蛋白在DNA周圍區(qū)域排列的DNA序列。這種排列為OV基因提 供轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。不意于依附任何特定理論或操作機(jī)制，用內(nèi)含子A替換內(nèi)含子E 提供了優(yōu)選組蛋白間距(即對于內(nèi)含子A的周期為202 bp +/- 5 bp，對于內(nèi)含子 E為196bp+/-5bp)。例如，認(rèn)為組蛋白對DNA的包裹導(dǎo)致DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的 改變，對其進(jìn)行操作能導(dǎo)致負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合位點(diǎn)的優(yōu)選 排列引起轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)。
本發(fā)明還包括本文公開的載體構(gòu)建物，以及其它構(gòu)建物和核苷酸序列，其 核苷酸序列與本文公開的每一載體構(gòu)建物和其它構(gòu)建物以及核苷酸序列具有 80%相同性、85%相同性、90%相同性、91%相同性、92%相同性、93%相同性、 94%相同性、95%相同性、96%相同性、97%相同性、98%相同性、99%相同性。
只要任一本文描述特點(diǎn)的組合包含的特點(diǎn)在上下文中、該說明中以及本領(lǐng) 域一般技術(shù)人員的知識中并非互相不吻合，任何此類組合均包含于本發(fā)明范圍 內(nèi)。
在瀏覽下面的詳細(xì)描述以及下面簡要描述的附圖之后，本發(fā)明的其他目的 和方面將更加明了。
附圖簡述
圖
1 顯示了 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B 載體的環(huán)狀圖。 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B的序列如SEQ ID NO: 1所示。
圖2是轉(zhuǎn)基因鵪鶉卵白中IFNa表達(dá)水平的柱狀圖。在日本鵪鶉胚胎中注射 pALV-SIN-4.0-Lys-IFNa-2B反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒產(chǎn)生G0鵪鵓。
圖 3 顯示了 pSIN-OV-3.5小CTLA4-inv 載體的環(huán)狀圖。 pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv的核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示。圖 4 顯示了
pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc 載體的環(huán)狀圖。 pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO: 20所示。
圖5顯示了 pBS-OM-4.4載體的環(huán)狀圖。pBS-OM-4.4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 23所示。
圖6顯示了 pAVIJCR-A137.91丄2載體的環(huán)狀圖。pAVIJCR-A137.91丄2的 核苷酸序列如SEQ ID NO: 24所示。
圖 7 顯示了 pSIN-1.8-OM-IFNa-2B 質(zhì)粒載體的環(huán)狀圖。 pSIN-1.8-OM-IFNa-2B的核苷酸序列如SEQ ID NO: 21所示。
圖8a-e(SEQIDNO: 22)顯示了雞卵清蛋白基因的一個(gè)區(qū)段。
圖9a(SEQIDNO: 25)顯示了慢病毒的RRE(rev應(yīng)答元件)序列。圖9b(SEQ ID NO: 26)顯示了 ALV CTE(組成型轉(zhuǎn)運(yùn)元件)序列。

圖10a顯示了從示例性逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR(ALV)中刪除片段的示意圖，得到 SIN載體。圖10b(SEQ ID NO: 29)顯示了 10a中LTR的序列。下劃線序列是 刪除的序列。
發(fā)明詳述 定義
本文所用術(shù)語"動(dòng)物"包括所有脊椎動(dòng)物，包括禽類，也可包括人。也可包 括處于所有發(fā)育階段的動(dòng)物，包括胚胎期和胎兒期。
本文所用術(shù)語"抗體"指多克隆和單克隆抗體及其功能片段。抗體包括保有 表位特異性結(jié)合能力的修飾或衍生化抗體變體?？贵w能夠選擇性與靶抗原或表 位結(jié)合。抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人源化和其它嵌 合抗體、單鏈抗體(scFvs)、 Fab片段、F(ab')2片段和二硫鍵連接的Fvs(sdFv) 片段。
本文所用術(shù)語"禽類"指鳥綱分類的任何種、亞種或品系，例如但不限于諸 如雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀、鷹、烏鴉和平胸鳥，包括鴕鳥、 鴯鹋和食火雞等生物。該術(shù)語包括紅原雞(G"http://^ ^^/"力或雞的各種已知品系 (例如，白來杭雞、褐來杭雞、斑紋石雞(Barred-Rock)、蘇賽克斯雞(Sussex)、 新罕布什爾雞、羅德島雞、澳洲黑雞、米諾卡雞、阿木雞(Amrox)、加利福尼亞州灰雞、意大利山鶉色雞)，以及通常以商業(yè)規(guī)模飼養(yǎng)的火雞、雉、鵪鶉、 鴨、鴕鳥和其它家禽的品系。
如在基于或衍生于特定逆轉(zhuǎn)錄病毒或基于特定逆轉(zhuǎn)錄病毒的核苷酸序 列中的術(shù)語"基于"或"衍生于"意思是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因組包含特定逆 轉(zhuǎn)錄病毒基因組核苷酸序列的實(shí)質(zhì)性部分。實(shí)質(zhì)性部分可為特定基因或核
苷酸序列，如編碼gag、 pol和/或env蛋白或其它病毒基因組的結(jié)構(gòu)或功能 核苷酸序列，如編碼LTR的序列或充分完整的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，例如， 逆轉(zhuǎn)錄病毒的大部分(如，多于60%或多于70%或多于80%或多于卯％)或 全部，如本說明書上下文中為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所了解的?；诨蜓苌谀?轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的例子是NL逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(如NLB)，其基于 Cosset等，Journal of Virology(1991)65巻，3388-3394公開的ALV逆轉(zhuǎn)錄病毒。
本文所用術(shù)語"編碼序列"和"編碼區(qū)"指核苷酸序列和核酸序列，包括為合 成RNA、蛋白質(zhì)或RNA或蛋白質(zhì)的任意部分編碼遺傳信息的RNA和DNA。 非天然特定有機(jī)體基因組部分核苷酸序列稱作"外源核苷酸序列"、"異源核苷 酸序列"或"外源核苷酸序列"。"異源性蛋白質(zhì)"是外源、異源或外源核苷酸序列 編碼的蛋白質(zhì)，因此在細(xì)胞中并不常見天然表達(dá)。分離的并被引入相同類型有 機(jī)體(如同種)的核苷酸序列并不認(rèn)為是特定有機(jī)體基因組的天然產(chǎn)生的部分， 因此被認(rèn)為是外源性或異源性的。
本文所用術(shù)語"構(gòu)建物"指線狀或環(huán)狀核苷酸序列，如由分離自天然來源或 化學(xué)合成或其組合的多于一種核苷酸序列片段組裝而成的DNA。
本文所用術(shù)語"互補(bǔ)"指能夠相互形成特異性作用的兩個(gè)核酸分子。在特異 性相互作用中，當(dāng)兩條核酸鏈極性相反時(shí)，核酸一條鏈中的腺嘌呤能與第二條 核酸鏈內(nèi)的胸腺嘧啶形成兩個(gè)氫鍵。同樣的特異性相互作用，當(dāng)兩條核酸鏈極 性相反時(shí)，核酸一條鏈中的鳥嘌呤能與第二條核酸鏈內(nèi)的胞嘧啶形成三個(gè)氫 鍵。如本文提及的互補(bǔ)核酸害了包含修飾堿基，其中修飾的腺嘌呤可與胸腺嘧 啶或修飾的胸腺嘧啶形成氫鍵，修飾的胞嘧啶可與鳥嘌呤或修飾的鳥嘌呤形成 氫鍵。
本文所用術(shù)語"細(xì)胞因子"指任意影響細(xì)胞功能的分泌氨基酸序列，并且時(shí) 調(diào)節(jié)免疫、炎癥或者造血相應(yīng)中細(xì)胞間相互作用的分子。細(xì)胞因子包括但不限
15于單核因子和淋巴因子，不管其產(chǎn)生細(xì)胞。例如，單核因子通常指單核細(xì)胞如 巨噬細(xì)胞和/或單核細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的因子。然而，其它細(xì)胞也可產(chǎn)生單核因子， 如自然殺傷細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，腦星形 膠質(zhì)細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、上皮角質(zhì)形成細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞。淋巴因子通常指 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的因子，包括但不限于白介素-l(IL-l)、白介素-6(IL-6)、白介
素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和腫瘤壞死因子p(TNF-(3)。
本文所用術(shù)語"表達(dá)的"或"表達(dá)"從一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄得到的至少與基因兩條核 酸鏈之一部分互補(bǔ)的RNA核酸分子。本文所用術(shù)語"表達(dá)的"或"表達(dá)"也指將 RNA翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)或肽.
