原核表達高效獲取Cullin1-Rbx1E3連接酶復合物的方法

本發明屬于蛋白質純化，涉及一種原核表達高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復合物的方法。

背景技術：

1、泛素化是通過e1、e2和e3三種酶級聯反應將小分子蛋白質泛素共價連接到底物蛋白上的過程。該過程涉及e1酶激活泛素、e2酶轉移泛素、以及e3酶識別底物并將泛素附著在底物上。泛素化不僅可以單一附著，還可以通過泛素的七個賴氨酸殘基（k6、k11、k27、k29、k33、k48、k63）或n端甲硫氨酸（m1）形成不同類型的多聚泛素鏈，調控蛋白質的降解、活性和細胞內定位等多種功能。cullin1-ring?e3連接酶復合物（crl）是e3泛素連接酶家族中最龐大和多樣化的一類，由骨架蛋白cullin1、ring蛋白（如rbx1）、銜接蛋白和底物識別蛋白組成。cullin1蛋白作為骨架，通過與ring蛋白和底物識別模塊的相互作用，確保泛素從e2酶順利轉移至底物蛋白。crl1在細胞周期調控、dna修復、信號轉導等生物過程中發揮關鍵作用，其失調與多種疾病特別是癌癥密切相關。在cullin1催化的泛素化過程中，k48連接的多聚泛素鏈是一個經典例子。首先，e2酶ube2d將第一個泛素分子連接到底物蛋白上，隨后在e2酶cdc34的作用下，泛素鏈通過k48連接位點進行延伸。k48鏈的形成是蛋白質降解信號，被蛋白酶體識別并降解，從而調控細胞周期和基因表達。cullin1作為crl復合物的核心成分，其催化機制對于理解泛素化過程的生化機制至關重要。crl的研究不僅揭示了泛素化的分子機制，還為疾病治療提供了潛在的藥物靶點。

2、然而，高效表達和純化cullin1-rbx1一直是結構生物學研究中的瓶頸問題。傳統上，研究人員主要采用昆蟲細胞表達系統來實現cullin1-rbx1的表達。然而，昆蟲細胞表達系統也存在顯著的局限性。首先，其表達周期較長，從病毒轉化到蛋白質收獲通常需要一個月的時間，這大大降低了實驗的效率。其次，昆蟲細胞培養和桿狀病毒生產的成本較高，增加了實驗的經濟負擔。此外，操作復雜性較高，需要嚴格的實驗條件和專業的技術人員，這在一定程度上限制了其廣泛應用。

技術實現思路

1、本發明的目的是為了克服現有技術存在的缺點，提供一種在體外高效便捷地制備cullin1-rbx1?e3酶復合物的方法，將優化改造的cullin1-rbx1融合蛋白與skp1-skp2、cks1在反應體系中進行反應，得到e3連接酶復合物。

2、為了實現上述目的?，本發明提供原核表達高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復合物的方法，先分別對cullin1基因和rbx1基因進行結構優化，將cullin1和rbx1共表達，得到cullin1-rbx1融合蛋白，再將cullin1-rbx1融合蛋白與skp1-skp2、cks1在反應體系中進行反應，得到cullin1-rbx1?e3連接酶復合物；具體步驟如下：

3、（1）通過原核表達手段獲取cullin1-rbx1融合蛋白：

4、1）構建重組載體msyb-cullin1-rbx1-his：為了構建同時表達cullin1和rbx1的載體，首先對全長人類cullin1基因進行了密碼子優化，在其n端添加了msyb增溶標簽和hrv3c酶切位點，然后，將優化后的cullin1克隆到pet29a載體的第一個核糖體結合位點（rbs）后面；接著，對全長人類rbx1基因進行了密碼子優化，在其n端添加了6x?his標簽和hrv?3c酶切位點，并將其克隆到pet29a載體的第二個核糖體結合位點（rbs）后面，得到重組載體msyb-cullin1-rbx1-his；

5、2）融合蛋白cullin1-rbx1的表達：通過熱激法把得到的重組載體msyb-cullin1-rbx1-his轉化入大腸桿菌bl21（de3）中，在含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb平板上培養過夜，過夜培養后長出的菌落視為陽性菌落；

6、取含有重組質粒的陽性單菌落，接種到含有終濃度為50μg/ml卡那霉素的lb液體培養基中，37℃、200?rpm振蕩培養10?~?12h，按照體積比為1:50的比例將培養的菌液接種到新鮮的含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養基中，37℃、200rpm振蕩培養至菌液濃度od600在0.8?~?1.2，然后加入誘導物iptg（異丙基-β-d-硫代半乳糖苷）至工作濃度0.2?mm，繼續以16℃、180rpm的條件培養10-26h后，離心20min，收集并重懸菌體；

7、將離心收集的菌體，用50mm?hepes?150mm?nacl緩沖液（ph=7.5）重懸，加入pmsf（苯甲基磺酰氟）至工作濃度1mm，混勻，于冰上超聲破碎，超聲參數：功率100w，超聲3s，間隔6s，共40min；然后?4℃，12000rpm，離心30min，獲取含有蛋白的上清液；

8、3）融合蛋白cullin1-rbx1的純化：采用鎳柱純化，將獲取的上清液與鎳柱孵育后用20mm和300mm的咪唑洗雜和洗脫，收集洗脫液并用prescission蛋白酶裂解蛋白質以去除his標簽，將洗脫液在透析緩沖液（50?mm?mes，?50?mm?nacl，ph?6.5）中透析過夜；第二天再用0.22μm濾膜過濾上樣至用緩沖液（50mm?mes，ph?6.5）預平衡的source?s?10/300gl色譜柱中，線性梯度洗脫分離；得到純凈的cullin1-rbx1融合蛋白；利用此方法，每升菌可純化得到2毫克蛋白；

9、（2）cullin1-rbx1?e3連接酶的制備：

10、將蛋白成分接頭蛋白?skp1-skp2、cks1和cullin1-rbx1在反應體系中進行反應，反應條件為：冰上孵育一小時，得到cullin1-rbx1?e3連接酶復合物。

11、所述反應體系還含有50mm?hepes?150mm?nacl緩沖液(ph?7.5)，該體系中各物質的含量為：?1μm?skp1-skp2、1μm?cks1和1μm?cullin1-rbx1。

12、本發明與現有技術相比，在體外利用改造過的cullin1-rbx1e3融合蛋白高效便捷地制備出了cullin1-rbx1e3酶復合物；在cullin1的n端引入msyb標簽能夠提高蛋白質的溶解性，解決原核表達系統中cullin1難以折疊的問題；此外，通過將cullin1和rbx1共表達，使得cullin1和rbx1形成穩定的復合物，減少了各自單獨存在時的錯誤折疊和聚集；這些改進使得能夠在更短的時間內便捷而高效地表達和純化cullin1-rbx1融合蛋白，為后續的生化結構機制研究奠定了基礎；與昆蟲細胞表達系統需要接近一個月的時間相比，通過本發明所述方法的優勢在于能夠在一周內每一升菌便捷地獲取2mg?cullin1-rbx1融合蛋白，完全滿足相應生化特征，結構機制和活性分子篩選的需求；本發明制備cullin1-rbx1?e3連接酶復合物的方法簡單、高效，適于大規模推廣使用。

技術特征：

1.原核表達高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復合物的方法，其特征在于，具體步驟如下：

2.根據權利要求1所述的原核表達高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復合物的方法，其特征在于，所述反應體系還含有50mm?hepes?150mm?nacl緩沖液，該體系中各物質的含量為：?1μm?skp1-skp2、1μm?cks1和1μm?cullin1-rbx1。

3.根據權利要求1所述的原核表達高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復合物的方法，其特征在于，lb平板和lb液體培養基中卡那霉素的終濃度均為50μg/ml。

4.根據權利要求1所述的原核表達高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復合物的方法，其特征在于，步驟2）在振蕩培養的條件為：37℃、200?rpm。

5.根據權利要求1所述的原核表達高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復合物的方法，其特征在于，所述msyb的氨基酸序列如下所示：

6.根據權利要求1所述的原核表達高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復合物的方法，其特征在于，所述超聲破碎的參數為：功率100w，超聲3s，間隔6s，共40min。

技術總結
本發明屬于蛋白質純化技術領域，涉及原核表達高效獲取Cullin1?Rbx1?E3連接酶復合物的方法，將優化改造的Cullin1?Rbx1融合蛋白與Skp1?Skp2、Cks1在反應體系中進行反應，得到E3連接酶復合物；在Cullin1的N端引入MsyB標簽能夠提高蛋白質的溶解性，解決原核表達系統中Cullin1難以折疊的問題；將Cullin1和Rbx1共表達，減少各自單獨存在時的錯誤折疊和聚集；這些改進使得能夠在更短的時間內便捷高效地表達和純化Cullin1?RBX1融合蛋白，為后續的生化結構機制研究奠定了基礎；本發明制備E3連接酶復合物的方法簡單、高效，適于大規模推廣使用。

技術研發人員：李景虹,趙芳譽,李春瞳
受保護的技術使用者：青島大學
技術研發日：
技術公布日：2024/10/21