一種基于促凋亡肽KLA的多功能融合蛋白及在治療乳腺癌中的應(yīng)用

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體地，涉及一種基于促凋亡肽kla的多功能融合蛋白及在治療乳腺癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乳腺癌是最常見癌癥之一，也是女性癌癥死亡的主要原因。根據(jù)雌激素受體（estrogen?receptor，er）、孕激素受體（progesterone?receptor，pr）和人類表皮生長因子受體2（human?epithelial?growth?factor?receptor?2，her2）的表達(dá)不同，乳腺癌主要可分為er陽性、her2陽性和三陰性三類。乳腺癌主要以手術(shù)治療為主，輔以放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向治療，其中靶向治療在乳腺癌治療領(lǐng)域具有重要地位。當(dāng)前，針對(duì)her2蛋白的靶向治療主要以單克隆抗體為主，已開發(fā)出曲妥珠單抗等單克隆抗體用于臨床治療，在her2陽性乳腺癌患者中表現(xiàn)出良好的耐受性。但曲妥珠單抗具有心臟毒性等問題，因此需要進(jìn)一步開發(fā)其它具有選擇性的藥物來針對(duì)性的治療her2陽性乳腺癌。

2、近年來，利用基因工程技術(shù)重組表達(dá)的多功能融合蛋白在腫瘤靶向治療領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，在保留靶向藥物高選擇性以及低毒性等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，通過合理的設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)抑制以及在腫瘤部位特異性激活等功能，在乳腺癌治療領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。在多功能融合蛋白藥物中常用到各類對(duì)癌細(xì)胞有抑制作用的促凋亡肽，kla肽即為其中的代表之一，其具有廣泛的微生物抑制活性，且對(duì)腫瘤細(xì)胞也具有一定的殺傷作用，但其抗腫瘤活性低、不能跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)且缺乏靶向性，因此需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)和改造，包括連接細(xì)胞穿透肽或者作為多功能融合蛋白的組成部件等。另外，腫瘤部位異常表達(dá)的特定蛋白分子可以實(shí)現(xiàn)融合蛋白在特定位置的激活，其中mmp2即為最常用的蛋白，其在腫瘤組織中高度表達(dá)，可以特異性識(shí)別并切割特定的氨基酸序列，因此這種特定的氨基酸序列常在多功能融合蛋白中作為連接部件，介導(dǎo)融合蛋白在腫瘤部位被mmp2水解并發(fā)揮功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于當(dāng)前her2陽性乳腺癌治療不理想，本發(fā)明的目的是提供一種帶有her2陽性細(xì)胞靶向作用且可攜帶kla進(jìn)入癌細(xì)胞的多功能融合蛋白，以期該融合蛋白具有較高的抗her2陽性乳腺癌活性，包括能夠顯著抑制her2陽性乳腺癌細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)her2陽性乳腺癌細(xì)胞凋亡。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種基于促凋亡肽kla的多功能融合蛋白，其n端至c端依次主要由his標(biāo)簽、her2蛋白親和體、8個(gè)谷氨酸（8e）、基質(zhì)金屬蛋白酶2敏感切割序列、細(xì)胞穿透肽以及促凋亡肽kla組成，hmk融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.?1所示。

4、優(yōu)選地，所述細(xì)胞穿透肽由8個(gè)精氨酸（r8）組成。

5、優(yōu)選地，所述基質(zhì)金屬蛋白酶2敏感切割序列位于8個(gè)谷氨酸（8e）組成的聚陰離子序列以及細(xì)胞穿透肽之間。

6、優(yōu)選地，his標(biāo)簽、her2蛋白親和體以及基質(zhì)金屬蛋白酶2敏感切割序列之間通過gs連接肽連接。

7、進(jìn)一步地，所述gs連接肽是由ggggsgg?7個(gè)氨基酸構(gòu)成的柔性多肽。

8、第二方面，本發(fā)明提供一種核苷酸dna分子，其編碼上述的融合蛋白hmk。

9、優(yōu)選地，編碼融合蛋白hmk的核苷酸序列如seq?id?no.?2所示。

10、第三方面，本發(fā)明提供上述融合蛋白以及編碼基因在治療乳腺癌中的應(yīng)用。

11、進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為抑制乳腺癌特別是her2陽性乳腺癌的應(yīng)用，包括在抑制her2陽性乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)her2陽性乳腺癌細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明的有益效果：

13、1．本發(fā)明首次利用基因工程手段設(shè)計(jì)并構(gòu)建了hmk融合蛋白，并利用原核表達(dá)載體成功表達(dá)，且通過鎳柱親和層析獲得高活性和高純度的蛋白。

14、2．本發(fā)明所述融合蛋白hmk對(duì)her2陽性乳腺癌細(xì)胞的抑制活性最佳，且對(duì)正常乳腺上皮細(xì)胞mcf-10a的毒性較低，體現(xiàn)出較好的選擇性。

15、3．本發(fā)明所述融合蛋白hmk能明顯抑制her2陽性乳腺癌細(xì)胞的增殖，且能誘導(dǎo)her2陽性乳腺癌細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡，本發(fā)明所述融合蛋白hmk具備較好的抗乳腺癌活性，在乳腺癌特別是her2陽性乳腺癌的治療方面具備潛在的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種基于促凋亡肽kla的多功能融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白n端至c端依次由his標(biāo)簽、gs連接肽、her2蛋白親和體、gs連接肽、8個(gè)谷氨酸（8e）、基質(zhì)金屬蛋白酶2敏感切割序列、細(xì)胞穿透肽以及促凋亡肽kla組成；seq?id?no.?1為所述融合蛋白的氨基酸序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于促凋亡肽kla的多功能融合蛋白，其特征在于，所述細(xì)胞穿透肽由8個(gè)精氨酸組成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于促凋亡肽kla的多功能融合蛋白，其特征在于，所述基質(zhì)金屬蛋白酶2敏感切割序列位于8個(gè)谷氨酸（8e）以及細(xì)胞穿透肽之間。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于促凋亡肽kla的多功能融合蛋白，其特征在于，所述his標(biāo)簽、her2蛋白親和體以及8個(gè)谷氨酸（8e）之間通過gs連接肽連接。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于促凋亡肽kla的多功能融合蛋白，其特征在于，所述gs連接肽是由ggggsgg?7個(gè)氨基酸構(gòu)成的柔性多肽。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于促凋亡肽kla的多功能融合蛋白，其特征在于，seqid?no.?2為編碼融合蛋白的核酸序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的融合蛋白在治療乳腺癌中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，包括在抑制her2陽性乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)her2陽性乳腺癌細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種具有抗乳腺癌作用的融合蛋白，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的融合蛋白，N端至C端依次主要由His標(biāo)簽、可特異性結(jié)合HER2受體的HER2蛋白親和體、8個(gè)谷氨酸、基質(zhì)金屬蛋白酶2敏感切割序列、細(xì)胞穿透肽以及促凋亡肽KLA組成。本發(fā)明的融合蛋白對(duì)多種乳腺癌細(xì)胞系均具有抑制作用，其中對(duì)HER2陽性乳腺癌細(xì)胞SK?BR?3的抑制活性最高，而對(duì)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF?10A的毒性較低，表現(xiàn)出良好的選擇性，并且該融合蛋白能激活內(nèi)源性和外源性兩種凋亡通路誘導(dǎo)SK?BR?3細(xì)胞發(fā)生凋亡。本發(fā)明的融合蛋白具有潛在的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值，有望應(yīng)用于乳腺癌特別是HER2陽性乳腺癌的治療。

技術(shù)研發(fā)人員：劉姿,劉建,馬亮,胡俊峰,張世準(zhǔn),毛秀萍,常凱麗,黃國正
受保護(hù)的技術(shù)使用者：安徽工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/4