本文所用術(shù)語"表達(dá)載體"指核酸載體，其包含如啟動(dòng)子或啟動(dòng)子組件基因 的表達(dá)控制區(qū)，可操作的連接于至少一個(gè)多肽的核苷酸序列。
本文所用術(shù)語"片段"指例如至少約10、 20、 50、 75、 100、 150、 200、 250、 300、 500、 1000、 2000、 5000、 6,000、 8,000、 10,000、 20,000、 30,000、 40,000、 50,000或60,000個(gè)核苷酸長度的核酸部分，通過PCR或其它本領(lǐng)域熟知多聚 化技術(shù)或通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所了解的重組核酸技術(shù)在宿主細(xì)胞中表達(dá)， 用限制性核酸內(nèi)切酶或機(jī)械切割或酶解，可以為人工構(gòu)建(如化學(xué)合成)或通過 將天然產(chǎn)物切割為多個(gè)片段。本文所用術(shù)語"片段"也指至少如氨基酸序列中約 5、 10、 20、 30、 40、 50、 75、 100、 150、 200、 250、 300、 400、 500、 1000、 2000、 5000、 6,000、 8,000或10,000個(gè)氨基酸部分，該部分來自至少一種蛋白 酶酶解切割天然產(chǎn)生的氨基酸序列，或是本領(lǐng)域熟知化學(xué)方法或重組DNA技 術(shù)(如，天然產(chǎn)生氨基酸序列編碼核苷酸序列部分表達(dá))合成的氨基酸序列的一 部分。"片段"也指一部分，例如，特定核苷酸序列或氨基酸序列的約5%、約 10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90 %、約95%或約99%。
本文中"功能性部分"或"功能性片段"可互換使用，在此指能全部或部分執(zhí) 行全部功能的一部分或片段。例如， 一個(gè)分子的生物學(xué)功能部分指形式全部或 完整分子的生物學(xué)功能的分子的一部分。例如，基因表達(dá)控制區(qū)的一個(gè)功能部 分指生物系統(tǒng)(如啟動(dòng)子)中全部或部分調(diào)節(jié)或控制基因表達(dá)的特定基因表達(dá) (如全部或部分促進(jìn))控制區(qū)域的一個(gè)片段或部分。功能部分可為任意有用的大小。例如，功能片段大小可從約20個(gè)堿基長到特定序列全長減去一個(gè)氨基酸長。在另一實(shí)施例中， 一個(gè)功能性片段的大小可從約50個(gè)堿基長到特定序列全長減去一個(gè)氨基酸長。在另一實(shí)施例中， 一個(gè)功能性片段的大小可從約50
個(gè)堿基長到約20kb長。在另一實(shí)施例中， 一個(gè)功能性片段的大小可從約500個(gè)堿基長到約20kb長。在另一實(shí)施例中， 一個(gè)功能性片段的大小可從約1 kb堿基長到約20kb長。在另一實(shí)施例中， 一個(gè)功能性片段的大小可從約O.l kb堿基長到約10kb長。在另一實(shí)施例中， 一個(gè)功能性片段的大小可從約20個(gè)堿基長到約10kb長。
本文所用術(shù)語"基因表達(dá)控制區(qū)"指與編碼序列連接的部分或全部調(diào)節(jié)編碼序列表達(dá)，如全部或部分調(diào)節(jié)編碼序列轉(zhuǎn)錄，的核苷酸序列?；虮磉_(dá)控制區(qū)可從天然產(chǎn)生的來源分離或者化學(xué)合成，并能被摻入核酸載體使其能在合適的細(xì)胞中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。"基因表達(dá)控制區(qū)"可在位于編碼序列5'末端并能被轉(zhuǎn)錄為mRNA的核酸序列區(qū)域之前，但不僅限于在其之前。
本文中術(shù)語"異源性"、"外源性"和"外源"互換使用，通常指不存在于某種有機(jī)體或細(xì)胞、組織或其它有機(jī)體包含或產(chǎn)生的組件中的生物分子如核酸或蛋白。例如，卵的異源性或外源蛋白質(zhì)指在卵中通常不出現(xiàn)的蛋白。如本文所用涉及核酸如DNA和RNA的術(shù)語"異源性"、"外源性"和"外源"可互換使用，指不作為其出現(xiàn)的染色體、基因組或細(xì)胞的天然發(fā)生的一部分，或者其出現(xiàn)的位置和/或量不同于其天然產(chǎn)生時(shí)的位置和/或量?？蔀榉腔蚪M、染色體或細(xì)胞內(nèi)源性的，被外源性引入基因組、染色體或細(xì)胞的核酸。異源性DNA的例子包括但不限于含基因表達(dá)控制區(qū)的DNA和編碼產(chǎn)物的DNA，例如RNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物。異源性DNA的例子包括但不限于 一旦從禽類或使用中分離的本文中的基因表達(dá)控制區(qū)或啟動(dòng)子，如，在重新引入到禽類基因組后。
本文所用術(shù)語"分離核酸"包含，例如(a)具有天然產(chǎn)生的基因組分子一部分序列的DNA，但不被天然發(fā)生物種基因組分子該部分的至少一個(gè)側(cè)翼序列所包圍；(b)以某種方式摻入載體或真核或原核基因組DNA的核酸，所得載體或基因組DNA與其獲自的天然產(chǎn)生的DNA不同；(c)分離的分子如cDNA、基因組片斷或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)或化學(xué)合成產(chǎn)生的片段，或限制性片段；(d)作為雜合基因一部分的重組核苷酸序列，即編碼融合蛋白的基因以及(e)作為雜合基因一部分的重組核苷酸序列，該雜合序列并非天然產(chǎn)生。本發(fā)明的分離核酸分子包括，例如天然等位基因變體以及通過核苷酸刪除、插入、倒序或取代修飾得到的核酸分子。
本文所用術(shù)語"核酸"指任一線性或順序陣列的核苷酸和核苷，例如cDNA、基因組DNA、 mRNA、 tRNA、寡核苷酸、寡核苷及其衍生物。為了便于討論，非天然產(chǎn)生的核酸在本文中也稱作構(gòu)建物。核酸可包括如表達(dá)、克隆、粘粒合轉(zhuǎn)化載體的細(xì)菌質(zhì)粒載體，如動(dòng)物病毒載體，例如但不限于腺病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒如禽類白血病病毒(ALV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體等及其片段。此外，核酸可為禽類白血病病毒(ALV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體及其片段的LTR。核酸也可包括NL載體，如NLB、 NLD和NLA及片段，以及合成的寡核苷酸如化學(xué)合成的DNA或RNA。核酸可包括修飾的或衍生化的核苷酸和核苷，例如但不限于鹵化核苷酸如但不限于5-溴尿嘧啶，以及衍生化核苷酸如生物素標(biāo)記的核苷酸。
本文所用術(shù)語"載體"和"核酸載體"指天然的或合成的能轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的并不依賴于宿主細(xì)胞基因組或在宿主細(xì)胞基因組內(nèi)獨(dú)立復(fù)制的單鏈或雙鏈質(zhì)粒或病毒核酸分子?；谳d體核苷酸序列選用合適的限制性酶可將環(huán)狀雙鏈載體線性化。通過用限制性酶切割載體并將需要的片段連接可將核酸插入載體。
術(shù)語"操作性連接"指配置所述組件以便行使其普通功能的元件安排。操作性連接于編碼序列的基因表達(dá)控制區(qū)或啟動(dòng)子(如啟動(dòng)子組件)能夠?qū)幋a序列進(jìn)行表達(dá)?？刂菩蛄锌刹槐嘏c編碼序列毗連，只要它們可發(fā)揮功能指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。因此，例如，間插非翻譯的轉(zhuǎn)錄序列存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列之間時(shí)，仍可認(rèn)為該啟動(dòng)子序列與該編碼序列"操作性連接"。
本文所用術(shù)語"輸卵管特異性啟動(dòng)子"指功能性的啟動(dòng)子和啟動(dòng)子組件，即為一個(gè)編碼序列轉(zhuǎn)錄提供，在很大程度上，例如，主要(g卩，在動(dòng)物中有特定啟動(dòng)子類型產(chǎn)生的超過50%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在輸卵管細(xì)胞中)或僅僅在禽類輸卵管細(xì)胞中。輸卵管特異性啟動(dòng)子的例子包括，卵清蛋白啟動(dòng)子、卵類粘蛋白啟動(dòng)子、卵抑制劑啟動(dòng)子、溶菌酶啟動(dòng)子和卵運(yùn)鐵蛋白啟動(dòng)子，以及這些啟動(dòng)子的功能性部分，如啟動(dòng)子組件。如在"％相同性"中使用的術(shù)語"百分比序列相同性"和"百分比相同性"，以及如"％同源性"、"百分比序列相似性"中使用的術(shù)語"百分比序列同源性"、"百分
比同源性"，每一術(shù)語均指利用Karlin和Attschu1(1990) Proc. Natl. Acad. Sci.87:2264-2268中，Karlin和Attschu1(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873-5877修
飾的算法測定的兩條核酸序列和兩條氨基酸序列的序列配對程度。此類算法并入Attschul等(1990) T. Mol. Biol. Ql5:403-410中的NBLAST和XBLAST程序。NBLAST程序執(zhí)行BLAST核苷酸搜索，分?jǐn)?shù)=100，字長=12，以獲取與本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列同源性。XBLAST執(zhí)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，分?jǐn)?shù)=50，字長=3，以獲取與參考氨基酸序列的氨基酸序列同源性。為了獲取用于比較目的的缺口比對，使用如Attschul等(1997) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402所述的缺口 。當(dāng)使用BLAST和缺口 BLAST程序時(shí)，使用每個(gè)程序(如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。其它參數(shù)、程序和默認(rèn)設(shè)置也適于但不限于包含核苷酸或氨基酸序列比較的英國人類基因組作圖計(jì)劃資源中心(U.K.Human GenomeMapping Project Resource Center)的GCG-序列分析包。
