專利名稱:以木質(zhì)纖維素類物質(zhì)發(fā)酵制取高光學(xué)純度l－乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木質(zhì)纖維素類物質(zhì)經(jīng)過(guò)微生物兩步發(fā)酵制取高光學(xué)純度L-乳酸及優(yōu)質(zhì)飼料的方法。
背景技術(shù)：
乳酸，英文名Lactic acid，學(xué)名α-羥基丙酸(α-hydroxypropanoic acid)，結(jié)構(gòu)式為CH3 CHOHCOOH，分子量為90.08，是一種天然存在的有機(jī)酸，廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中，具有D-型和L-型兩種構(gòu)型，乳酸在食品、醫(yī)藥、化工、環(huán)保等領(lǐng)域有廣泛的用途，由于人體只具有代謝L一乳酸的L一乳酸脫氫酶，因此只有L一乳酸能被人體完全代謝利用。而D-乳酸和DL一乳酸過(guò)量攝入則有可能引起代謝紊亂甚至導(dǎo)致中毒。因此，從健康角度來(lái)考慮，世界衛(wèi)生組織明確規(guī)定，成人每天攝入D一乳酸的量不得超過(guò)100mg/kg體重，對(duì)于三個(gè)月以下的嬰兒食品中不應(yīng)加入D一乳酸，而對(duì)于L一乳酸則不加限制。L-乳酸的生產(chǎn)及其聚合物作為可降解塑料和醫(yī)用材料的研究日益深入，因此，高光學(xué)純度的L-乳酸均具有廣闊的應(yīng)用前景。
目前，乳酸的生產(chǎn)主要是由微生物利用葡萄糖或木糖進(jìn)行發(fā)酵生成，存在的一個(gè)很大的問(wèn)題是生產(chǎn)成本的問(wèn)題，而在我國(guó)存在很大的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)資源，例如農(nóng)作物秸稈，工廠廢棄物如糖蜜、木屑、廢紙等，據(jù)了解我國(guó)每年僅農(nóng)作物秸稈和農(nóng)產(chǎn)品谷殼等就有7億多噸，再加上工業(yè)上的纖維廢棄物的話數(shù)量就更加龐大了，就地焚燒不僅浪費(fèi)資源，還導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染，但是由于沒(méi)有很好的菌種及有效的方法一直限制著這些資源的應(yīng)用。
公開(kāi)號(hào)為CN1594584的一項(xiàng)專利公開(kāi)了一種由農(nóng)作物秸稈發(fā)酵同時(shí)制取乳酸及飼料的方法，前后經(jīng)過(guò)了固態(tài)發(fā)酵→液態(tài)發(fā)酵→固態(tài)發(fā)酵三次發(fā)酵才能生產(chǎn)出乳酸及飼料，原料來(lái)源為農(nóng)作物秸稈，在秸稈的前處理中利用了堿液處理，對(duì)環(huán)境又造成了二次污染。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以天然木質(zhì)纖維素類物質(zhì)為原料，通過(guò)微生物兩步發(fā)酵制取高光學(xué)純度L-乳酸及優(yōu)質(zhì)飼料的工藝，不僅較好的解決了木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的利用問(wèn)題，而且為L(zhǎng)-乳酸的生產(chǎn)大大降低了成本。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種以木質(zhì)纖維素類物質(zhì)發(fā)酵制取高光學(xué)純度L-乳酸的方法，其特征在于依次進(jìn)行以下步驟(1)、含木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的預(yù)處理將含木質(zhì)纖維素類物質(zhì)粉碎，備用；(2)、配制黑曲霉培養(yǎng)基稱取一定量的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，加入黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營(yíng)養(yǎng)鹽液，滅菌；(3)、進(jìn)行黑曲霉接種在黑曲霉培養(yǎng)基中接種；(4)、黑曲霉發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)，得到木聚糖酶及纖維素酶；(5)、加水，反應(yīng)向發(fā)酵液中加入無(wú)菌水，使木聚糖酶及纖維素酶與底物充分反應(yīng)，產(chǎn)生還原糖類，作為下一步液體發(fā)酵的碳源；(6)、過(guò)濾將發(fā)酵液過(guò)濾，木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的殘?jiān)鼮樾箢愶暳希?7)、配制米根霉培養(yǎng)基向?yàn)V液中加入米根霉發(fā)酵所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滅菌；(8)、進(jìn)行米根霉接種在米根霉培養(yǎng)基中接種；(9)、米根霉發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)，得到L-乳酸。
黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營(yíng)養(yǎng)鹽液成份為(g/l)KH2PO43.0；NaNO35.0；玉米漿粉5.0；MgSO40.25，起始PH為5.0，木質(zhì)纖維素類物質(zhì)加入到營(yíng)養(yǎng)鹽液后，其含水量為65％。
黑曲霉發(fā)酵采用32℃-28℃變溫發(fā)酵，培養(yǎng)64-72小時(shí)。
向發(fā)酵液中加入無(wú)菌水后，PH值為5.0左右，反應(yīng)溫度為50℃，使木聚糖酶及纖維素酶與底物充分反應(yīng)。
所述的濾液中加入的米根霉發(fā)酵所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其成份為(NH4)2SO43g/l；ZnSO4·7H2O 0.15g/l；KH2PO40.3g/l；MgSO4·7H2O 0.75g/l；CaCO310g/l(單獨(dú)滅菌)，接種量為5-10％。
米根酶發(fā)酵條件為37℃、搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，經(jīng)12-36小時(shí)后發(fā)酵完畢。
所述的黑曲霉和米根霉，其分別選取N+脈沖式輻照處理，其中黑曲霉處理的能量為10～15keV，劑量為20×2.6×1013～120×2.6×1013ions/cm2，米根霉處理得能量為10～15keV，劑量為40×2.6×1013～60×2.6×1013ions/cm2。
所述的含木質(zhì)纖維素類的物質(zhì)是指一些工農(nóng)業(yè)的廢棄物，農(nóng)業(yè)廢棄物如秸稈粉，玉米芯，甘蔗渣等，工業(yè)上的廢棄物如廢木屑等。
本發(fā)明只需經(jīng)過(guò)兩步發(fā)酵即可生產(chǎn)出L-乳酸及飼料，木質(zhì)纖維素類物質(zhì)不需要經(jīng)過(guò)堿液處理，同時(shí)本發(fā)明所選用的這個(gè)菌種發(fā)酵所產(chǎn)生的乳酸經(jīng)測(cè)定光學(xué)純度大于98％，是一種非常優(yōu)良的生產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的菌種。所用原料為所有木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，來(lái)源更加廣泛。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)工藝流程簡(jiǎn)單，利用離子注入選育的黑曲霉作為固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶出發(fā)菌，產(chǎn)酶量高，達(dá)到了國(guó)際先進(jìn)水平，第二步利用離子注入選育的米根霉進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，實(shí)驗(yàn)證明其不但能夠利用六碳糖，利用五碳糖的水平也非常高，所以大大增加了半纖維素的利用率，并且所產(chǎn)L-乳酸光學(xué)純度高，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，步驟簡(jiǎn)單，發(fā)酵時(shí)間短，投資少，同時(shí)產(chǎn)生的廢渣還可以作為優(yōu)質(zhì)飼料，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益。
圖1為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)兩步發(fā)酵制取高光學(xué)純度L-乳酸和優(yōu)質(zhì)飼料的工藝流程圖。
具體的實(shí)施方式兩株高產(chǎn)菌株的制備一株黑曲霉突變株(Aaspergillus niger mutant P602)是由黑曲霉中間突變株Aaspergillus niger mutant N218經(jīng)過(guò)能量為10～15keV，劑量為20×2.6×1013～120×2.6×1013ions/cm2的進(jìn)行N+注入處理得到的。
一株米根霉突變株(Rhizopus oryzae 6041)是由米根霉出發(fā)菌經(jīng)過(guò)能量為10～15keV，劑量為40×2.6×1013～60×2.6×1013ions/cm2的進(jìn)行N+注入處理得到的高產(chǎn)菌。
離子注入在中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所離子注入機(jī)上進(jìn)行，它由離子源、聚焦系統(tǒng)、質(zhì)量分析、加速系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、靶室和測(cè)控系統(tǒng)等基本部分組成。工作原理是在離子源中產(chǎn)生等離子體，其中離子經(jīng)引出系統(tǒng)引出，經(jīng)質(zhì)量分析器選擇后，在加速系統(tǒng)中獲得能量，就可以注入樣品。
經(jīng)離子注入誘變處理后這兩種菌的產(chǎn)酶及產(chǎn)酸水平均有大幅度提高。
例1種子培養(yǎng)黑曲霉取10ml無(wú)菌水將培養(yǎng)好的新鮮產(chǎn)孢子斜面上的孢子洗下，制成孢子懸液備用。
米根霉37℃，200r/min，培養(yǎng)12h。裝液量250mL三角瓶裝入50mL液體培養(yǎng)基。
(1)、木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的預(yù)處理將玉米芯、秸稈粉等木質(zhì)纖維素類物質(zhì)粉碎至40-60目，備用。
(2)、利用黑曲霉進(jìn)行固體發(fā)酵產(chǎn)酶稱取一定量的干物質(zhì)，加入黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營(yíng)養(yǎng)鹽液，成份為(g/l)KH2PO43.0；NaNO35.0；玉米漿粉5.0；MgSO40.25，起始PH為5.0，起始含水量為65％，培養(yǎng)基配好后裝入250ml的錐形瓶中，121℃滅菌20分鐘，等到培養(yǎng)基滅好冷卻后進(jìn)行接種，取10ml無(wú)菌水將培養(yǎng)好的新鮮產(chǎn)孢子斜面上的孢子洗下，制成孢子懸液，吸取底物重量的10-15％于配好并滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行變溫發(fā)酵[32℃-28℃]，培養(yǎng)64-72小時(shí)，經(jīng)測(cè)定此時(shí)產(chǎn)生了大量了木聚糖酶及纖維素酶。
黑曲霉能夠發(fā)酵利用的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)非常的廣泛，但是要想使其產(chǎn)酶達(dá)到最高水平，就要合理調(diào)整各類物質(zhì)的配比，為了使其產(chǎn)酶高，還要添加合適的營(yíng)養(yǎng)鹽液，本發(fā)明優(yōu)先推薦如下條件需要的營(yíng)養(yǎng)鹽液，成份為(g/l)KH2PO43.0；NaNO35.0；玉米漿粉5.0；MgSO40.25，起始PH為5.0，起始含水量為65％，培養(yǎng)基配好后裝入200ml的錐形瓶中進(jìn)行變溫發(fā)酵[32℃-28℃]，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)64-72小時(shí)。
(3)、固體發(fā)酵完畢后，往發(fā)酵瓶中加入80-100ml無(wú)菌水，置于50℃條件下，并使其輕輕搖動(dòng)，使產(chǎn)生的能消化木素類物質(zhì)的酶類與木素類物質(zhì)充分反應(yīng)(固態(tài)發(fā)酵完畢后，其PH值為5.0左右，為酶反應(yīng)的最適PH)，產(chǎn)生還原糖類，作為下一步液體發(fā)酵的碳源。
(4)、將發(fā)酵液過(guò)濾，過(guò)濾后的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)殘?jiān)鼊t由于經(jīng)過(guò)了木聚糖酶的消化消除“抗?fàn)I養(yǎng)因子”戊聚糖可以作為畜類飼料。取一定量的濾液，加入米根霉發(fā)酵所需要的營(yíng)養(yǎng)元素，米根霉發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基組成為(g/l)(NH4)2SO43，ZnSO4·7H2O 0.15，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.75。同時(shí)為了控制發(fā)酵過(guò)程中的PH值，在發(fā)酵液中加入了一定量的CaCO3。溫度為37℃、搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，接種量為5-10％，具體接種過(guò)程同黑曲霉相同，經(jīng)測(cè)定12-36小時(shí)后發(fā)酵完畢，產(chǎn)生L-乳酸。
例2將玉米芯、秸稈粉碎至40-60目，備用。
利用黑曲霉進(jìn)行固體發(fā)酵產(chǎn)酶將玉米芯、秸稈粉按一定比例混合，并加入麩皮作為營(yíng)養(yǎng)因子，最終玉米芯∶麩皮∶秸稈粉＝4∶2.5∶1，稱取7.5克干物質(zhì)，加入黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營(yíng)養(yǎng)鹽液，成份為(g/l)KH2PO43.0；NaNO35.0；玉米漿粉5.0；MgSO40.25，起始PH為5.0，起始含水量為65％，培養(yǎng)基配好后裝入250ml的錐形瓶中，121℃滅菌20分鐘，等到培養(yǎng)基滅好冷卻后進(jìn)行接種，取10ml無(wú)菌水將培養(yǎng)好的新鮮產(chǎn)孢子斜面上的孢子洗下，制成孢子懸液，吸取1ml于配好并滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行變溫發(fā)酵[32℃-28℃]，培養(yǎng)64小時(shí)，經(jīng)測(cè)定此時(shí)產(chǎn)生了大量了木聚糖酶及纖維素酶。
經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)生的木聚糖酶的酶活為6320IU/g，纖維素酶酶活為28IU/g。
固體發(fā)酵完畢后，往發(fā)酵瓶中加入100ml無(wú)菌水，置于50℃條件下，并使其輕輕搖動(dòng)，使產(chǎn)生的能消化木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的酶類與底物充分反應(yīng)，產(chǎn)生還原糖類，作為下一步液體發(fā)酵的碳源。
將發(fā)酵液過(guò)濾，過(guò)濾后的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)殘?jiān)鼊t由于經(jīng)過(guò)了木聚糖酶的消化消除“抗?fàn)I養(yǎng)因子”戊聚糖可以作為畜類飼料。取濾液50ml，加入米根霉發(fā)酵所需要的營(yíng)養(yǎng)鹽液，米根霉發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基組成為(g/l)(NH4)2SO43，ZnSO4·7H2O 0.15，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.75。同時(shí)為了控制發(fā)酵過(guò)程中的PH值，我們?cè)诎l(fā)酵液中加入了一定量的CaCO3。進(jìn)行米根酶發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)條件為裝液量為50ml，溫度為37℃、搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，接種量為5％，具體接種過(guò)程同黑曲霉相同，經(jīng)測(cè)定12-36小時(shí)后發(fā)酵完畢，產(chǎn)生L-乳酸，產(chǎn)生的量為7-8mg/g干物質(zhì)，也就是說(shuō)經(jīng)過(guò)兩次發(fā)酵后，每100g干物質(zhì)可以產(chǎn)生10g左右的乳酸，其對(duì)木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到10％左右。
權(quán)利要求
1.一種以木質(zhì)纖維素類物質(zhì)發(fā)酵制取高光學(xué)純度L-乳酸的方法，其特征在于依次進(jìn)行以下步驟(1)、含木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的預(yù)處理將含木質(zhì)纖維素類物質(zhì)粉碎，備用；(2)、配制黑曲霉培養(yǎng)基稱取一定量的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，加入黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營(yíng)養(yǎng)鹽液，滅菌；(3)、進(jìn)行黑曲霉接種在黑曲霉培養(yǎng)基中接種；(4)、黑曲霉發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)，得到木聚糖酶及纖維素酶；(5)、加水，反應(yīng)向發(fā)酵液中加入無(wú)菌水，使木聚糖酶及纖維素酶與底物充分反應(yīng)，產(chǎn)生還原糖類，作為下一步液體發(fā)酵的碳源；(6)、過(guò)濾將發(fā)酵液過(guò)濾，木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的殘?jiān)鼮樾箢愶暳希?7)、配制米根霉培養(yǎng)基向?yàn)V液中加入米根霉發(fā)酵所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滅菌；(8)、進(jìn)行米根霉接種在米根霉培養(yǎng)基中接種；(9)、米根霉發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)，得到L-乳酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營(yíng)養(yǎng)鹽液成份為(g/l)KH2PO43.0；NaNO35.0；玉米漿粉5.0；MgSO40.25，起始PH為5.0，木質(zhì)纖維素類物質(zhì)加入到營(yíng)養(yǎng)鹽液后，其含水量為65％。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于黑曲霉發(fā)酵采用32℃-28℃變溫發(fā)酵，培養(yǎng)64-72小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于向發(fā)酵液中加入無(wú)菌水后，PH值為5.0左右，反應(yīng)溫度為50℃，使木聚糖酶及纖維素酶與底物充分反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于濾液中加入的米根霉發(fā)酵所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其成份為(NH4)2SO43g/l；ZnSO4·7H2O 0.15g/l；KH2PO40.3g/l；MgSO4·7H2O 0.75g/l；CaCO310g/l(單獨(dú)滅菌)，接種量為5-10％。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于米根酶發(fā)酵條件為37℃、搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，經(jīng)12-36小時(shí)后發(fā)酵完畢。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的黑曲霉和米根霉，其分別選取N脈沖式輻照處理，其中黑曲霉處理的能量為10～15keV，劑量為20×2.6×1013～120×2.6×1013ions/cm2，米根霉處理得能量為10～15keV，劑量為40×2.6×1013～60×2.6×1013ions/cm2。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的含木質(zhì)纖維素類的物質(zhì)是指一些工農(nóng)業(yè)的廢棄物，農(nóng)業(yè)廢棄物如秸稈粉，玉米芯，甘蔗渣等，工業(yè)上的廢棄物如廢木屑等。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種以木質(zhì)纖維素類物質(zhì)發(fā)酵制取高光學(xué)純度L－乳酸的方法，該工藝涉及一種以木質(zhì)纖維素類物質(zhì)為原料，只需粉碎，不經(jīng)過(guò)任何酸堿處理，添加適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，第一步接種黑曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵64－72小時(shí)，第二步，發(fā)酵液過(guò)濾后濾液接種米根酶進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵 12－36小時(shí)。經(jīng)過(guò)兩次發(fā)酵后，每100g干物質(zhì)可以產(chǎn)生6－12g左右的乳酸，其對(duì)木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到8－15％。固態(tài)發(fā)酵后的殘?jiān)鼊t由于經(jīng)過(guò)了木聚糖酶的消化消除“抗?fàn)I養(yǎng)因子”戊聚糖可以作為畜類飼料。本發(fā)明據(jù)有生產(chǎn)成本低，步驟簡(jiǎn)單，時(shí)間短，對(duì)環(huán)境友好，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，非常值得推廣和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P7/40GKCN1908184SQ200610041291
公開(kāi)日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2006年8月5日
發(fā)明者王冬梅, 李文, 楊英歌, 吳躍進(jìn), 余增亮 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan