導(dǎo)致復(fù)合雜合女性HA患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株、構(gòu)建方法及應(yīng)用

本發(fā)明涉及細(xì)胞工程，具體涉及導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株、構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、血友病a（haemophilia?a，ha）是由f8?(factor?8)基因缺陷引起的最常見的單基因遺傳疾病之一，這種缺陷會導(dǎo)致f8因子在體內(nèi)的合成障礙或分子結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)而造成凝血因子f8的減少或完全缺失。由于血友病的x連鎖隱性遺傳，女性很少表現(xiàn)出血友病的癥狀。女性血友病最常見的發(fā)病機(jī)制是f8基因突變結(jié)合x染色體偏斜失活。更罕見的是，f8基因的純合性或復(fù)合雜合性突變以及染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)的異常也會導(dǎo)致女性血友病。

2、與ha相關(guān)的最常見的異常是內(nèi)含子1或22的反轉(zhuǎn)。其他ha病例是由分布在整個(gè)基因中的各種點(diǎn)突變引起的，包括錯(cuò)義、無義、剪接位點(diǎn)、移碼突變和嚴(yán)重缺失，其中錯(cuò)義突變是引起ha最常見的原因。人類f8基因位于x染色體xq28區(qū)域的長臂上，由26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成。f8蛋白產(chǎn)物無酶活性。成熟的fviii蛋白由2332個(gè)氨基酸組成，分析人類f8基因發(fā)現(xiàn)該蛋白具有明顯的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，表示為a1-a2-b-a3-c1-c2。fviii在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生蛋白水解，產(chǎn)生200?kda重鏈和80?kda輕鏈，形成異源二聚體，這是fviii的主要分泌形式。hfviii異源二聚體在釋放到循環(huán)血液中后被水解為50kda、43kda和73kda的異源三聚體，它們是fviii的活化形式。

3、因此，有針對性的對女性血友病f8基因錯(cuò)義突變開展遺傳學(xué)研究，明確致病基因及其致病機(jī)制，對血友病患者的遺傳咨詢和個(gè)體化治療具有潛在的臨床意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株、構(gòu)建方法及應(yīng)用，從而豐富f8基因突變數(shù)據(jù)庫，為今后ha的精準(zhǔn)治療提供新策略。

2、本發(fā)明提供了導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株，包括fviii-?met721arg突變細(xì)胞株和fviii-?pro283thr突變細(xì)胞株。

3、優(yōu)選的，fviii-?met721arg突變細(xì)胞株的堿基序列如seq?id?no:1所示，氨基酸序列如seq?id?no:2所示；fviii-?pro283thr突變細(xì)胞株的堿基序列如seq?id?no:3所示，氨基酸序列如seq?id?no:4所示。

4、優(yōu)選的，所述fviii-?met721arg/fviii-?pro283thr突變細(xì)胞株構(gòu)建方法具體為：

5、s11、對bdd-fviii野生型質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)誘變，構(gòu)建表達(dá)fviii-met721arg/fviii-pro283thr?cdna序列的質(zhì)粒，其中fviii-?met721arg突變細(xì)胞株的突變位點(diǎn)為f8基因外顯子14上c.2162t>g?(p.met721arg)，fviii-?pro283thr突變細(xì)胞株的突變位點(diǎn)為f8基因外顯子7上c.847c>a?(p.pro283thr)；

6、s12、利用脂質(zhì)體將含有cdna序列的fviii-met721arg/fviii-pro283thr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中，經(jīng)藥物篩選得到fviii-?met721arg/fviii-pro283thr突變細(xì)胞株。

7、優(yōu)選的，bdd-fviii野生型質(zhì)粒的堿基序列如seq?id?no:5所示，氨基酸序列如seqid?no:6所示。

8、優(yōu)選的，含有cdna序列的fviii-met721arg質(zhì)粒是基于pcr的方法對bdd-fviii野生型進(jìn)行定點(diǎn)誘變獲得，含有cdna序列的fviii-?pro283thr質(zhì)粒是基于無縫克隆技術(shù)對bdd-fviii野生型進(jìn)行定點(diǎn)誘變獲得。

9、優(yōu)選的，所述含有cdna序列的fviii-met721arg質(zhì)粒/fviii-pro283thr質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞hek293t。

10、優(yōu)選的，所述藥物篩選為抗生素篩選，其中抗性藥物為嘌呤霉素。

11、優(yōu)選的，構(gòu)建含有cdna序列的fviii-met721arg質(zhì)粒時(shí)，定點(diǎn)誘變所使用的引物為：上游引物5'-tttcggaacagaggcaggaccgccttac-3',下游引物5'-ctgcctctgttccgaaagtctgagttgt-3'；

12、構(gòu)建含有cdna序列的fviii-pro283thr質(zhì)粒時(shí)，定點(diǎn)誘變所使用的引物為：上游引物5'-tctgattggatgccacagga-3'，下游引物5'-gcgatggttcctcacaagaa-3'。

13、本發(fā)明還提供了上述導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株或根據(jù)上述導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株的構(gòu)建方法獲得的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株在預(yù)防、早期診斷或治療女性血友病中的應(yīng)用。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

15、1、本發(fā)明不僅為女性血友病早期診斷和有效治療提供了研究方向和新的理論依據(jù)，還在實(shí)踐上為研發(fā)治療血友病的特效藥物提供了新的分子靶點(diǎn)和細(xì)胞模型。

16、2、本發(fā)明兩種新突變的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了f8基因突變數(shù)據(jù)庫，還通過聯(lián)合兩種新突變的分子致病機(jī)制和隨機(jī)x染色體失活結(jié)果闡明了女性血友病的發(fā)病原因，為血友病患者計(jì)劃生育提供遺傳咨詢以及今后女性血友病的精準(zhǔn)治療提供新策略。

技術(shù)特征：

1.導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株，其特征在于，包括fviii-met721arg突變細(xì)胞株和fviii-?pro283thr突變細(xì)胞株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株，其特征在于，fviii-?met721arg突變細(xì)胞株的堿基序列如seq?id?no:1所示，氨基酸序列如seq?id?no:2所示；fviii-?pro283thr突變細(xì)胞株的堿基序列如seq?id?no:3所示，氨基酸序列如seq?id?no:4所示。

3.導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述fviii-?met721arg/fviii-?pro283thr突變細(xì)胞株構(gòu)建方法具體為：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，bdd-fviii野生型質(zhì)粒的堿基序列如seq?id?no:5所示，氨基酸序列如seq?id?no:6所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，?含有cdna序列的fviii-met721arg質(zhì)粒是基于pcr的方法對bdd-fviii野生型進(jìn)行定點(diǎn)誘變獲得，含有cdna序列的fviii-?pro283thr質(zhì)粒是基于無縫克隆技術(shù)對bdd-fviii野生型進(jìn)行定點(diǎn)誘變獲得。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述含有cdna序列的fviii-met721arg質(zhì)粒/fviii-pro283thr質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞hek293t。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述藥物篩選為抗生素篩選，其中抗性藥物為嘌呤霉素。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，構(gòu)建含有cdna序列的fviii-met721arg質(zhì)粒時(shí)，定點(diǎn)誘變所使用的引物為：上游引物5'-tttcggaacagaggcaggaccgccttac-3'，下游引物5'-ctgcctctgttccgaaagtctgagttgt-3'；

9.根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一項(xiàng)所述的導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株或權(quán)利要求3-8任意一項(xiàng)所述的導(dǎo)致復(fù)合雜合女性ha患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株的構(gòu)建方法獲得的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株在預(yù)防、早期診斷或治療女性血友病中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及導(dǎo)致復(fù)合雜合女性HA患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株，包括FVIII?Met721Arg突變細(xì)胞株和FVIII?Pro283Thr突變細(xì)胞株，F(xiàn)VIII?Met721Arg突變細(xì)胞株的堿基序列如SEQ?ID?NO:1所示，F(xiàn)VIII?Pro283Thr突變細(xì)胞株的堿基序列如SEQ?ID?NO:3所示。本發(fā)明還提供了導(dǎo)致復(fù)合雜合女性HA患者的兩個(gè)致病錯(cuò)義突變的細(xì)胞株構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明兩種新突變的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了F8基因突變數(shù)據(jù)庫，還通過聯(lián)合兩種新突變的分子致病機(jī)制和隨機(jī)X染色體失活結(jié)果闡明了女性血友病的發(fā)病原因，為血友病患者計(jì)劃生育提供遺傳咨詢以及今后女性血友病的精準(zhǔn)治療提供新策略。

技術(shù)研發(fā)人員：楊林花,王蕾,王剛,楊嘉,盧曉梅,王端陽,付棟彥
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山西醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2