術(shù)語"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核苷酸序列"和"核酸序列"在本文中可互換
使用，包括但不限于編碼序列，即當(dāng)置于合適調(diào)節(jié)或控制序列的控制之下能
在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯為多肽的多核苷酸或核酸序列；控制序列，如翻譯起
始和終止密碼子，啟動(dòng)子序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，聚腺苷酸化信號，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，上游或下游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，增強(qiáng)子，沉默子，轉(zhuǎn)錄因
子結(jié)合的DNA序列，結(jié)合后從而或正向(誘導(dǎo))或負(fù)向(抑制)基因啟動(dòng)子的活性。本文所述術(shù)語并不暗示關(guān)于長度和合成來源的限制。
本文所用術(shù)語"多肽"和"蛋白質(zhì)"指三個(gè)或多個(gè)氨基酸通過肽鍵連接以順序陣列組成的氨基酸聚合物。術(shù)語"多肽"包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)類似物、寡肽等。術(shù)語"多肽"包括如上文定義的核酸編碼的、重組技術(shù)生產(chǎn)的(如分離自轉(zhuǎn)基因禽類)或者合成的多肽。術(shù)語"多肽"還指如上文定義的化學(xué)修飾的氨基酸或與標(biāo)記配體共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的氨基酸。
本文所用術(shù)語"啟動(dòng)子"指在禽類細(xì)胞中用于起始R N A聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的DNA序列。"啟動(dòng)子組件"本身或與其它DNA序列組合影響或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的DNA序。本文公開和要求的特異性啟動(dòng)子組件如卵清蛋白啟動(dòng)子組件、卵類粘蛋白啟動(dòng)子組件和溶菌酶啟動(dòng)子組件及其它啟動(dòng)子和啟動(dòng)子組件并不描述特異性啟動(dòng)子序列，而它們包括用于影響或利于編碼序列轉(zhuǎn)錄的各自啟動(dòng)子的任意序列或序列片段。例如，卵類粘蛋白啟動(dòng)子組件包括但不限于如2007年5月17
日公開的美國公開號11/649,543中約1.8 kb、約3.9 kb和約10 kb卵類粘蛋白啟動(dòng)子，將其整體納入本文作參考。"啟動(dòng)子組件"也可包含起始RNA轉(zhuǎn)錄的重排的基因表達(dá)控制區(qū)以及含有起始RNA轉(zhuǎn)錄的天然產(chǎn)生的DNA序列/或合成DNA序列的雜合DNA分子。
本文所用"重組核酸"和"重組DNA"指至少兩種真核或原核細(xì)胞中不存在的核酸序列的組合。核酸序列也包括但不限于核酸載體、基因表達(dá)調(diào)控元件、復(fù)制起始點(diǎn)，表達(dá)時(shí)賦予抗生素抗性的基因序列、蛋白編碼序列等。術(shù)語"重組多肽"意味包含重組技術(shù)產(chǎn)生的多肽，其位置、純度或結(jié)構(gòu)與天然產(chǎn)生的多肽不同。通常，此類重組多肽出現(xiàn)在細(xì)胞時(shí)其量與通常天然觀察到的不同。
如本文所用術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"包括可控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它元件。
"SC負(fù)載體"是不包含具有功能性啟動(dòng)子的可選擇或可篩選盒標(biāo)記物的載體。所述啟動(dòng)子可全部或部分刪除或通過插入核苷酸序列使其失活。選擇性盒包括但不限于如產(chǎn)生新霉素抗性的抗生素抗性DNA序列以及如GFP或lacZ的可選擇標(biāo)記物的DNA序列。
"SIN載體"是自失活載體。具體說，SIN載體是具有改變的基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，當(dāng)整合入靶細(xì)胞(如禽類胚胎細(xì)胞)的基因組DNA時(shí)，整合的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的5，LTR不能行使啟動(dòng)子的功能。例如，可刪除或改變部分或全部造成逆轉(zhuǎn)錄病毒載體5'LTR的U3區(qū)域整合的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體核苷酸序列以減少或消除5'LTR的啟動(dòng)子活性。如本領(lǐng)域所理解的那樣，在某些實(shí)施例中，從5' LTR的U3中刪除CAAT盒和/或TAATA盒可得到SIN載體。
"SIN/SC負(fù)載體"是一種載體，即逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，既是SIN載體又是SC負(fù)載體。
本文所用術(shù)語"正義鏈"指來自基因組DNA的單鏈DNA分子，可被轉(zhuǎn)錄為RNA并翻譯為基因的天然多肽產(chǎn)物。本文所用術(shù)語"反義鏈"指來自基因組DNA的單鏈DNA分子并與基因的正義鏈互補(bǔ)。"治療性蛋白質(zhì)"或"藥學(xué)蛋白質(zhì)"指全部或部分組成藥物的物質(zhì)。具體說，"治療性蛋白質(zhì)"和"藥學(xué)蛋白質(zhì)"包含全部或部分組成藥物的氨基酸序列。
本文所用術(shù)語"轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列"和"基因表達(dá)控制區(qū)"和"啟動(dòng)子組件"指與一個(gè)核酸序列相連接的調(diào)節(jié)編碼序列轉(zhuǎn)錄表達(dá)的核苷酸序列。示例性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包括增強(qiáng)子元件、激素效應(yīng)元件、類固醇效應(yīng)元件、負(fù)調(diào)控元件等?？蓪?轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列"分離并摻入載體核酸以調(diào)節(jié)合適細(xì)胞中載體DNA部分的轉(zhuǎn)錄。
"轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列"可位于，但不限于，可被轉(zhuǎn)錄為mRNA的蛋白編碼序列5'區(qū)域的核酸序列區(qū)域之前。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域也可在蛋白編碼區(qū)內(nèi)，在鑒定為"內(nèi)含子"區(qū)域的基因區(qū)域內(nèi)或在核酸區(qū)域的核酸序列區(qū)域內(nèi)。
本文所用術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"指將核酸插入宿主的過程。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知許多利于將核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)入原核或真核有機(jī)體的方法。這些方法涉及許多技術(shù)，如用高濃度鹽處理細(xì)胞例如但不限于鈣或鎂鹽，電場、去污劑或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，使宿主細(xì)胞處于感受態(tài)以攝取核酸分子。
如本文所用"轉(zhuǎn)基因動(dòng)物"是任意非人類動(dòng)物，如禽類，包括雞，其中禽類的一種或多種細(xì)胞可包含通過人工干預(yù)引進(jìn)的異源核酸，如通過本領(lǐng)域所知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)(參見例如，2007年10月18日公開的美國專利公開號2007/0243165，其公開內(nèi)容整體納入本文作參考)，包括本文所公開的那些技術(shù)。通過慎重的遺傳操作，如通過顯微注射或用重組病毒感染將核酸引入細(xì)胞的前體，從而將核酸引入動(dòng)物。術(shù)語遺傳操作不包括傳統(tǒng)的雜交育種或體外受精，而是直接導(dǎo)入重組DNA分子。該分子可在染色體內(nèi)整合或是染色體外復(fù)制的DNA。在典型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，轉(zhuǎn)基因可引起細(xì)胞表達(dá)靶蛋白或多肽的重組形式。本文所用術(shù)語"嵌合動(dòng)物"或"鑲嵌動(dòng)物"指表達(dá)轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，或部分但非全部細(xì)胞表達(dá)重組核苷酸序列的動(dòng)物。種系嵌合動(dòng)物在種系中包含轉(zhuǎn)基因并使子代動(dòng)物的多數(shù)或全部細(xì)胞包含轉(zhuǎn)基因。
本文所用術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"指對被引入的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞而言部分或全部異源的即外來的核酸序列(編碼例如人蛋白質(zhì))，但被設(shè)計(jì)插入或插入動(dòng)物基因組以這樣的方式改變其插入的細(xì)胞基因組(如，插入到于天然基因位置不同的位點(diǎn)或其插入引起敲除)。根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因包括本發(fā)明的含有利于外源蛋白質(zhì)
在禽類體內(nèi)(如禽類輸卵管中)產(chǎn)生的序列的載體(如SIN載體)。
21本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知本發(fā)明中用于核酸和蛋白分離和鑒定的技術(shù)，并 且可參考標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和生物化學(xué)手冊以選擇使用合適的實(shí)驗(yàn)方案，而不選
用不合適的實(shí)驗(yàn)方法。參見例如，Sambrook等，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手 冊》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),第二斑，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor),其內(nèi)容整體納入本文作參考。
腔
本文使用縮寫包括aa，氨基酸；bp，堿基對；cDNA，與RNA互補(bǔ)的DNA; nt，核苷酸；kb，千堿基對；pg，微克；ml，毫升；ng，納克。
薪述
根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)和使用的SIN載體能夠減少或消除對轉(zhuǎn)基因禽類體內(nèi)使用
的感興趣的啟動(dòng)子干擾的啟動(dòng)子。在尤其有用的實(shí)施方式中，感興趣的啟動(dòng)子 (即啟動(dòng)子組件)優(yōu)選在輸卵管細(xì)胞或輸卵管組織中表達(dá)其基因產(chǎn)物，如輸卵管 特異性啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子(如啟動(dòng)子組件)的例子包括但不限于，卵清蛋白、 溶菌酶、伴清蛋白(g卩卵運(yùn)鐵蛋白)、卵類粘蛋白、卵粘蛋白和/或卵抑制劑基因 表達(dá)控制區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)域的功能部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，感興趣的啟動(dòng)子是 一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的組合或融合，或者一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子，如卵清蛋白、溶菌 酶、伴清蛋白(即卵運(yùn)鐵蛋白)、卵類粘蛋白、卵粘蛋白和/或卵抑制劑啟動(dòng)子與
其它啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段如病毒啟動(dòng)子(如LTR啟動(dòng)子)的組合或融合。
已顯示SIN載體與輸卵管特異性啟動(dòng)子一起尤其有用。不希望本發(fā)明局限 于任一特定理論或操作機(jī)理，相信輸卵管特異性啟動(dòng)子很容易受到逆轉(zhuǎn)錄病毒 LTR啟動(dòng)子的影響。因此，SIN載體與禽類輸卵管特異性啟動(dòng)子組合使用時(shí)尤 其有用。
在一個(gè)尤其有用的實(shí)施方式中，例如，通過刪除、插入或轉(zhuǎn)座全部或部分 干擾啟動(dòng)子序列產(chǎn)生了其中的能至少部分抑制與本發(fā)明的輸卵管特異性啟動(dòng) 子可操作連接的編碼序列轉(zhuǎn)錄的干擾啟動(dòng)子(如LTR啟動(dòng)子)被滅活的SIN載 體。例如，圖1中的pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B載體，3'RAV2 LTR的增強(qiáng)子 中有一個(gè)刪除，因此如本領(lǐng)域所理解的，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒區(qū)域整合時(shí)，5'LTR失活。LTR刪除的詳細(xì)圖解參見圖10。
在本發(fā)明的一個(gè)有用的實(shí)施方式中，使用同時(shí)也是SC負(fù)載體的SIN載體 產(chǎn)生SIN/SC負(fù)載體。SC負(fù)載體和SIN載體的組合得到的載體與僅為SIN載 體或僅為SC負(fù)載體相比，充分減少了啟動(dòng)子干擾的量。例如，如本文實(shí)施例 部分公開的pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B及其它SIN載體也缺少抗生素抗性標(biāo) 記，使其同時(shí)成為SC負(fù)載體和SIN載體。
考慮將SIN載體、SC負(fù)載體和SIN/SC負(fù)載體依照本發(fā)明用于雞、鵪鶉和 火雞等任何有用的禽類以產(chǎn)生包括種系嵌合體在內(nèi)的嵌合體及采用如本領(lǐng)域 一般技術(shù)人員已知的繁殖技術(shù)產(chǎn)生的子代禽類。此外，與完全相同的非SC負(fù) 載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類相比，也關(guān)注SC負(fù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 (它是一個(gè)非SIN載體)也引起轉(zhuǎn)基因禽類產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)數(shù)量上的增多或增 加。
不希望本發(fā)明局限于任一特定理論或操作機(jī)理，相信缺少可選擇標(biāo)記物盒 減少了啟動(dòng)子元件如增強(qiáng)子的出現(xiàn),否則這些啟動(dòng)子元件順式以及很接近禽類 輸卵管細(xì)胞中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)所用的啟動(dòng)子(如輸卵管特異性啟動(dòng)子)。這種很 接近允許標(biāo)記物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件對感興趣的啟動(dòng)子即用于產(chǎn)生外源蛋白 質(zhì)的啟動(dòng)子進(jìn)行干擾。然而，本發(fā)明關(guān)注，可將標(biāo)記物基因編碼序列，例如但 不限于，新霉素抗性編碼序列和(3內(nèi)酰胺酶編碼序列可操作的連接于一個(gè)啟動(dòng) 子(第二啟動(dòng)子)，該啟動(dòng)子不對在禽類輸卵管細(xì)胞用于產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的啟動(dòng) 子(即第一啟動(dòng)子)產(chǎn)生干擾。例如，關(guān)注當(dāng)標(biāo)記物啟動(dòng)子和感興趣的啟動(dòng)子是 相同或相似啟動(dòng)子時(shí)，可將選擇性盒造成的影響降至最小或者消除。例如，選 擇性連接于標(biāo)記物基因編碼序列的第二卵清蛋白啟動(dòng)子可不影響用于在禽類 輸卵管細(xì)胞中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的第一卵清蛋白啟動(dòng)子。
本發(fā)明關(guān)注在禽類表達(dá)外源蛋白質(zhì)的本發(fā)明的載體中任何有用的輸卵管特 異性啟動(dòng)子和輸卵管特異性啟動(dòng)子片段的使用。例如，2005年1月31日提交 的美國專利公開號2005/0176047，其公開內(nèi)容整體納入本文作參考，以及2007 年1月26日提交的美國專利公開號2007/0124829，其公開內(nèi)容整體納入本文 作參考，以及2003年11月11日公開的美國專利公開號2006/0130170，其公開 內(nèi)容整體納入本文作參考，所公開的啟動(dòng)子和啟動(dòng)子的有用(如功能性)片段與SIN載體和SC負(fù)載體和SIN/SC負(fù)載體根據(jù)本發(fā)明的連接使用受到關(guān)注。 本發(fā)明也考慮根據(jù)本發(fā)明用作感興趣啟動(dòng)子的其它啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄功能部
分(如啟動(dòng)子組件)，如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、
卩-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(如雞P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)、鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子、小
鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子。
本發(fā)明也包括多種受到關(guān)注的用于在轉(zhuǎn)基因禽類中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的卵清
蛋白啟動(dòng)子組件?？紤]將本文公開的每一種啟動(dòng)子用于如本發(fā)明所述的載體。 下文顯示了含重組卵清蛋白DNA的本發(fā)明載體的例子。從片段的上部到
下部以單鏈DNA分子中出現(xiàn)的5'-3'線性順序列出片段。例如，序列1中3.5kb
OV片段的3'末端可共價(jià)連接于5'UTR-5'部分的5'末端，以及5'UTR-5'部分
的3'末端將共價(jià)連接于5' UTR-3'部分的5'末端。
1. pSIN-OV-3.5-CSI
3.5 kb OV片段(包括DHS I、 II和III) 5'UTR-5，部分(來自外顯子L) 5'UTR-3'部分(來自外顯子1)
2. pSIN-OV-3.5-Int- CSI -inv
3.5 kb OV片段(包括DHS I、 II和III) 5'UTR-5'部分(來自外顯子L) 內(nèi)含子A
5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 3'UTR
3. pSIN隱OV-3.5-Int-CSI
3.5 kb OV片段(包括DHS I、 II和III)
5'UTR-5'部分(來自外顯子L)
內(nèi)含子A
5'UTR-3，部分(來自外顯子1)
244. pSIN-OV-3.5-CSI -UTR-inv
3.5 kb OV片段(包括DHS I、 II和III) 5' UTR-5，部分(來自外顯子L) 5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 3'UTR
5. pSIN-OV-3.5-Int-CSI -LUTR-inv
3.5 kb OV片段(包括DHS I、 II和III)
5'UTR-5，部分(來自外顯子L)
內(nèi)含子A
5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 3'UTR/DHSA(圖8 13576-15163 bp);
6. pSIN-OV-3.5-CSI -LUTR-inv
3.5 kb OV片段(包括DHS I、 II和III) 5'UTR-5，部分(來自外顯子L) 5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 3'UTR/DHSA(圖8 13576-15163 bp);
7. pSIN-OV-3.5-Int-CSI -RRE
3.5 kb OV片段(包括DHS I、 II和III) 5'UTR-5，部分(來自外顯子L) 內(nèi)含子A
5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 部分3' UTR
RRE(Rev效應(yīng)元件)圖9a
構(gòu)建物7包括允許未剪接的RNA基因組轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)的RRE，從而增強(qiáng)完 整逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的包裝。RRE僅在Rev蛋白質(zhì)存在時(shí)具有活性。在逆轉(zhuǎn)錄病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的過程中，Rev活性以編碼Rev DNA、 RNA和/或Rev蛋白質(zhì)的 形式提供，這些形式是為人所知并且市售的(如英杰公司(Invitrogen， Inc.))。因 此內(nèi)含子在病毒顆粒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因禽類的基因組包含的轉(zhuǎn)基因中出現(xiàn)(rev蛋白 質(zhì)不在轉(zhuǎn)基因禽類的細(xì)胞中出現(xiàn))。因此RNA應(yīng)該在產(chǎn)卵雞的輸卵管細(xì)胞中剪 接，和具有相同無內(nèi)含子轉(zhuǎn)基因的相同轉(zhuǎn)基因禽類相比，蛋白表達(dá)水平升高。
8.pSIN-CTE-OV-3.5-Int-CSI
ALV CTE(圖9b)插入5， of 3.5 kb OV片段
3.5 kb OV片段(包括DHS I、 II和III)
5' UTR-5，部分(來自外顯子L)
內(nèi)含子A
5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 部分3' UTR
本申請其它部分描述了上述8個(gè)載體一些元件的位置(坐標(biāo))。例如，上文 概述部分描述了來自卵清蛋白核苷酸序列的序列的位置。CSI指感興趣的編碼 序列，即，期望在轉(zhuǎn)基因禽類輸卵管中表達(dá)的蛋白的編碼核苷酸序列。
用于本發(fā)明的SIN載體、SIN/SC負(fù)載體和SC負(fù)載體包括以下載體，例如， 禽類白血病/造白細(xì)胞組織增生病毒(ALV)，例如但不限于RAV-O、 RAV-l、 RAV-2;禽類肉瘤病毒(ASV);禽類肉瘤/急性白血病病毒(ASLV)，包括但不限 于，勞氏肉瘤病毒(RSV);弗吉納米肉瘤病毒(FSV);禽類成髓細(xì)胞血癥病毒 (AMV);禽類骨髓成紅血細(xì)胞增多癥病毒(AEV);禽類髓細(xì)胞瘤病病毒(MCV)， 例如但不限于，MC29;網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(REV)，例如但不限于，脾壞死 病毒(SNV)。本發(fā)明也關(guān)注其它有用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括但不限于，基于鼠 白血病病毒(MLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、莫羅尼鼠肉瘤病毒(MMSV)、莫洛尼鼠 白血病病毒(MMLV)和慢病毒(如，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員理解的改變?yōu)镾IN載 體、SIN/SC負(fù)載體或SC負(fù)載體的人體免疫缺陷病毒(HIV)、貓免疫缺陷病毒 (FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿免疫缺陷病毒(SIV)。
在一個(gè)非常具體的實(shí)施方式中，JofVirology(1991)第65巻，第6期，第3388-3394頁(其公開內(nèi)容整體納入本文作參考)公開的修飾的ALV載體的5' LTR的一部分缺失從而產(chǎn)生SIN載體。具體說，SEQ ID NO:29所示基于ALV 載體的LTR序列缺失核苷酸1-173。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可測定用于從其它可 用于禽類轉(zhuǎn)基因的載體產(chǎn)生的SIN載體的5'LTR序列的特定缺失。
在一個(gè)尤其有用的實(shí)施方式中，本發(fā)明用于在轉(zhuǎn)基因禽類根據(jù)本發(fā)明如雞
的輸卵管內(nèi)產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)。按照本發(fā)明生產(chǎn)的示范性蛋白質(zhì)包括但不限 于紅細(xì)胞生成素、GM-CSF、干擾素P、融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白、生 長激素、細(xì)胞因子、結(jié)構(gòu)蛋白(structural)、干擾素、溶菌酶、(5-酪蛋白、白蛋 白、a-l抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、膠原、因子VIII、因子IX、因子X(等)、 血纖蛋白原、乳鐵蛋白、蛋白C、組織型纖溶酶原激活物(tPA)、生長激素和糜 蛋白酶、免疫球蛋白、抗體、免疫毒素、因子VIII、 p-結(jié)構(gòu)域缺失的因子vin、 因子VIIa、因子IX，抗凝劑；水蛭素、阿替普酶、tpa、瑞替普酶、tpa、 tpa-5 個(gè)結(jié)構(gòu)域中缺失3個(gè)、胰島素、賴脯胰島素、速效胰島素、甘精胰島素、長效 胰島素類似物、高血糖素、tsh、促濾泡素-(3、 fsh、 pdgh、 inf-P、 inf-al、 ifn-a2、 inf-p、 inf-卩l(xiāng)b、 ifn-卩l(xiāng)a、 ifn-y、 ifn-ylb、 il-2、 il-ll、 hbsag、 ospa、鏈道酶-a脫 氧核糖核酸酶、P葡糖腦苷脂酶、tnf-cu il-2-白喉毒素融合蛋白、tnfr-lgg片段 融合蛋白拉羅尼酶、DNA酶、阿法賽特(alefacept)、托西莫單抗、鼠單抗(murine mab)、阿侖單抗、拉布立酶、阿加糖酶p (agalsidase beta)、特立帕肽、甲狀旁 腺激素衍生物、阿達(dá)木單抗(lggl)、阿那白滯素、奈西立肽(nesiritide)、人b-型 利鈉肽(hbnp)、集落刺激因子、培維索孟、人生長激素受體拮抗劑、重組活化 蛋白c、奧馬珠單抗(omalizumab)、免疫球蛋白e(lge)阻斷物、替伊莫單抗、 ACTH、高血糖素、生長抑素、生長激素、胸腺素、甲狀旁腺激素、色素激素、 生長調(diào)節(jié)素、黃體生成素、絨毛膜促性腺素、下丘腦釋放因子、依那西普、抗 利尿激素、促乳素和促甲狀腺激素、免疫球蛋白多肽、免疫球蛋白多肽D區(qū)、 免疫球蛋白多肽J區(qū)、免疫球蛋白多肽C區(qū)、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重 鏈、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)、免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和接頭肽。利用本發(fā)明的 方法、載體和啟動(dòng)子產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)中的每一種以及其它蛋白質(zhì)也在關(guān)注范圍 內(nèi)。
下列實(shí)施例將以圖解的方式進(jìn)一步展示本發(fā)明，但不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明。本申請中所有的參考文獻(xiàn)、公開專利和引用專利均全部納入本文作參考。 實(shí)施例1
產(chǎn)生pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B
構(gòu)建載體pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B(圖1所示)并示于圖1 。 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B的序列如SEQ IDNO:l所示。4.2 Kb溶菌酶啟動(dòng)子 跨越SEQ ID NO:l中核苷酸4810-9008。溶菌酶信號肽編碼序列跨越SEQ ID NO:l中核苷酸卯37-卯90。干擾素a 2b編碼序列跨越SEQ ID NO:l中核苷酸 9091-9585。其它序列的組件包括跨越SEQIDNO: 1中核苷酸4000-4345和核 苷酸725-897的LTR。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員了解多種構(gòu)建pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B的方法。然 而，下列被認(rèn)為是制造載體的最有用的方法使用引物 ATGCGCGCATTGGTAATTGATCGGCTGG(弓I物ALV-SIN-1 ， SEQ ID NO:2)和
A AACGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCA(弓I物ALV-SIN-2， SEQ ID NO:3) 通過PCR擴(kuò)增pNLB-CMV-IFN-a2B的3427 bp區(qū)域(披露于2005年6月24日 提交的美國專利申請?zhí)?1/167,052，其內(nèi)容整體納入本文作參考)。用BssHII 和Not I消化產(chǎn)物得到3428 bp片段，該片段可通過凝膠純化分離。使用引物
ATTACCAGT( 弓| 物 ALV-SIN-3 ， SEQ ID NO:4) 和 ATACGCGTATTCCCTAACGATCACGTCG(弓I物ALV-SIN-4， SEQ ID NO:5)通 過PCR擴(kuò)增pNLB-CMV-IFN-a2B的1436 bp區(qū)域。用Not I和Mlu I消化所得 產(chǎn)物得到1438 bp片段，該片段可通過凝膠純化分離。用BssHII消化含BssHII 填充片段的Bluescript II SK載體得到2788 bp的線性化Bluescript載體，將其 凝膠純化然后與3428 bp和1438 bp PCR產(chǎn)物連接得到JCR.A108.49.5.24。
用Hind III消化JCR.A108.49.5.24,通過連接將得到的6823 bp片段環(huán)化得 到JCR.A108.76.1.1。
用引物CTGAAGTGTAAGGAATGTAAG(弓I物ALV-SIN-5 ， SEQ ID NO:6) 禾卩GCGCGTCTCATCCCCCTCCCTATGCAAAAG(弓I物ALV-SIN-6， SEQ IDNO:7)通過PCR擴(kuò)增JCR,A108.76丄1的1175 bp區(qū)域，用Blp I和Esp31消化 所得片段得到1030 bp片段，該片段可通過凝膠純化分離。用引物 GGGCGTCTCAGGGACGGATTGGACGAACCACTGAATT(弓I物ALV-SIN-7 ， SEQ ID N0:8)禾口 TTAGTGCTTTACGGCACCTC(弓|物ALV-SIN-8， SEQ ID NO:9)通過PCR擴(kuò)增JCR.A108.76.1.1的660 bp的區(qū)域并用Esp3I和DraIII消 化得到596 bp片段，該片段可通過凝膠純化分離。用DraIII和Blp I消化 JCR.A108.76丄1并將5024 bp線性載體連接到1030和596 bp的PCR片段上產(chǎn) 生pALV隱SIN。
用BamHI消化pALV-SIN并通過凝膠純化分離4795 bp的線性載體。用引 物
GACGGATCCGATACCGTCCCTATTTTTGTGTTTGCTTC(
弓l 物
物ALV-SIN-10， SEQ ID NO: 1 l)通過PCR擴(kuò)增JCR. 115.93.1.2的4815 bp區(qū)域(披 露于2007年1月26日提交的美國專利申請?zhí)?007/0124829)并用BamHI消化。 將所得 4802 片段連接到 795 bp 線性 pALV-SIN 產(chǎn)生 pALV-SIN-4.0-Lys-IFNa-2B 。
實(shí)施例2
用pALV-SIN-4.2-Lvs-IFNa-2B產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鵪鵓
2007年4月5日公開的名為《快速制備高滴度病毒》(Rapid Production of High Titer Virus)的美國專利公開號2007/0077650公開了在成纖維細(xì)胞中制備 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，該公開內(nèi)容整體納入本文作參考。
基本按照美國專利號5,897,998(其公開內(nèi)容整體納入本文作參考)公開的 Speksnijder步驟將受精日本鵪鶉卵開窗。80只卵的每只卵的胚盤下腔注射7 微升(總共約7xl04個(gè)病毒顆粒)pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。因?yàn)?pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B中未使用可選擇標(biāo)記物，病毒顆粒的濃度根據(jù)過去 的病毒顆粒生產(chǎn)結(jié)果估測，在過去的病毒生產(chǎn)中在載體中使用可選擇盒或標(biāo)記 物以便量化顆粒。注射18天后孵化出16只小鳥，用IFNELISA方法檢測從孵 化后12周的小鳥收集的血清樣品的人IFN水平。未見血清IFN蛋白陽性。
為了鑒定基因組中含有轉(zhuǎn)基因干擾素a2編碼序列的GO鵪鶉，從鳥的血液中提取DNA并在7700序列檢測儀(珀金埃爾默公司(Perkin Elmer))上對DNA 樣品進(jìn)行Taqman⑧分析。用ELISA檢測8只鵪鴉卵的卵白中IFN蛋白質(zhì)的存在情況。在4號鵪鶉的 卵的卵白中發(fā)現(xiàn)顯著水平的IFN。圖2顯示4號鵪鶉卵白中IFN表達(dá)水平的柱 狀圖。4號鵪鶉的卵白每毫升表達(dá)IFN-a-2 0.45 ^g，對于G0禽類來說這是很 好的表達(dá)水平。4號鵪鶉的血中未檢測到尤其顯著的干擾素a2。例如，在某些 情況下重組蛋白質(zhì)出現(xiàn)在血液中時(shí)對于禽類的發(fā)育或健康有害，這樣會(huì)殺死禽 類或?qū)е碌鞍踪|(zhì)生產(chǎn)水平的降低。實(shí)施例3用pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鵪鵓利用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知標(biāo)準(zhǔn)方法，移除pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B 載體中4.2 kb溶菌酶啟動(dòng)子并用與SEQ ID NO:12中核苷酸5363-11863對應(yīng)的 6.5 kb溶菌酶啟動(dòng)子替換，得到pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B。如2007年4月5 日公開的美國專利公開號2007/0077650所述產(chǎn)生新載體 pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。將受精雞卵或日本鵪鶉卵開窗并將約7xl(^個(gè)pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B 轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒注射入每個(gè)卵的胚盤下腔。如實(shí)施例2所述，注射后將卵孵化21或 18天，鑒定基因組中含活性轉(zhuǎn)基因的嵌合鳥。用本領(lǐng)域所知方法即將雄性嵌合 鳥和雌性非轉(zhuǎn)基因鳥交配產(chǎn)生基因組中含轉(zhuǎn)基因的完全轉(zhuǎn)基因Gl鳥。實(shí)施例4產(chǎn)生pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-Fc-Inv載體該載體包含卵清蛋白脫氧核糖核酸酶超敏位點(diǎn)(DHS)I、 II和III，第一外顯 子(外顯子L)，第一內(nèi)含子和插入到與第二外顯子(外顯子l)以及3'非翻譯區(qū) (UTR)在同一閱讀框內(nèi)的CTLA4-Fc融合蛋白編碼序列。將表達(dá)盒反向插入到 禽類白血病病毒(ALV)載體中，該載體通過缺失SEQIDNO: 29中所示ALV LTR序列的1-173位核苷酸造成自失活(SIN)。按照如下步驟構(gòu)建載體用Nae I和Not I切割2007年5月17日公開的美30國專利公開號2007/0113299(其公開內(nèi)容整體納入本文作參考)的實(shí)施例20所公 開的pNLB-3.9-OM-CTLA4-Fc。在Klenow反應(yīng)中填充Not I位點(diǎn)。所得8125 bp 片段經(jīng)凝膠純化、重連接產(chǎn)生pOM-3.9-CTLA4-dSacI。用EcoRI和Kpn I切割pOM-3.9-CTLA4-dSacI并將8115 bp片段凝膠純化。 用引物5，-GCGGAATTCAAAGAAGAAAGCTGAAAAAC-3，(SEQ ID NO:13)和 5，- GCGGGTACCTTCAAATACTACAAGTGAAA-3，(SEQ ID NO:14)通過PCR 從2006年6月15日公開的美國專利公開號2006/0130170公開的BAC 26中擴(kuò) 增雞卵清蛋白基因3'UTR。用Eco RI和Kpn I切割3，UTR PCR產(chǎn)物并凝膠純 化684 bp片段。pOM-3.9-CTLA4-dSacI的8115 bp片段與684 bp 3， UTR PCR 片段連接得到pOM-3.9-CTLA4-OV3'UTR。用引物5，- GGCCTCGAGTCAAGTTCTGAGTAGGTTTTAGTG-3，(SEQ ID NO:15) 和 5，-GCGCGTCTCTGTCTAGAGCAAACAGCAGAACAGTGAAAATG-3 ，(SEQ ID NO:16)-3，以BCA26為模板擴(kuò)增3.5 kb OV啟動(dòng)子區(qū)域、外顯子L、第一內(nèi)含 子和外顯子。用Xho I和Esp3I切割PCR產(chǎn)物并凝膠純化5094 bp產(chǎn)物。用 引 物AG-3' (SEQ ID NO:17)和5，- GGCCCGGGAGTTTTGTCAGAAGATTTGGG-3， (SEQ ID NO:18)以pOM-3.9-CTLA4為模板擴(kuò)增CTLA4-Fc基因的5，部分。用 Esp31和Sacl切割PCR產(chǎn)物并凝膠純化384 bp產(chǎn)物。用Sac I和Xho I切割pOM-3.9-CTLA4-OV3'UTR，將4473 bp產(chǎn)物凝膠純 化并與5094 bp OV PCR片段和384 bp CTLA4-Fc片段連接產(chǎn)生 pOV-3.5-I-CTLA4。用Mfe I和Xho I切割例如2007年5月31日公開的母案美 國專利公開號2007/0124829中實(shí)施例10中的pALV-SIN， Klenow填充并凝膠 純化4911bp片段。用Xhol和BamHI切割pOV-3.5-I-CTLA4, Klenow填充并凝膠純化6957 bp 片段。將該片段與pAVI-SIN4911bp片段連接，因此CTLA4-Fc基因和側(cè)翼表 達(dá)元件在ALV長末端重復(fù)序列的相反起始，產(chǎn)生了 pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv。 參見圖3和SEQ ID NO:19。如果轉(zhuǎn)基因中感興趣的編碼序列(CSI)包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子或剪接位點(diǎn)，優(yōu)選此類反向起始。 實(shí)施例5用SIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鵪鵓如2007年4月5日公開的美國專利公開號2007/0077650所述產(chǎn)生含 pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv載體(圖3)和假型VSV包膜蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。 轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集病毒顆粒并濃縮，當(dāng)天將約4微升含約1 x 105顆粒的病毒 懸液注射入X期鵪鶉卵的胚盤下腔中。將卵重新封好并孵育。ALV在其基因組3'端具有一個(gè)能使未剪接的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA轉(zhuǎn)移的胞質(zhì) 的CTE元件。在pSIN-OV-3.5小CTLA4-inv中，由于LTR相關(guān)OV啟動(dòng)子的反 向起始，CTE位于OV啟動(dòng)子的上游，因此CTE元件僅存在于起源于5' LTR 啟動(dòng)子的RNA中，而不出現(xiàn)于OV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的RNA中。因此，任何OV啟 動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的RNA應(yīng)在轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)前剪接。用CTLA4-Fc ELISA檢測嵌合鵪鶉的卵白。發(fā)現(xiàn)一只鵪鶉的卵白具有濃度 約16 jug/ml的CTLA4-Fc。這些鵪鶉的轉(zhuǎn)基因水平估計(jì)約5%或更少。因此Gl 的水平應(yīng)該充分更高。因?yàn)轾g鶉合雞卵清蛋白基因合其它禽類的卵清蛋白基因 水平類似，期望在雞或其它禽類出現(xiàn)相似的水平。實(shí)施例6構(gòu)建pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc將pALV-的4907 bp Mfe I/Xho I片段(例如2007年5月31日美國專利申請 號2007/0124829公開的)與pOM-3.9-CTLA4(圖15所示，2007年5月31日美 國專利申請?zhí)?007/0124829中)5115 XhoI/EcoRI片段連接產(chǎn)生如圖4和SEQ ID NO: 20所示pSIN陽3.9-OM-CTLA4-Fc。實(shí)施例7用pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雞如2007年4月5日公開的美國專利公開號2007/0077650所述產(chǎn)生VSV包 膜蛋白作為假型的含有pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc(圖4)載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集病毒并濃縮，在同一天將約7微升注射入X期卵的胚盤下 腔。將卵重新封好并孵育。用CTLA4-Fc ELISA檢測雞的卵白。發(fā)現(xiàn)一只雞的卵白具有濃度約0.37 ^g/ml的CTLA4-Fc。這些雞的轉(zhuǎn)基因水平估計(jì)約5%或更少。因此Gl的水平應(yīng)該充分更高。可將任意有用編碼序列插入到CTLA4-Fc編碼序列的位置產(chǎn)生對應(yīng)的產(chǎn)物。實(shí)施例8構(gòu)建。SIN國1.8-OM-IFNa-2B將來自pBS-OM-4.4(圖5 SEQ ID NO:23)的1051 bp 7Vco I片段插入到 pAVIJCR-A137.91丄2(圖6 SEQ ID NO:24)的Wco I位點(diǎn)，從而將1 kb卵類粘蛋 白啟動(dòng)子插入到IFN編碼序列和SV40聚腺苷酸化信號前并產(chǎn)生 plkb-OM-IFNMM。將plkb-OM-IFNMM的1816 bp C/a I-Sac I片段插入到 pBS-OM-4.4的6245 bp C7fl I-Sflc I片段中，從而將4.4 kb卵類粘蛋白片段與IFN 編碼序列融合產(chǎn)生p4.40M-IFNMM。將pBS-OMUP-10的8511 bp 5amH I-Sal I 片段與p4.40M-IFN的5148 bp SamH I-Sa/1片段連接，從而將10 kb卵類粘蛋 白啟動(dòng)子置于IFN編碼序列前，產(chǎn)生pl0-OM-IFN。用 引 物 5'-CTGAC-3， (SEQ ID NO: 27) 禾口 5，-GGCCTCGAGCCTAGACTTTTTACTCCTTAGA-3，(SEQ ID NO: 28)通過PCR 擴(kuò)增pl0.0-OM-IFN的2487-4889區(qū)域。用Sal I和Xho I消化PCR產(chǎn)物并分離 2435 bp(片段)。用Xho I消化pALV-SIN(例如2007年5月31日美國專利申請 號2007/0124829公開的)，分離4915 bp片段并與2435 bp片段連接，產(chǎn)生圖7 和SEQ ID NO: 21所示pSIN-1.8墨OM-IFNa-2B 。實(shí)施例9用pSIN-1.8-OM-IFNa-2B產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雞如2007年4月5日公開的美國專利公開號2007/0077650所述生產(chǎn)含 pSIN-1.8-OM-IFNa-2B轉(zhuǎn)基因并用VSV包膜蛋白產(chǎn)生假型的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。 轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集病毒并濃縮，在同一天將約7微升注射入X期卵的胚盤下 腔。將卵重新封好并孵育。用IFNa-2B ELISA檢測來自雞的卵白。發(fā)現(xiàn)雞卵白IFNa-2B的水平范圍為 1.5-865.0 ng/ml，而血清中的IFNa-2B水平至少低約600倍。這些雞的轉(zhuǎn)基因 水平估計(jì)約5%或更少。5只G0精子陽性公雞與非轉(zhuǎn)基因母雞交配。1251只子代中，30只攜帶 pSIN-1.8-OM-IFNa-2B轉(zhuǎn)基因。30只母雞中的6只每毫升卵白表達(dá)34.1-165.6 嗎人IFN-a-2B。 6中母雞中的每一只具有單一拷貝的轉(zhuǎn)基因。人IFN-a-2B的 血清水平為0.3-9.2 ng/ml，平均比卵白中的水平低30,000倍。實(shí)施例10用慢病毒載體和莫洛尼鼠白血病病毒產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雞本發(fā)明尤其關(guān)注根據(jù)本發(fā)明用于禽類轉(zhuǎn)基因的其它逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?？墒?用此類載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類，例如，用上述實(shí)施例1-9相同的方式使用ALV-SIN 載體。例如，可根據(jù)本發(fā)明使用莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)和慢病毒載體， 例如通過將每一病毒上游LTR中U3區(qū)域所含的一個(gè)或多個(gè)CAAT盒、TAATA 盒和增強(qiáng)子刪除以產(chǎn)生SIN載體?；蛘撸虺酥?即與SIN載體連接)每一 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含無轉(zhuǎn)錄活性的標(biāo)記物或選擇性盒。盡管使用特定的術(shù)語、設(shè)備和方法描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但此類描 述僅為說明目的。這些詞語用以描述而非限定。應(yīng)當(dāng)被理解的是，在不背離權(quán) 利要求書中列舉的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可進(jìn)行更改或 變化。此外，應(yīng)當(dāng)被理解的是不同實(shí)施方式的方面可全部或部分互換。
權(quán)利要求
1.一種基因組中含有包含啟動(dòng)子組件和SIN載體的外源核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因禽類，其中所述外源核苷酸序列整合入基因組并且所述禽類產(chǎn)生沉積于其產(chǎn)的硬殼卵中的外源蛋白質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求
1所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述啟動(dòng)子組件是輸卵 管特異性啟動(dòng)子。
3. 如權(quán)利要求
1所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述禽類選自雞、火雞或鵪鶉。
4. 如權(quán)利要求
1所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述啟動(dòng)子組件與禽類 外源性編碼序列連接。
5. 如權(quán)利要求
1所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述啟動(dòng)子組件是禽類 卵類粘蛋白啟動(dòng)子組件。
6. 如權(quán)利要求
1所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述啟動(dòng)子組件是禽類 卵清蛋白啟動(dòng)子組件。
