本發明涉及空氣中細菌檢測領域,具體涉及一種用于空氣中細菌檢測的探針及其制備方法和應用。
背景技術:
1、細菌感染已經成為威脅人類健康發展的重大疾病之一,導致了極高的死亡率和致殘率。研究表明,活動空間的大小、通風狀況、人流量、人員滯留時間、采光情況、人口密集程度等都是影響校園環境空氣微生物污染程度的因素。空氣中存在約1200種細菌和4萬多種真菌,流行性疾病的發生與空氣中的細菌濃度密切相關,過敏反應、呼吸道疾病、免疫力下降等相關疾病的發生也是由細菌濃度升高所造成的。空氣不僅是人們賴以生存的重要物質之一,也是傳染疾病的途徑之一。因此,研究空氣中細菌檢測方法具有重要價值。
技術實現思路
1、本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供一種用于空氣中細菌檢測的探針及其制備方法和應用。
2、為實現上述目的,本發明采取的技術方案為:一種用于空氣中細菌檢測的探針,所述探針的化學結構如式(ⅰ)所示,
3、式(ⅰ)。
4、上述的用于空氣中細菌檢測的探針與麥芽糖發生特異性識別結合,在用于空氣中細菌檢測的探針與麥芽糖的體系下,隨著麥芽糖含量的增大,在530~540nm范圍內的熒光強度響應值逐漸變小,且形成一定的映射函數關系。麥芽糖是細菌培養過程中會消耗的物質,細菌含量增多,麥芽糖含量減小,上述用于空氣中細菌檢測的探針與麥芽糖的結合減小,530~540nm范圍的熒光強度隨著細菌量的增多而增大,形成映射的函數關系,可以用于空氣中細菌檢測。
5、本發明還提供一種用于空氣中細菌檢測的探針的制備方法,所述制備方法包括以下步驟:以5(6)-fam5(6)-羧基熒光素和3-(氨甲基)苯硼酸鹽酸鹽進行氨基和羧基的酰胺化反應或成肽反應,提純。
6、上述制備方法,產率高,成本低。
7、優選地,所述制備方法包括以下步驟:
8、(1)將5(6)-fam5(6)-羧基熒光素加入ph4.5~7.2的磷酸鹽緩沖液中,加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(edc)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)于25~35℃下攪拌10~30分鐘;
9、(2)加入3-(氨甲基)苯硼酸鹽酸鹽并調節反應體系的ph為7~8攪拌反應2~5小時;
10、(3)純化產物。
11、上述制備方法,產率高,成本低。
12、優選地,步驟(3)中純化產物的方法為過非極性固相萃取柱純化,非極性固相萃取柱為c18萃取柱;洗脫溶劑為二甲基亞砜與正己烷的梯度溶劑或者二甲基亞砜與戊烷的梯度溶劑。
13、上述制備方法,產物純度高。
14、優選地,5(6)-fam5(6)-羧基熒光素與3-(氨甲基)苯硼酸鹽酸鹽的用量摩爾比為1:(2~2.5)。
15、優選地,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺的用量為40~80mg/ml反應溶液,n-羥基丁二酰亞胺的用量為為40~80mg/ml反應溶液。
16、本發明還提供一種用于空氣中細菌檢測的方法,所述方法包括以下步驟:
17、(1)將高壓滅菌后的培養基至于室內空氣中,對室內空氣進行采樣,暴露3~20min;
18、(2)在采樣后的細菌培養基中加入定量麥芽糖,35~38℃孵育15~30分鐘后,離心去除固體沉淀中可能含有的細菌并收集上清液;
19、(3)取定量上清液加入定量如式(ⅰ)所示用于空氣中細菌檢測的探針,檢測530~540nm內的熒光強度;
20、(4)分別將細菌分散在同步驟(1)相同的培養基中,細菌濃度為0?cfu/ml-1~1000cfu/ml-1的范圍內配置5~8個不同濃度的細菌培養基溶液,且包含空白細菌培養基,將5~8個不同濃度的細菌培養基溶液,依次按照步驟(1)~(3)進行處理,獲取細菌溶液濃度與530~540nm內熒光信號強度的映射關系;計算待測細胞制劑樣品中的細菌濃度。
21、上述檢測方法檢出限低,具有較高的靈敏度,具有較好的映射函數關系。
22、優選地,步驟(1)中,暴露3~10min,優選為暴露5分鐘。
23、優選地,所述步驟(2)中麥芽糖的濃度為10-2m~1m。
24、優選地,所述步驟(1)中,培養基的體積為5~25ml。優選地,培養基的體積為18~20ml。
25、優選地,步驟(3)中,如式(ⅰ)所示用于空氣中細菌檢測的探針的濃度為5×10-6m~5×10-5m。
26、本發明的有益效果在于:本發明提供了一種用于空氣中細菌檢測的探針及其制備方法和應用。本發明的用于空氣中細菌檢測的探針與麥芽糖發生特異性識別結合,在用于空氣中細菌檢測的探針與麥芽糖的體系下,隨著麥芽糖含量的增大,在530~540nm范圍內的熒光強度響應值逐漸變小,且形成一定的映射函數關系。麥芽糖是細菌培養過程中會消耗的物質,隨著細菌的增多,消耗的麥芽糖增多,麥芽糖含量減小,上述用于空氣中細菌檢測的探針與麥芽糖的結合減小,530~540nm范圍的熒光強度隨著細菌量的增多而增大,形成映射的函數關系,可以用于空氣中細菌檢測。
1.一種用于空氣中細菌檢測的探針,其特征在于,所述探針的化學結構如式(ⅰ)所示,
2.如權利要求1所述用于空氣中細菌檢測的探針的制備方法,其特征在于,所述制備方法包括以下步驟:以5(6)-fam5(6)-羧基熒光素和3-(氨甲基)苯硼酸鹽酸鹽進行氨基和羧基的酰胺化反應或成肽反應,提純。
3.如權利要求2所述用于空氣中細菌檢測的探針的制備方法,其特征在于,所述制備方法包括以下步驟:
4.根據權利要求3所述用于空氣中細菌檢測的探針的制備方法,其特征在于,步驟(3)中純化產物的方法為過非極性固相萃取柱純化,非極性固相萃取柱為c18萃取柱;洗脫溶劑為二甲基亞砜與正己烷的梯度溶劑或者二甲基亞砜與戊烷的梯度溶劑。
5.根據權利要求3所述用于空氣中細菌檢測的探針的制備方法,其特征在于,5(6)-fam5(6)-羧基熒光素與3-(氨甲基)苯硼酸鹽酸鹽的用量摩爾比為1:(2~2.5)。
6.根據權利要求3所述用于空氣中細菌檢測的探針的制備方法,其特征在于,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺的用量為40~80mg/ml反應溶液,n-羥基丁二酰亞胺的用量為為40~80mg/ml反應溶液。
7.一種用于空氣中細菌檢測的方法,其特征在于,所述方法包括以下步驟:
8.根據權利要求7所述用于空氣中細菌檢測的方法,其特征在于,所述步驟(2)中麥芽糖的濃度為10-2m~1m。
9.根據權利要求7所述用于空氣中細菌檢測的方法,其特征在于,所述步驟(1)中,培養基的體積為5~25ml。
10.根據權利要求7所述用于空氣中細菌檢測的方法,其特征在于,步驟(3)中,如式(ⅰ)所示用于空氣中細菌檢測的探針的濃度為5×10-6m~5×10-5m。