一種利用大腸桿菌生產人α防御素1蛋白的方法

專利名稱:一種利用大腸桿菌生產人α防御素1蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種新的利用轉基因工程菌生產人α防御素1的方法，即根據生物密碼子使用偏好性原則對人α防御素1(Human neutrophil peptide，HNP1)成熟肽編碼序列進行優化設計，構建能促進二硫鍵形成的Trx融合性原核表達載體，轉化可降低毒性蛋白基低表達水平的大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysS，組成高效大腸桿菌表達體系。本發明還提供了用于本發明構建的基因工程菌株的使用方法。
背景技術：
防御素是普遍存在于高等生物體中的一種多肽抗生素，對病源微生物具有廣譜的毒殺效應，是機體免疫防御系統的重要組成部分(Ganc T et al，Eur J Haematol，1990，441；張滿朝，國外醫學分子生物學分冊，1994，6870)。哺乳動物防御素主要來源于參與非特異性免疫的一些吞噬細胞，特別是嗜中性粒細胞(PMN)。其它細胞包括NK細胞、γδ細胞、B細胞和單核/巨噬細胞及某些上皮細胞也能產生此類物質。成熟防御素是分子量為3～4KD的非糖基多肽，一般由29～34個氨基酸組成，分子內的3個二硫鍵使防御素具有穩定的β-片層結構。防御素分子間通過疏水鍵和氫鍵的相互作用能形成二聚體。目前對防御素的抑菌機理尚無定論。普遍認為，防御素的細胞毒活性和抗微生物活性與其結構特點有關，帶正電的防御素與帶負電的細菌細胞膜相互吸引，二聚或多聚的防御素穿膜形成跨膜的離子通道，從而擾亂了細胞膜的通透性及細胞能量狀態，導致細胞膜去極化，呼吸作用受到抑制以及細胞ATP含量下降，最終使靶細胞死亡。防御素的抗病毒作用則是通過與病毒外殼蛋白結合而導致病毒失去生物活性(Lehrer RI et al，Annurev Immun，1993，11105；Lehrer RI et al，J Clin Invest，1989，84553)。由于這種特殊的作用機理，使防御素具備兩個特點一是抗性譜廣，二是目的微生物難以對其產生抗性突變。因此，科學家們對防御素應用前景十分看好。
防御素在人體內廣泛分布，包括α防御素β防御素兩類。已發現的α防御素有6種之多，有關基因結構已經基本清楚(Sparkes RS et al，Genomic，1989，5240)。早在1993年，日本科學家就報道防御素在離體情況下可抑制艾滋病毒的復制，但沒有證明在體內防御素仍然有效(Nakashima H et al，AIDS，1993，71129)。1986年，科學家們觀察到人體免疫細胞CD8分泌一些可抑制艾滋病毒復制的未知因子(Walker CMet al，Science，1986，2341563)，但此后多年一直無法確定這些抑制因子的成分。直到2002年，張林琦等在正常人群和感染HIV 1的長期生存者來源CD8+T淋巴細胞刺激培養液中發現了一族有2個或3個峰的分子，分子量分別為3371.9Da、3442.5Da和3486.5Da。用單克隆抗體識別技術及直接蛋白序列分析技術，他們最終確定這些小分子是人α防御素1、2和3。這些小分子只能在正常對照和長期生存者中被檢測到，在處于進展狀態的HIV 1感染者的刺激培養液中沒有發現這些α防御素。實驗還證實人工合成α防御素1和2的混合物(1∶1)也對HIV 1病毒具有顯著的抑制效應(Zhang et al，science，2002，298995)。張林琦等的研究揭示了為什么少數感染艾滋病毒的人(約占感染者總數的1％-2％)可以自然存活多年不發病的秘密。著名華裔學者何大一博士認為防御素是一個非常有前途的治療手段，對于艾滋病的治療是一個非常有益的補充。
人α防御素1、2和3的發現和證實，使科學家在了解HIV/AIDS的發病機制方面邁出了一大步，為艾滋病的控制與治療提供了新的思路與方向。但要將防御素真正應用于艾滋病治療，尚有很多工作要做。從人體內提純的天然防御素具有很強的抗病毒活性，但提取資源有限，成本昂貴。化學合成法雖可方便地對多肽進行修飾，但也存在成本過高的問題。現已獲得兩個商業化的產品α防御素1和α防御素2，但合成工藝復雜，且與天然提純品相比純度不夠，包含了許多雜蛋白，抗艾滋病病毒活性較低，僅為提純的天然防御素的1/10至1/20(Zhang et al，science，2002，298995)。因此，通過基因和蛋白質工程技術來改善生產效率和產物活性，已成為防御素研究和應用的關鍵。
防御素在基因工程領域頗具誘惑力。這種誘惑力主要表現在兩個方面一是研究出高效的細菌或酵母表達系統，大量生產防御素，應用于醫學領域；另一個方面是分離動物或昆蟲的防御素基因，將之應用于植物抗病基因工程中(傅榮昭等，高技術通訊，1996，361)。因此，有關的研究非常引人注目。孫勇如等通過國家“九五”科技攻關項目的研究，分離出兔防御素基因(科學通報，1998，431519)，將兔α防御素基因導入小球藻，從轉基因小球藻中獲得了有活性的兔防御素NP 1，立了防御素基因小球藻生物反應器的模型系統，解決了藻類基因工程表達(專利申請號971123446，公開號CN1203278A；專利申請號71121893，公開號CN1203277A)，并構建兔防御素基因植物表達載體質粒(申請號95108877，公告號1126760)及在番茄中得到了表達(Zhang XH，Yi Chuan Xue Bao，2000，27953)。但植物真核表達系統的較低表達效率對其工業化生產有一定障礙。