7. 如權(quán)利要求
1所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述啟動(dòng)子組件是禽類 溶菌酶啟動(dòng)子組件。
8. 如權(quán)利要求
1所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述外源蛋白質(zhì)是治療 性蛋白質(zhì)。
9. 如權(quán)利要求
1所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述外源蛋白質(zhì)是細(xì)胞因子。
10. 如權(quán)利要求
1所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述外源蛋白質(zhì)選自下 組紅細(xì)胞生成素、GM-CSF、干擾素、融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白、生 長激素、細(xì)胞因子、結(jié)構(gòu)蛋白、干擾素、溶菌酶、(3-酪蛋白、白蛋白、ot-l抗 胰蛋白酶、抗凝血酶III、膠原、因子VIII、因子IX、因子X(等)、血纖蛋白原、 乳鐵蛋白、蛋白C、組織型纖溶酶原激活物(tPA)、生長激素和糜蛋白酶、免疫球蛋白、抗體、免疫毒素、因子vin、 b-結(jié)構(gòu)域缺失的因子vm、因子viia、因子IX、抗凝劑；水蛭素、阿替普酶、tpa、瑞替普酶、tpa、 tpa-5個(gè)結(jié)構(gòu)域中 缺失3個(gè)、胰島素、賴脯胰島素、速效胰島素、甘精胰島素、長效胰島素類似物、高血糖素、tsh、促濾泡素-卩、fsh、 pdgh、 inf-(3、 inf-al、 ifn-a2、 inf-(3、 inf-卩l(xiāng)b、 ifn-卩l(xiāng)a、 ifn-Y、 ifn-ylb、 il-2、 il-ll、 hbsag、 ospa、鏈道酶-a脫氧核糖核酸酶、 (3葡糖腦苷脂酶、tnf-a、 il-2-白喉毒素融合蛋白、tnfr-lgg片段融合蛋白拉羅尼 酶、DNA酶、阿法賽特、托西莫單抗、鼠單抗、阿侖單抗、拉布立酶、阿加 糖酶(3、特立帕肽、甲狀旁腺激素衍生物、阿達(dá)木單抗(lggl)、阿那白滯素、生 物修飾劑、奈西立肽、人b-型利鈉肽(hbnp)、集落刺激因子、培維索孟、人生 長激素受體拮抗劑、重組活化蛋白c、奧馬珠單抗、免疫球蛋白e(lge)阻斷物、 替伊莫單抗、ACTH、高血糖素、生長抑素、生長激素、胸腺素、甲狀旁腺激 素、色素激素、生長調(diào)節(jié)素、黃體生成素、絨毛膜促性腺素、下丘腦釋放因子、 依那西普、抗利尿激素、促乳素和促甲狀腺激素、免疫球蛋白多肽、免疫球蛋 白多肽D區(qū)、免疫球蛋白多肽J區(qū)、免疫球蛋白多肽C區(qū)、免疫球蛋白輕鏈、 免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)、免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和接頭肽。
11 如權(quán)利要求
l所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒選自禽 類白血病病毒載體(ALV)，鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，莫洛尼鼠白 血病病毒(MMLV)和慢病毒載體。
12，一種含有輸卵管細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因禽類，所述輸卵管細(xì)胞含有外源核苷酸序 列，該外源核苷酸序列包含與整合SIN載體內(nèi)外源性編碼序列相連的啟動(dòng)子組 件，其中所述外源性編碼序列在輸卵管細(xì)胞中表達(dá)并由輸卵管細(xì)胞分泌。
13. 如權(quán)利要求
12所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述禽類是雞。
14. 如權(quán)利要求
12所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述輸卵管細(xì)胞是管 狀腺體細(xì)胞。
15. 如權(quán)利要求
12所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述啟動(dòng)子組件是禽 類卵類粘蛋白啟動(dòng)子組件。
16. 如權(quán)利要求
12所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述啟動(dòng)子組件是禽 類卵清蛋白啟動(dòng)子組件。
17. 如權(quán)利要求
12所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述啟動(dòng)子組件是禽 類溶菌酶啟動(dòng)子組件。
18. —種產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括產(chǎn)生基因組內(nèi)有含載體核苷 酸序列的轉(zhuǎn)基因禽類，所述載體是SIN載體和SC負(fù)載體中至少其一，所述核苷酸序列具有與外源性編碼序列連接的啟動(dòng)子組件。
19. 如權(quán)利要求
18所述的方法，其特征在于，所述外源性編碼序列編碼人蛋白質(zhì)。
20. 如權(quán)利要求
18所述的方法，其特征在于，所述外源性編碼序列編碼治療性蛋白質(zhì)。
21. 如權(quán)利要求
18所述的方法，其特征在于，所述啟動(dòng)子組件包含選自禽 類卵清蛋白啟動(dòng)子組件、禽類卵類粘蛋白啟動(dòng)子組件、禽類溶菌酶啟動(dòng)子組件 和禽類伴清蛋白啟動(dòng)子組件組的啟動(dòng)子的功能性啟動(dòng)子序列。
22. 如權(quán)利要求
18所述的方法，其特征在于，所述禽類是雞。
23. —種基因組中含有外源核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因禽類，所述外源核苷酸序列 含有啟動(dòng)子組件和SC負(fù)載體，其中外源核苷酸序列整合入基因組，并且，所 述禽類產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)。
24. 如權(quán)利要求
23所述的轉(zhuǎn)基因禽類，其特征在于，所述啟動(dòng)子組件含有 選自下組的啟動(dòng)子的功能性啟動(dòng)子序列禽類卵清蛋白啟動(dòng)子組件、禽類卵類 粘蛋白啟動(dòng)子組件和禽類溶菌酶啟動(dòng)子組件。
25. —種核酸，其與如下所述核酸分子具有90%相同性，所述核酸分子選自 一組核苷酸序列，構(gòu)成該組的核苷酸序列含有`1. 3.5kbOV片段(包含DHSI、 II和III) 5'UTR-5'部分(來自外顯子L) 5'UTR-3，部分(來自外顯子1);`2. 3.5kbOV片段(包含DHSI、 II和III) 5' UTR-5，部分(來自外顯子L) 內(nèi)含子A5'UTR-3，部分沐自外顯子1) 3' UTR;``3. 3.5kbOV片段(包含DHSI、 II和III) 5' UTR-5'部分(來自外顯子L)內(nèi)含子A5'UTR-3'部分(來自外顯子1);4. 3.5kbOV片段(包含DHSI、 II禾n III) 5' UTR-5'部分(來自外顯子L)5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 3' UTR;5. 3.5kbOV片段(包含DHSI、 II禾口 III) 5'UTR-5'部分(來自外顯子L) 內(nèi)含子A5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 3'UTR/DHSA(圖8中13576-15163 bp);6. 3.5 kb OV片段(包含DHS I、 II禾卩III) 5'UTR-5，部分(來自外顯子L) 5'UTR-3'部分(來自外顯子1)3'UTR/DHSA(圖8中13576-15163 bp);7. 3.5kbOV片段(包含DHSI、 II禾卩III) 5'UTR-5，部分(來自外顯子L)內(nèi)含子A5'UTR-3'部分(來自外顯子1) 部分3'UTR RRE;8. ALV CTE3.5 kb OV片段(包含DHS I、 II和III) 5'UTR-5'部分(來自外顯子L)內(nèi)含子A5'UTR-3，部分(來自外顯子1) 部分3'UTR;其中，3.5 kb OV片段(包含DHS I、 II和III):圖8中3199開始6659結(jié)束(SEQ IDNO: 22);5' UTR-5，部分(來自外顯子L):圖8中6659開始6705結(jié)束(SEQ ID NO: 22); 5'UTR-3，部分(來自外顯子l):圖8中8295開始83U結(jié)束(SEQ ID NO: 22); 3'UTR:圖8中13576開始14209結(jié)束(SEQ ID NO: 22); 部分3'UTR:圖8中13576開始13996結(jié)束(SEQIDNO: 22);內(nèi)含子A:圖8中6706開始8294結(jié)束(SEQIDNO: 22);外顯子L:圖8中6659開始6705結(jié)束(SEQIDNO: 22); 外顯子l:圖8中8295開始8478結(jié)束(SEQ ID NO: 22);DHS III:圖8中3253開始3559結(jié)束(SEQ ID NO: 22); DHS II:圖8中5629開始6009結(jié)束(SEQ ID NO: 22); DHS I:圖8中6359開始6659結(jié)束(SEQ ID NO:22);以及RRE:如圖9a所示(SEQ ID NO: 25) ALV CTE如圖9b所示(SEQ ID NO: 26)
專利摘要
基因組中含有外源核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因禽類，所述外源核苷酸序列包含啟動(dòng)子組件和具有減少的啟動(dòng)子干擾的載體，其中所述外源核苷酸序列整合入基因組和禽類。
文檔編號C12N15/06GKCN101652475SQ200780049954
公開日2010年2月17日 申請日期2007年10月29日
發(fā)明者A·J·哈維, J·C·拉普 申請人:辛那杰瓦生物制藥股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan