檢測癌癥早期ctDNA甲基化的紅外-納米孔聯用系統

本發明涉及生物檢測，具體涉及檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統。

背景技術：

1、血液中的循環腫瘤dna（circulating?tumor?dna，ctdna），是一種攜帶癌癥特異性的遺傳及表觀遺傳信息的片段化dna，因其甲基化模式與它們的細胞或組織來源一致，因此，ctdna甲基化可作為早期癌癥篩查和預測的生物標志物。

2、常用dna甲基化檢測系統雖各有優勢但依然存在不足，如亞硫酸氫鹽測序法過中亞硫酸氫鹽對微量ctdna具有破壞性，不適用于早期癌癥篩查；甲基化敏感的限制性內切酶法中所用酶存在消化不徹底產生假陽性的現象；基于pcr技術的微滴式數字pcr成本高且耗時。因此，目前對低豐度ctdna甲基化的檢測依然面臨著挑戰，需要設計靈敏度和特異性更高的檢測系統，實現微量ctdna甲基化的精準檢測。

技術實現思路

1、為解決上述問題，本發明提供檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，旨在通過紅外輻射誘導納米孔狹窄空間內甲基基團的特異性振動，從而實現更快速、更簡便、靈敏度和特異性更高的ctdna甲基化檢測。

2、為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，包括：

3、變性模塊，用于加熱升溫使ctdna變性成單鏈ctdna；

4、雜交模塊，用于混合雜交探針dna和單鏈ctdna形成新的雙鏈結構；

5、檢測池，用于檢測雜交后的雙鏈dna分子，包括納米孔、紅外發射源和用于放置待測dna分子的承載層；

6、輻照模塊，其通過紅外發射源發射紅外波段為2860-2970cm-1的紅外輻照，照射納米孔和待測dna分子，將紅外光能量傳遞給納米孔及待測dna分子；

7、采集模塊，用于采集通過納米孔的待測ctdna分子引起的電信號電流幅值和信號持續時間；

8、數據分析模塊，用于計算分析采集待測患者ctdna分子中各片段的電信號和信號持續時間的變化數據，并輸出檢測結果。

9、上述方案的技術原理如下：該系統包括變性模塊加熱使ctdna變性成單鏈，在通過雜交模塊使患者ctdna單鏈與探針dna雜交形成雙鏈，在輻照模塊的紅外輻照下，甲基基團在納米孔中振動產生電信號變化，通過靈敏檢測區記錄數據，并由數據分析模塊進行分析。

10、采用上述方案有以下有益效果：

11、1、本方案通過輻射模塊發射輻射的形式將紅外光能量傳遞給納米孔及待測dna分子，使得dna分子中特定基團產生振動，同時增加與納米孔相互作用頻率，達到使ctdna中甲基基團產生特征信號，實現低豐度ctdna甲基化精準檢測的目的。

12、2、本方案通過納米孔實現對甲基修飾的ctdna進行識別檢測，具有無需標記、無需擴增、可實時檢測的特點，能夠通過納米尺度的孔道檢測低豐度物質，實現微量ctdna甲基化的精準檢測的效果。

13、3、通過發射紅外波段為2860-2970cm-1的紅外輻照實現特定分子振動，使甲基基團產生不同的伸縮振動形式，通過產生明顯、可分辨的特征信號，不僅提高納米孔檢測分辨率，降低ctdna甲基化檢測濃度需求，還擴展了特異性檢測范圍，為繪制亞納米尺度結構變化檢測圖譜提供新的途徑。

14、進一步，變性模塊具有溫度控制功能，能夠將加熱溫度控制在90-95℃。

15、所述檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統的步驟一中，探針dna為與ctdna不完全互補的探針dna，當該探針與ctdna雜交后的dna雙鏈在甲基化胞嘧啶處于堿基外翻狀態。

16、有益效果：通過設計加熱變性過程中溫度控制在90-95℃內，既能夠有效破壞ctdna雙鏈結構，又有利于維持dna分子相對穩定性，降低dna分子熱解損傷的風險。

17、進一步，探針dna為與ctdna不完全互補的探針dna，探針dna用于使ctdna中甲基化的胞嘧啶處在雜交后呈現堿基外翻的狀態。

18、有益效果：通過設計使用不完全互補的探針dna，使得雜交后的dna雙鏈在甲基化胞嘧啶處呈現堿基外翻狀態，增加待測dna分子與納米孔的相互作用概率，提高了甲基化修飾的識別分辨率。

19、進一步，探針dna的濃度調配為50-100nmol/ml。

20、有益效果：通過對探針dna的雜交濃度進行限定，有利于探針dna與ctdna單鏈的特異性結合，減少與其他dna的非特異性雜交，提高后續檢測的準確性。

21、進一步，雜交模塊具有溫度控制功能，能夠將雜交環境溫度控制在50-70℃。

22、有益效果：通過控制雜交溫度，使雜交反應在適宜的溫度下高效進行，提高探針與ctdna之間的特異性結合。

23、進一步，雜交模塊還具有ph值控制功能，能夠將反應溶液ph值控制在7-7.5。

24、有益效果：通過控制雜交環境的ph值為7-7.5，營造了中性或弱堿的環境，增強雜交后dna分子的穩定性，同時能夠提高雜交效率，縮短雜交所需要的時間。

25、進一步，雜交的反應時間控制在1-1.5h內。

26、有益效果：將雜交時間控制在1-1.5小時，有利于探針dna與ctdna目標序列的充分結合，降低非特異性結合的風險，縮短檢測的周期。

27、進一步，采集模塊包括靈敏檢測區，靈敏檢測區位于納米孔上，靈敏檢測區用于識別納米孔與分子的接觸，產生用于檢測的電信號。

28、有益效果：通過設置納米孔上的靈敏檢測區，能夠實時監測分子的通過情況，并準確記錄電信號數據，為后續的數據分析和結果判定提供了可靠依據。

29、進一步，采集模塊采集電信號的電流幅值包括ib電流幅值和ic電流幅值，ib電流幅值用于體現待測患者未甲基化ctdna的電流幅值閾，ic電流幅值用于體現待測患者甲基化ctdna甲基基團引起的電流幅值；

30、數據分析模塊的分析過程為分析待測患者ctdna各片段的電信號電流幅值中是否存在異常ic值，并結合電信號持續時間進行判斷，當待測患者ctdna某片段的電信號電流幅值中ic值大于該待測患者ctdna其他片段的電信號電流幅值中的ic值，并且該片段電信號持續時間大于其他片段電信號持續時間，輸出“檢測陽性”的信號標識，反之，其他情況輸出“檢測陰性”的信號標識。

31、有益效果：由于不同待測患者的ctdna分子的特性以及檢測時ctdna的濃度不同，難以通過設定標準值分析電信號檢測結果，本發明通過采集模塊測量并區分ib電流幅值和ic電流幅值，能夠有效的區分待測患者ctdna中未甲基化和甲基化的部分，并結合比較不同ctdna片段的電信號電流幅值和持續時間，能夠提高識別出異常甲基化的ctdna片段的準確性，降低檢測結果產生誤差的風險。

32、本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。

技術特征：

1.檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，其特征在于，包括：

2.根據權利要求1所述的檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，其特征在于，變性模塊具有溫度控制功能，能夠將加熱溫度控制在90-95℃。

3.根據權利要求2所述的檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，其特征在于，探針dna為與ctdna不完全互補的探針dna，探針dna用于使ctdna中甲基化的胞嘧啶處在雜交后呈現堿基外翻的狀態。

4.根據權利要求3所述的檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，其特征在于，探針dna的濃度調配為50-100nmol/ml。

5.根據權利要求4所述的檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，其特征在于，雜交模塊具有溫度控制功能，能夠將雜交環境溫度控制在50-70℃。

6.根據權利要求5所述的檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，其特征在于，雜交模塊還具有ph值控制功能，能夠將反應溶液ph值控制在7-7.5。

7.根據權利要求6所述的檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，其特征在于，雜交的反應時間控制在1-1.5h內。

8.根據權利要求7所述的檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，其特征在于，采集模塊包括靈敏檢測區，靈敏檢測區位于納米孔上，靈敏檢測區用于識別納米孔與分子的接觸，產生用于檢測的電信號。

9.根據權利要求8所述的檢測癌癥早期ctdna甲基化的紅外-納米孔聯用系統，其特征在于，采集模塊采集電信號的電流幅值包括ib電流幅值和ic電流幅值，ib電流幅值用于體現待測患者未甲基化ctdna的電流幅值閾，ic電流幅值用于體現待測患者甲基化ctdna甲基基團引起的電流幅值；

技術總結
本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及檢測癌癥早期ctDNA甲基化的紅外?納米孔聯用系統，包括：變性模塊，用于加熱升溫使ctDNA變性成單鏈ctDNA；雜交模塊，用于混合雜交探針DNA和單鏈ctDNA形成新的雙鏈結構；檢測池，用于檢測雜交后的雙鏈DNA分子，包括納米孔、紅外發射源和用于放置待測DNA分子的承載層；輻照模塊，其通過紅外發射源發射紅外波段為2860?2970cm<supgt;?1</supgt;的紅外輻照，照射納米孔和待測DNA分子，將紅外光能量傳遞給納米孔及待測DNA分子；采集模塊，用于采集通過納米孔的待測DNA分子引起的電信號變化的數據。本發明旨在通過紅外輻射誘導納米孔狹窄空間內甲基基團的特異性振動，從而實現更快速、更簡便、靈敏度和特異性更高的ctDNA甲基化檢測。

技術研發人員：李葦,楊正林
受保護的技術使用者：四川省醫學科學院·四川省人民醫院
技術研發日：
技術公布日：2024/11/28