大腸桿菌基因工程是降低人防御素生產成本的一條有效途徑。但如同其它多肽抗生素一樣，防御素對大腸桿菌細胞的毒性以及表達產物的活性問題是限制其在原核表達系統表達成功的主要因素。為了克服對宿主細胞的毒性，人們采用融合表達或選擇對多肽抗生素具有抗性的細菌株系進行原核表達。1993年，Piers等將HNP1、昆蟲殺菌肽cecropin/melittin(CEME)雜合肽基因分別與4個不同的載體蛋白相融合，并在大腸桿菌中進行表達；對表達產物的產量、細胞定位、蛋白降解情況進行了較為系統的研究，但遺憾的是沒得到具有抗菌活性的HNP1(Piers et al，gene，1993，1347；孫超等，多肽抗生素研究進展，http//www.21ray.com/6-tech/10.html)，所以生產防御素的高效表達體系還有待于進一步研究。
大腸桿菌表達系統是基因表達技術中發展最早，目前應用廣泛的經典表達系統。自二十世紀七十年代中期Struhl等首次在大腸桿菌中實現了有功能的活性表達以來，以質粒、乳糖操縱子為基礎建立的大腸桿菌表達體系不斷得到發展和完善。與其他系統相比，大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚，目標基因表達水平高，培養周期短，抗污染能力強等特點，因而成為分子生物學研究和生物技術產業化進程中的重要工具(李育陽等，基因表達技術，科學出版社，2001，1-13)。
要利用大腸桿菌系統高效生產異源蛋白質，必須采取正確的基因修飾策略。如消除稀有密碼子而利用最佳化密碼子，二級結構最小化，調整GC含量等。遺傳密碼子有64種，但絕大多數生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。最被頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimicalcodons)，那些不被經常利用的稱為稀有或低利用率密碼子(rare or low-usage codons)。實際上用作蛋白表達或生產的每種生物都表現出密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母和靈長類都有6～8個密碼子很少被利用(Kane J F，Current Opinions Biotechnol，1995，6494；Zhang S，Gene，1991，10561)。在大腸桿菌、酵母中編碼豐度高的蛋白質的基因都明顯避免使用低利用率密碼子。稀有密碼子的tRNA豐度很低，可能在翻譯中發生中止和移碼突變；低利用率密碼子往往抑制核糖體的運動，這些機制使含有稀有密碼子的蛋白基因難以實現高效的異源表達。對基因序列進行適當突變以及在表達系統中共表達稀有密碼子tRNA基因等方法都能改善這種狀況，但最根本的方法還是在不改變表達蛋白的氨基酸序列的基礎上，重新設計并人工合成適宜大腸桿菌高效表達基因序列。人血紅蛋白在大腸桿菌系統的成功表達就是這種技術思路的范例。為了達到血紅蛋白的好的表達水平，科學家們用大腸桿菌偏愛的密碼子重新合成了α球蛋白的編碼序列。
進行基因設計時除考慮編碼區的密碼子使用外，還應注意不同生物基因對終止密碼子的偏愛性以及圍繞終止密碼子的序列框架對終止效率的影響。包括人在內的哺乳動物傾向于用TGA而大腸桿菌多偏愛TAA；對于TGA和TAA終止子而言，緊接著終止密碼子的下游堿基對有效終止的影響力大小依次為G＞T＞A＞C。據報道，在大腸桿菌系統中，終止子終止效率可從TAAT的80％減低到TGAC的7％。
要獲得異源蛋白質的成功表達，不僅要考慮該蛋白質的基因序列，還要明確其生物活性，根據這些特性設計正確的技術方案。一些動物蛋白質具有強烈的細胞毒性，它們在動物體內以特殊的機制避免對動物細胞本身的損傷。如人體內防御素是先合成前原蛋白，暫時封閉其細胞毒性。另外，成熟的防御素是在嗜天青顆粒中形成，并且很少向外分泌，即使向外分泌，也被胞間液稀釋或與其它蛋白結合，從而不表現細胞毒活性。要用大腸桿菌表達系統來生產這些蛋白就相對比較困難。由于目標蛋白對宿主本身產生殺滅作用，往往造成表達體系表達量低甚至無表達。因此，抑制或克服目標蛋白對大腸桿菌本身毒性就成為首要面對的問題。
選擇適宜的大腸桿菌表達系統、考慮目的蛋白質的形式和在細胞中的位置等是解決細胞毒性蛋白質表達的主要途徑。完整的表達系統由表達載體和宿主菌兩部分構成。目前比較成熟的大腸桿菌表達系統包括lac和tac表達系統、PL和PR表達系統、T7表達系統等。T7系統以Novagen公司的pET系列載體以及相應的宿主菌(BL21系列)為代表(Robert Mierdorf etal，Newsletter ofNovagen，1994，11)，這類表達系統所用的載體具有可誘導的T7啟動子，系統表達量是目前大腸桿菌系統中最高的(可占細菌總蛋白的25％以上)，常用6～10個組氨酸形成融合蛋白，只增加幾個氨基酸，對蛋白質結構影響較小。pET系列載體之一的pET32a帶有硫氧化還原蛋白(Thioredoxin，Trx)標簽，表達的Trx蛋白溶解度很高，具有很強的蛋白二硫鍵氧化還原酶活性，可催化新生肽鏈二硫鍵的形成，同時具有分子伴侶的作用，可輔助多種蛋白質底物的折疊和組裝。與pET系列載體匹配的宿主菌包括BL21、BL21(DE3)、BL21TrxB、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE等。BL21應用最廣，具有lon和ompT蛋白水解酶缺陷的優點，可提高表達蛋白的穩定性。BL21TrxB菌株在蛋白酶缺陷BL21基礎上具有硫氧還蛋白還原酶突變(TrxB)，有利胞漿二硫鍵形成，增加正確折疊的蛋白組分。BL21(DE3)pLysS帶有質粒pLysS，能編碼T7溶酶。T7溶酶可降低T7啟動子調控的目的基因的背景表達水平，但不干擾由IPTG誘導的表達水平，適宜毒性蛋白表達。PL和PR表達系統則是以溫度敏感性PL和PR啟動子為中心構建的表達系統，成本低廉，但是表達蛋白容易降解，表達量低，不適宜毒性蛋白表達。lac和tac表達系統以Amersham公司的pGEX系列載體為代表，在tac啟動子、Lac操縱基因及SD序列下游相繼是谷胱苷肽巰基轉移酶(Glutathione S-transferase Gene Fusion，GST)基因序列以及多克隆位點。克隆的外源基因與GST基因相連，表達產物GST融合蛋白。該系統具有可誘導高效表達、便于純化的優點。由于GST基因序列存在可避免mRNA復雜二級結構的出現，增加轉錄物穩定性。GST屬于多功能蛋白，有助于穩定重組蛋白的折疊，可在溫和條件下除去，不易破壞目標蛋白的功能及其抗原性(The Recombinant Protein Book，Amersham，www.apbiotech.com)(Pickett C B，et al，Ann Rev Biochem，1989，58743)。BL21系列菌株也適用于這類載體。
表達蛋白質特別是毒性蛋白時需要考慮目的蛋白質的形式和在細胞中的位置。目前的表達形式有兩種，一是在細胞內表現為不溶性的包涵體顆粒，二是在細胞內表現為可溶性的蛋白質。可溶性蛋白可存在于細胞質中，還可借助于本身的功能序列和大腸桿菌蛋白質加工運輸體系，最終分泌到細胞周質空間，或分泌到培養液中。對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯聚合表達是比較理想的方式。帶有Trx或GST標簽的載體選擇了大腸桿菌偏愛的密碼子，容易表達外源蛋白，并且純化方便。
截止目前，在應用大腸桿菌系統生產真核來源的藥用蛋白方面已取得了很大進展。據報道，國際上已批準的重組蛋白藥物中有34種采用該系統生產，在我國已用該系統生產人生長素、胰島素、人組織型纖維酶原激活劑、白介素等。國內在人α防御素的研究方面也已取得了一些進展。李景鵬等通過化學合成途徑獲得了人α防御素cDNA克隆(東北農業大學學報，1995，26383)，劉水平等也克隆了人類防御素基因c DNA片段(湖南醫科大學學報，2002，2717)，但是，目前以大腸桿菌系統為工具進行人α防御素生產的技術尚未見報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種用大腸桿菌表達系統生產人α防御素1蛋白的方法，包括用于該方法的適宜DNA序列，系統部件組合以及主要技術路線。
本發明提供了一種用大腸桿菌表達系統生產人α防御素1蛋白的方法，包括(1)設計并化學合成SEQ ID NO 1所示的序列；(2)插入原核表達載體中，構建重組質粒pET32a-mHNP1；(3)使用得到的重組質粒轉化大腸桿菌細胞BL21(DE3)pLysS；(4)異丙基硫代-β-D半乳糖糖苷誘導轉化細菌表達異源蛋白。
為解決防御素基因的表達效率，對防御素基因進行了優化設計。本發明所述的SEQ ID NO 1序列是依據已公布的人α防御素cDNA序列及氨基酸組成(Zhang et al，science，2002，298995)，經基因優化設計改造而來，可翻譯出正確的人α防御素1氨基酸序列。
人α防御素1cDNA(NM 004084)先翻譯成94aa的前原防御素(preprodefenis，NP 004075)，再裂解、加工最后變成成熟的30aa的防御素1(P59665)或29aa的防御素2(P59665)。人體內防御素的這種生成方式是機體克服其毒性的自然機制(Erika V et al，J Clin Invest，1996，971624)。
表1 α防御素1成熟肽編碼序列及其氨基酸序列 注陰影部分字符標識人防御素成熟肽編碼序列中的大腸桿菌稀有密碼子。
對照目前公認的大腸桿菌稀有密碼子表(Zhang et al，1991，Gene，105，61-72；Strategies Newsletter，2000，3(1)，p.31)，人α防御素1成熟肽編碼序列(見表1)中先后密集排列有8個大腸桿菌基因中很少使用的密碼子，比例高達27％左右。如此多的稀有密碼子將可能對以大腸桿菌為工具的蛋白表達系統效率產生嚴重影響。因此，我們根據大腸桿菌喜好密碼子進行同義密碼子替換(http//www.uky.edu/Pharmacy/ps/porter/CodonUsage/preferred codons.htm)，在不改變氨基酸序列的情況下，對防御素成熟肽編碼序列進行大規模改造，將稀有密碼子替換為使用頻率高的同義密碼子。除添加起始密碼子ATG外，上述序列還使用了包括大腸桿菌常用終止密碼子TAA在內的雙終止子，并配置了有利終止的側翼序列，TAAG的序列格式將最大限度地防止不良終止效應的發生，為高效表達系統奠定了基因結構基礎。
本發明在基因修飾和反復篩選的基礎上，選擇帶有T7啟動子和硫氧化還原蛋白(Trx)標簽序列的原核表達載體(pET32a，Novagen公司產品)，將優化了的基因序列插入pET32a載體Trx基因序列之后的BamHI和SalI位點之間，從而構建了高效融合性表達載體pET32a-mHNP1(圖1)。這種構建方式綜合了T7啟動子的高效性以及Trx蛋白能促進蛋白二硫鍵形成和正確折疊的特點，在進一步提高表達效率的基礎上，同時兼顧了表達產物的活性。表達的蛋白質經腸激酶切處理，可獲得單純的目的蛋白。
本方法將獲得的重組表達質粒轉化入適宜的大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)pLysS內，組成完整的大腸桿菌表達系統。BL21(DE3)pLysS菌株可降低T7啟動子調控的目的基因的背景表達水平，但不干擾由IPTG誘導的表達水平，如此克服了因表達產物的宿主細胞毒性而致的低表達甚至不表達現象，為實現目的蛋白的高效有活性表達奠定了首要基礎。
本方法建立的表達系統屬于化學誘導表達系統。這些化學物質包括異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside，IPTG)、乳糖等。IPTG誘導效率高，可滿足抗體制備、生化性質研究、結構研究等需要，而乳糖誘導法以其安全性適宜于制備用于醫療目的的重組人防御素。
本發明首次提供了用一種大腸桿菌DNA重組技術獲得人α防御素1蛋白的方法，并提供了適宜該方法的高度優化的核苷酸序列。與目前應用的化學合成、人工提取人防御素以及藻類生產動物防御素的技術相比，具有如下的優點(1)核苷酸序列的優異性。與已人α-防御素1成熟肽編碼序列相比，本申請要求保護的特定的堿基序列經過大幅度修飾(改變了近1/3的核苷酸序列，優化終止密碼周邊序列)，具有更好的轉錄和翻譯效率，更適合基因工程系統表達。
(2)本申請中要求保護的重組表達體系，通過使用對大腸桿菌有較好抗性的宿主菌BL21(DE3)pLysS及以Trx融和方式表達目標蛋白，克服了因表達產物對宿主細胞毒性而致的低表達甚至不表達現象，成功實現了有活性表達，具有新穎性和創造性。
(3)本發明提供的方法可較好地彌補人工提取、化學合成生產人防御素方法的不足。產物容易加工提純，開發周期短，生產效率高，可大規模制取。
(4)本法提供技術產品為人體活性多肽，應用于醫學領域時比動物源性防御素毒安全，副作用可能性小，不易發生人體免疫應答反應及因此而導致的藥效降低等現象。
本發明在國內首次解決了以大腸桿菌基因工程途徑表達有活性人α防御素1的技術難關，通過融合蛋白的方式生產出了有活性的人防御素1，為α-防御素1的基因工程生產提供了新的途徑，將在一定程度上解決人防御素1蛋白來源不足的現狀。研究成果可滿足生產人防御素結構、生化性質以及制備相應抗體等研究應用的需要，也使人防御素的藥用開發和規模生產成為可能。新型藥物的大規模生產，將為目前難以醫治的疾病得以有效治療，特別是對艾滋病的控制和治療提供了新的思路和方法。



圖1重組質粒pET32a-mHNP1圖譜圖2mHNP1片段合成示意圖F1、F2為正義鏈片段，F3、F4為反義鏈片段。正義鏈片段和反義鏈片段相互錯位交搭。
圖3pUCm T-mHNP1陽性克隆PCR鑒定
1、2、4、5陽性克隆，3DNA marker圖4pET32a載體圖譜圖5pET32a-mHNP1菌落質粒PCR鑒定5DNA marker，其余為菌落號。所有菌落質粒都為陽性圖615％SDS-PAGE凝膠鑒定菌體中融合蛋白表達1，pET32a/BL21(DE3)PlysS空載非誘導對照；2，pET32a/BL21(DE3)PlysS空載誘導；3，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS非誘導對照6h；4，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS誘導6h；5，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS非誘導對照4h；6，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS誘導4h；7，蛋白標準；8，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS誘導2h；9，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS非誘導對照2h；圖7pET32a-mHNP1誘導表達時間光密度曲線pET32a/HNP1-U轉基因菌pET32a-mHNP1/BL21(DE3)plysS非誘導樣品pET32a/HNP1-I轉基因菌pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS誘導樣品圖8mHNP1的殺菌活性E coli BL21大腸桿菌BL21；Sta phylocococci aureus金黃色葡萄球菌具體實施方式
實施例1α防御素1成熟肽編碼序列的化學合成及其克隆1、HNP1成熟肽編碼序列優化設計與化學合成從Genbank中查詢得知HNP1mRNA序列(NM_004084)及其成熟肽氨基酸序列(P59665)，由此推出其成熟肽編碼序列(90bp)。在序列序列分析的基礎上，根據生物喜好密碼子及其稀有密碼子的差異性，對原序列進行優化設計。即剔除HNP1中稀有密碼子，將它們替換為大腸桿菌喜好密碼子。為達到良好的翻譯終止效果，在優化編碼序列末端添加了TGA和TAA兩個終止密碼子，利于目的蛋白在大腸桿菌表達。
修飾后序列見表2.
將重新設計的HNP1成熟肽編碼序列(modified HNP1，以下簡稱mHNP1)兩條互補鏈各分成2個片段，共4個片段(F1-F4)，互補片段之間相互交搭。交由上海生工生物技術公司，用亞磷酰胺法分別予以合成上述片段(見表3及圖2)。檢測純化后分裝，-20℃備用。
表2 HNP1成熟肽原編碼序列及重新設計修飾的序列


表中斜體部分為替換了的密碼子表3 寡核苷酸片段的設計


合成上述片段后，先對F2、F4兩片段進行5’端磷酸化。即取F2片段和F4各200pm，T4多核苷酸激酶40u(大連寶生物工程公司)，10mmol/L ATP 5ul，10ul 10倍緩沖液[500mM Tris-HCI(PH 8.0)，100mMMgCI2，50mM DTT]，加水補足100ul體積，37℃反應2小時，80℃10min后漸冷至室溫，用酚液(酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1)抽提，100％乙醇沉淀以及70％乙醇，溶于20ul TE中。
對F2和F4片段5’端磷酸化處理后，進行4片段連接反應。將合成的4個片段(F1～F4)各200pm，用100ul 10倍T4連接酶緩沖液[660mM Tris-HCI(PH 7.6)，66mM MgCI2，100mM DTT，1mM ATP]溶解在一小管中，其中F2和F4己磷酸化，80℃2min后漸冷至室溫，加入40ul T4DNA連接酶(大連寶生物工程公司)，12℃反應24h，酚液和乙醇抽提處理。將所得樣品加入1.0％瓊脂糖點樣孔內，同時加入DNA marker(DL2000，北京天為時代科技有限公司)，60-80V電泳，紫外透射儀下檢測，切下目的條帶凝膠，用北京賽百盛基因技術有限公司生產的UltrapureTMPCR產物純化試劑盒回收。最后溶解于20ulTE中。
2、合成mHNP1的克隆(1)載體及菌種pUCmT克隆載體購自上海生工公司。大腸桿菌DH 5α為本實驗室保存。
(2)工具酶、marker及試劑盒Taq DNA Polymerase、X-gal、IPTG、dNTP購自北京鼎國生物技術有限責任公司。DNA markerDL2000，來自北京天為時代科技有限公司。BamHI、SalI等限制性內切酶、T4DNA Ligase購自大連寶生物工程公司，UltrapureTMPCR產物純化試劑盒由北京賽百盛生物工程公司提供，PCR引物(如下)由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
(3)引物合成按照合成mHNP1序列，利用Oligo6.0軟件設計如下一對引物(P1和P4)P1 5’GCGGGA TCCATG GCC TGC TAT TGC CGT ATT C 3’BamH IP4 5’CGCGTC GACTTA TCA GCA GCA GAA TGC CCA G 3’Sal I下劃線部分為酶切位點，斜體為起始密碼子或終止密碼子。
(4)PCR擴增反應以化學合成后連接的mHNP1為模板，用P1、P4引物對進行擴增。PCR在Flexigene(Techne(Cambridge)Ltd生產)PCR儀上進行，50ul反應體系Taq酶1.0ul(2u/ul)，dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，各10mM，PH7.5)4.0ul，10倍反應緩沖液[200mM Tris-HCI(PH 9.0)，500mM KCI，20mM MgCI2，1％Triton X-100]5.0ul，P1和P4引物各2.0ul，上述模板DNA 2.0ul(約含1ng DNA)，剩余體積用滅菌雙蒸水補足。
反應條件為95℃預變性1min，然后94℃變性30s，55℃30S，72℃延伸1min，共30個循環，最后72℃延伸10min補齊末端。
(5)電泳檢測PCR結果，并回收擴增片段，連接到T載體上反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，約為110bp，用回收試劑盒純化回收上述PCR產物，與pUCm T載體進行連接。10ul連接反應體系組成為T4 DNA連接酶1ul，上述回收PCR產物5ul(0.2pmol)，pUCm T載體(50ng/ul)1ul，10倍T4連接酶緩沖液([660mM Tris-HCI(PH 7.6)，66mM MgCI2，100mM DTT，1mMATP]1ul，PEG40001ul，滅菌水1ul。16℃，過夜連接。
(6)轉化，篩選按照《分子克隆》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯。分子克隆實驗指南(第三版)。科學出版社，2002，p96)中的方法制備DH5α感受態細胞，按常規熱激法轉化大腸桿菌DH5α。將連接液8ul加入放置在冰浴上剛融化的DH5α感受態細胞200ul中，冰浴30min，然后在42℃恒溫水浴中精確熱激90s，立即取出，冰浴2min，加入不含任何抗生素的LB培養液800ul，37℃溫浴45min使細菌復蘇并表達抗生素抗性基因。最后將轉化菌液涂在含X-gal和IPTG的氨芐瓊脂平板上。培養過夜，次日進行藍白斑初步篩選。
陽性菌落篩選程序是從轉化平皿中挑取白斑多個(20個)，另選少量藍斑(3個)做對照，接種于含3ml含氨芐的LB培養液過夜。次日提取質粒，以藍斑質粒為對照在白斑質粒中挑選電泳條帶大小適合的滯后者，再進行PCR擴增檢測(見圖3)、BamH I和Sal I雙酶切檢測，均得到預計的約100bp的DNA片段。最后，挑選一個上述各步鑒定正確的菌落送上海申友公司測序。
序列分析結果表明，克隆中有預期的mHNP1編碼序列及終止密碼子側翼序列(含SEQ ID NO1)1 GCGGGA TCCATG GCC TGC TAT TGC CGT ATT31 CCA GCC TGC ATT GCA GGC GAA CGT CGT TAT61 GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGG91 GCA TTC TGC TGC TGA TAAGTC GACGCG將獲得的克隆命名為pUCm T-mHNP1質粒，做甘油菌-70℃保存。
實施例2mHNP1 T7型表達載體的構建、誘導表達及活性鑒定1、mHNP1 T7型表達載體的構建
(1)菌種與質粒大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為本實驗室保存。pET32a質粒(Novagen公司，見圖4)系東南大學醫學院曾憲坤博士惠贈。
(2)工具酶及試劑限制性內切酶、T4連接酶、Taq DNA聚合酶分別購自大連寶生物工程公司、上海生工公司、北京鼎國生物技術有限責任公司。
(3)引物的設計與合成PCR引物依本發明優化設計mHNP1成熟肽編碼序列設計，均由大連寶生物公司合成。引物序列如下P1 5’GCGGGA TCCATG GCC TGC TAT TGC CGT ATT C 3’BamH IP4 5′CGCGTC GACTTA TCA GCA GCA GAA TGC CCA G 3’Sal I下劃線部分為酶切位點，斜體為起始密碼子或終止密碼子。
(4)T7型原核表達載體的構建采用PCR亞克隆法構建pET32a-mHNP1。
A.PCR擴增目的片段，并回收以重組質粒pUCm-mHNP1為模板，由P1、P4引物經Termocycler PCR儀(Biometra公司產品)擴增出約0.1k b的mHNP1 DNA。反應體系為50ul，其中Taq酶1.0ul(2u/ul)，dNTPs(各10mM)4.0ul，10倍PCR反應緩沖液[200mM Tris-HCI(PH 9.0)，500mM KCI，20mM MgCI2，1％Triton X-100]5.0ul，雙端引物(P1和P4)各2.0ul。模板DNA 2.0ul(約含1ng DNA)，用滅菌雙蒸水補足體積。反應條件為95℃預變性1min，然后94℃變性30s，55℃ 30S，72℃延伸1min，共30個循環，最后延伸10min補齊末端。PCR反應后1.5％瓊脂糖電泳檢測，為110bp。用回收試劑盒純化回收100ul上述PCR產物，溶解于20ul滅菌水中。
B.目的DNA片段與載體的連接將上述純化的PCR產物和pET32a載體分別以Bam HI和Sal I雙酶切，并用UltrapureTMPCR產物純化試劑盒進行純化。將酶切純化的目的基因和pET32a按體積比5∶1進行連接。反應體系為10ul，即加入目的DNA 5ul，pET32a 1ul，T4 DNA連接酶1ul，連接緩沖液1ul，16℃，連接過夜。得到的連接產物命名為pET32a-mHNP1。
C.重組子的提取及鑒定將連接產物(pET32a-mHNP1)轉化大腸桿菌感受態BL21(DE3)PlysS。取8ul連接產物加入200ul感受態菌中，0℃冰水浴30min，42℃水浴90s，冰水浴2min，加入800ul LB培養液，37℃振蕩培養1h后涂布于含氨芐的LB板上。用PCR鑒定克隆，電泳結果顯示利用P1、P4引物擴增出與預期大小(約0.1Kb)的片段(圖5).將鑒定的陽性克隆抽提質粒，并進行Bam HI和Sal I雙酶切鑒定。最后，進行測序分析。用DNAMAN分析證實克隆序列與設計序列SEQ IDNO1完全一致。重組質粒pET32a-mHNP1構建組成見圖1。
2、pET32a-mHNP1在E.Coli BL21(DE3)PlysS中的表達將鑒定正確的pET32a-mHNP1原核表達質粒轉化感受態細胞后，挑取新鮮的單菌落在含氨芐的LB培養基中振蕩培養過夜，次日取過夜培養物，按1％體積接種到新的LB培養基中，劇烈振蕩培養3h左右至OD600≈0.6。向培養菌中加入IPTG，使其終濃度達到1mmol/L，30℃振蕩培養，分別在誘導后2h、4h、6h取小樣檢測蛋白表達，最后離心收集菌體。
用SDS-PAGE檢測菌體中的融合蛋白表達(圖6)。轉化pET32a-mHNP1重組質粒的BL21(DE3)PlysS菌經IPTG誘導表達，表達菌處理后進行PAGE檢測。蛋白標準(Protein molecular weight marker #SM0431，MBI fermentas產品)購自上海生工生物公司。結果表明，含有pET32a-mHNP1重組質粒的BL21(DE3)PlysS菌經IPTG誘導，菌體裂解物增加了一條約22kDa的蛋白電泳條帶，和預計的蛋白質分子量相符(Trx-His標簽分子量約為18.4KDa，HNP1成熟肽約3.5KDa)，說明表達出了含目的多肽的融合蛋白。另外，在誘導后2h左右，目的蛋白表達已經達到相當高的水平。約在誘導后4h，目的蛋白表達量達到最大值。經亞細胞定位方法(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯。分子克隆實驗指南(第三版)。科學出版社，2002，1244)確定大部分目的蛋白在胞質中以可溶性蛋白方式存在，提示目的蛋白可能具有良好的生物學活性及容易提純等特點。
誘導過程中細菌生長曲線見圖7。取含有pET32a-mHNP1質粒的BL21(DE3)pLysS轉化菌接種LB，37℃振搖培養到OD600≈0.6，將pET32a-mHNP1菌一分為二，一半加IPTG誘導，一半不加做未誘導對菌照。30℃振搖培養，分別于0h、1h、2h、4h取3ml菌液測其OD600值并記錄數據。從圖7可見，加IPTG 1h后，誘導菌光密度就開始輕微下降，表明表達的融合蛋白已經開始對宿主菌本身產生影響。在2h和4h后誘導組和對照組生長有了顯著差異。上述結果顯示表達的融和蛋白保持了一定的抑菌活性。
3、純化重組人α防御素1(mHNP1)的抗菌實驗以常見革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Sta phylococcus aureus)、革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli BL21(DE3))為實驗對象進行抗菌試驗。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎甚至敗血癥、膿毒癥等，因而是藥物抗菌實驗的良好材料。
(1)重組人α防御素的提取和純化I、制備細胞抽提物將帶有質粒pET32a-mHNP1的大腸桿菌BL21(DE3)PLysS菌株接種于含Amp的LB培養基37℃活化過夜。次日按1％擴大培養至OD600＝0.8時加IPTG至終濃度為1.0mmol/L，繼續振蕩培養4小時(30℃)。于4℃5000g離心15min收獲細菌。通過15％SDS-PAGE電泳檢測以及亞細胞定位方法(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯。分子克隆實驗指南(第三版)。科學出版社，2002，1244)確定大部分目的蛋白在胞質中以可溶性蛋白方式存在。
制備細菌抽提物的方法參照《分子克隆》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯。科學出版社，2002，p1247)。將每100ml培養菌液離心收獲的菌體沉淀重懸浮在4ml結合緩沖液(20mmol/L磷酸鈉，500mmol/LNaCI，PH7.8)中，加溶菌酶至終濃度1mg/ml，冰上放置30min。混合物于4℃搖床上孵育10min。加入TritonX-100、DNase和Rnase，終濃度分別為1％、5ug/ml和5ug/ml，再于4℃振動孵育10min。4℃3000g離心30min，去除不溶性細胞碎片。上清(細胞裂解物)轉移到一新管中。上清液用0.45um濾膜過濾后進行親和層析。
II、鎳瓊脂糖凝膠親和層析用鎳瓊脂糖凝膠FF柱(北京卓冠群科技有限公司產品)在AKTA Prime層析儀(Amershan biosciences產品)上進行親和層析，提取融合蛋白。
緩沖液150mM pH7.4的PBS緩沖液。配制0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g，加適量水溶解后定容到1000ml。
緩沖液250mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g和咪唑34g，加適量水溶解后定容到1000ml。
緩沖液3不同咪唑濃度的緩沖液B配制




基本步驟如下A、鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，1.6×20m，柱床體積為10ml。
B、用緩沖液1平衡2-5個床體積，流速為2ml/min。
C、將20ml細胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm濾膜過濾，上樣，流1ml/min。
4、用緩沖液1再洗2-5個床體積，流速為2ml/min。
