一種穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

本發(fā)明涉及細胞免疫治療，具體而言，涉及一種穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來，隨著免疫學理論的豐富及對眾多腫瘤抗原的認識，免疫細胞治療在腫瘤治療臨床應(yīng)用中取得了突破性進展，截止目前，全球約有逾千種腫瘤免疫細胞治療方案處于開發(fā)中。γδt、nk、nkt、m1型巨噬細胞等固有免疫細胞和cik、腫瘤浸潤t淋巴細胞（til）、基因工程t細胞（car-t、tcr-t），腫瘤新抗原-細胞毒性t淋巴細胞治療（neo-ctl）等獲得性免疫細胞治療技術(shù)已在多種腫瘤的治療中取得了突破性進展。免疫細胞治療技術(shù)已成為腫瘤治療技術(shù)發(fā)展最受關(guān)注的方向。

2、在免疫細胞治療技術(shù)的研發(fā)過程中，細胞殺傷實驗作為免疫細胞治療技術(shù)的研發(fā)過程中非常關(guān)鍵的驗證手段，其技術(shù)穩(wěn)定性、操作的簡便性，結(jié)果的可靠性對于評估免疫細胞的制備質(zhì)量，回輸體內(nèi)殺傷效率起到?jīng)Q定性意義。傳統(tǒng)經(jīng)典的免疫細胞殺傷效率檢測中，如51鉻（cr）釋放法、乳酸脫氫酶(ldh)釋放法，存在著設(shè)備要求高，檢測背景高、信噪比大、操作繁瑣、數(shù)據(jù)不穩(wěn)定等諸多不利因素，嚴重制約著免疫細胞治療技術(shù)的研發(fā)和臨床應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株的構(gòu)建方法，其操作簡單，高效快捷，可以構(gòu)建得到共表達螢火蟲螢光素酶、gfp和抗性篩選標記三個基因，且陽性率接近100%的穩(wěn)轉(zhuǎn)靶細胞株。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供一種穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株的應(yīng)用，其能夠用于免疫細胞殺傷活性測定，具有背景低，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，體系小，操作簡單，設(shè)備要求低的特點。

3、本發(fā)明的實施例是這樣實現(xiàn)的：

4、一種穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株的構(gòu)建方法，其包括：

5、以pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro為骨架質(zhì)粒，以pselect-zeo-lucsh為目的質(zhì)粒，將目的質(zhì)粒中的lucsh?(cpg-free)基因序列通過分子克隆和同源重組的方式構(gòu)建到骨架質(zhì)粒的mcs區(qū)，得到靶基因質(zhì)粒，即pcdh-cmv-lucsh(cpg-free)-ef1-copgfp-t2a-puro；

6、將靶基因質(zhì)粒進行慢病毒包裝，得到病毒液；

7、利用病毒液感染腫瘤來源靶細胞，篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲熒光素酶靶細胞株。

8、一種穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株在免疫細胞殺傷活力測定中的應(yīng)用，該穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株由上述構(gòu)建方法得到。

9、本發(fā)明實施例的有益效果是：

10、本發(fā)明提供一種穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，其以pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro為骨架質(zhì)粒，通過分子克隆和同源重組的方式將mcs區(qū)重組為lucsh?(cpg-free)基因序列，得到靶基因質(zhì)粒pcdh-cmv-lucsh(cpg-free)-ef1-copgfp-t2a-puro，再通過慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染，即可得到共表達螢火蟲螢光素酶、gfp和抗性篩選標記的穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株，該穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株可以應(yīng)用于免疫細胞殺傷靶細胞效率測定，具有背景低，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，體系小，操作簡單，設(shè)備要求低的特點。

技術(shù)特征：

1.一種穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述線性化引物包括42#-line-f和42#-line-r，其核苷酸序列分別如seq?id?no:1和seq?id?no:2所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述基因擴增引物包括lucsh(cpg-free)-f和lucsh(cpg-free)-r，其核苷酸序列分別如seq?id?no:3和seq?id?no:4所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述靶基因質(zhì)粒通過測序引物進行測序驗證，所述測序引物為cmv-f，其核苷酸序列如seq?id?no:5所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，將所述靶細胞質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染293t細胞來進行慢病毒包裝，所述包裝質(zhì)粒包括pspax2和pmd2g；所述靶細胞質(zhì)粒和pspax2、pmd2g的質(zhì)量比為4:3:1。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述腫瘤來源靶細胞包括k562、raji以及nalm6中的任一種。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，感染后的所述腫瘤來源靶細胞通過gfp篩選和嘌呤霉素篩選陽性細胞，得到所述穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲熒光素酶靶細胞株。

9.一種穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株在免疫細胞殺傷活力測定中的應(yīng)用，其特征在于，所述穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株由權(quán)利要求1~8任一項所述的構(gòu)建方法得到。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述免疫細胞包括car-t細胞和nk細胞中的任一種。

技術(shù)總結(jié)
一種穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，涉及細胞免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，其以pCDH?CMV?MCS?EF1?copGFP?T2A?Puro為骨架質(zhì)粒，通過分子克隆和同源重組的方式將MCS區(qū)重組為LucSh(CpG?free)基因序列，得到靶基因質(zhì)粒pCDH?CMV?LucSh(CpG?free)?EF1?copGFP?T2A?Puro，再通過慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染，即可得到共表達螢火蟲螢光素酶、GFP和抗性篩選標記的穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株，該穩(wěn)轉(zhuǎn)螢火蟲螢光素酶靶細胞株可以應(yīng)用于免疫細胞殺傷靶細胞效率測定，具有背景低，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，體系小，操作簡單，設(shè)備要求低的特點。

技術(shù)研發(fā)人員：李濤,姚宏,葛春蕾,李莉,郭吉寅,承佳興,姚小暄
受保護的技術(shù)使用者：昆明醫(yī)科大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/28