5、用分別含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的緩沖液3進行階段洗脫，流速為2ml/min，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度。
6、用純水流洗5個柱床體積，再用20％的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2ml/min。
III、融合蛋白的裂解以及進一步處理在用BCA法測定融合蛋白的含量后，用腸激酶(Novagen產品)將目的蛋白從融合蛋白切下(20℃，16小時)。最后，再次進行親和層析把Trx-His標簽和腸激酶去除，而得到純的目標蛋白。有關操作按照產品說明書進行。純化后的融合蛋白經SDS-PAGE電泳鑒定，凍干，命名為mHNP并于-80℃保存。
(2)抗菌實驗A、菌種及材料大腸桿菌(E.coli BL21(DE3))金黃色葡萄球菌(Sta phylococcus aureus)mHNP1溶液配制純化mHNP1用0.01％乙酸稀釋成不同濃度瓊脂糖Sigma產品B、抗菌實驗基本步驟瓊脂糖彌散抗菌實驗參考劉文超等(第四軍醫大學學報。1997，18(6)525)、Lehrer等(J Immunnolmethod.1991，137167)以及鐘德鈺等(華西口腔醫學雜志。1998，16(1)26)等所述的方法進行。取對數生長期的細菌3×106CFU，加入16ml 42℃滅菌瓊脂糖培養基中(含營養肉湯粉4.8mg，低電滲瓊脂糖160mg，0.02％Tween 20，以1mmol/L pH7.4PBS配制)，混勻后倒入直徑14.5cm的培養皿中，用打孔器在膠上打直徑3mm的孔，每孔加入5μl防御素，濃度分別為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml。在37℃溫箱中溫育3h，再鋪以16ml 42℃滅菌瓊脂培養基，于37℃溫箱中繼續溫育18h，以考馬斯亮藍染色(考馬斯亮藍R250 2mg，甲醇27ml，甲醛15ml，水63ml)24h。觀測以加樣孔為中心的抑菌環的大小。
C、結果mHNP1的抗菌活性如圖8所示，在50μg/ml時mHNP1對大腸桿菌(E.coli BL21(DE3))和金黃色葡萄球菌(Sta phylococcus aureus)在瓊脂糖彌散抗菌檢測系統中均顯示出顯著殺菌活性，并隨著濃度增加而活性增強；但不同菌株對防御素的敏感性有差異。
SEQ ID NO 1的信息序列特征序列描述SEQ ID NO 11ATGGCCTGCT ATTGCCGTAT TCCAGCCTGC31 ATTGCAGGCG AACGTCGTTA TGGCACCTGC61 ATCTACCAGG GCCGTCTCTG GGCATTCTGC91 TGCTGATAAG下劃線為起始密碼子或雙終止密碼子及側翼序列
權利要求
1.一種利用大腸桿菌生產人α防御素1蛋白的方法，包括以下步驟(1)使用SEQ ID NO 1所示的序列片段1ATGGCCTGCT ATTGCCGTAT TCCAGCCTGC31 ATTGCAGGCG AACGTCGTTA TGGCACCTGC61 ATCTACCAGG GCCGTCTCTG GGCATTCTGC91 TGCTGATAAG下劃線為起始密碼子或雙終止密碼子及側翼序列(2)將上述基因序列插入T7型Trx融合表達載體中，獲得重組質粒pET32a-mHNP1。(3)將pET32a-mHNP1導入匹配大腸桿菌中組成完整表達體系；(4)用異丙基硫代-β-D半乳糖糖苷誘導上述體系在菌體內表達人HNP1成熟蛋白。
2.權利要求
1所述的方法，其中SEQ ID NO1是人HNP1成熟肽優化編碼序列。
3.權利要求
1所述的方法，其中T7型Trx融合表達載體是pET32a。
4.權利要求
1所述的方法，其中大腸桿菌是BL21(DE3)pLysS菌株。
5.一種多核苷酸，包含如SEQ ID NO1所示的序列。
6.包含權利要求
1的多核苷酸的表達載體。
7.包含權利要求
7的表達載體的宿主細胞。
專利摘要
本發明提供了一種利用大腸桿菌生產生物活性物質人α防御素1蛋白的方法及其適用的優化設計DNA序列和重組表達質粒。包括使用由人α防御素1成熟肽編碼序列優化設計后獲得的序列SEQ ID NO1，構建成原核表達載體質粒pET32a－mHNP1，將質粒導入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，化學誘導表達人α－防御素1。本法可克服因α防御素1蛋白對宿主菌本身的毒害作用而引起的低表達甚至不表達，大量生產有活性的人α防御素1蛋白，滿足有關結構、生化性質研究及抗體制備等方面的需要，也可應用于醫藥衛生領域。
文檔編號C12N15/70GKCN1810954SQ200510112983
公開日2006年8月2日 申請日期2005年10月18日
發明者周長生, 陳其新, 李春麗, 陳正華 申請人:甘肅亞盛鹽化工業集團有限責任公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan