本發明屬于疾病的分子診斷,具體地說,是涉及一種慢性難愈合創面的診斷標志物及其應用。
背景技術:
1、慢性難愈合創面是指各種原因引起的經1個月以上治療未能愈合,也無愈合趨勢的創面。多發生于糖尿病、創傷、靜脈曲張、血管硬化、截癱長期臥床等嚴重慢性病和急性損傷患者,具有發病機制復雜、治療難度大、治療周期長、費用高等特點,嚴重影響人民群眾身心健康和生活質量。隨著人口老齡化和疾病譜的改變,除創傷、燒傷等引起的急性創面外,各種疾病導致的體表慢性難愈合創面患者數量逐年增加。
2、針對難愈合創面的新藥開發需要合適的動物模型。構建穩定的、具有明確成模標準的動物模型是保證新藥研發順利實施的基礎條件之一。目前,糖尿病難愈性創面的構建方法有很多種,但缺乏統一的規范。共同點是都需要經歷糖尿病模型的構建和創面模型的構建兩個步驟。糖尿病模型的構建方法成熟,而創面模型的構建方法較多,分為物理方法(包括全層皮膚切除法、皮膚磁片壓迫法、動脈結扎離斷法等),細菌感染(包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌等),藥物抑制免疫功能等。
3、對于物理方法產生的創面,以皮膚出現潰瘍作為模型成功的標準,這樣的創面通常為非難愈性傷口。對于細菌感染的創面,以創面染菌后局部分泌物菌培養中檢測出不耐藥細菌代表建模成功。而通過藥物抑制免疫功能,延緩傷口愈合的進程無有效的評價指標來證明造模成功,盡管有文獻支持免疫抑制會導致傷口愈合延遲。這些評價指標與創面是否為難愈性創面沒有必然的聯系,無法反映大鼠自身傷口愈合能力的受損。
4、在臨床實踐中,對傷口的愈合能力進行評估和預測,有助于合理安排醫療衛生資源和決定適宜治療策略、以及引入輔助治療的時機。對于患者來說,盡早判斷出創口類型有利于快速得到妥善處理,節省治療支出,早日回歸正常生活。
5、另外,目前針對促進難愈合創面愈合藥物的臨床前效果評價包括新生血管生成、再上皮化水平、上皮組織厚度、肉芽組織厚度、膠原纖維或膠原蛋白水平、炎癥水平等多方面,但這些指標在傷口愈合過程中處于下游水平。對于藥物的開發來說,需要尋找更有效、在傷口愈合過程中處于更上游位置的指標作為評價指標,對于尋找藥物作用的靶點、提高藥品開發的成功率具有巨大意義。
技術實現思路
1、本發明以大鼠作為對象,通過stz腹腔注射、燙傷操作、全層皮膚切除和金黃色葡萄球菌感染這四種措施進行難愈性傷口的構建,以及調整四種措施的實施條件和實施時間,最終獲得大鼠的慢性難愈合創面模型。與普通燙傷相比,在感染后8天內出現傷口面積增大的趨勢,且傷口愈合率較對照組低。本造模方法具有成功率高,模型穩定的特點。
2、免疫印跡法檢測大鼠的慢性難愈合創面模型的皮膚組織中干細胞標志分子的表達水平,發現與對照組相比,sox-9、cd34、keratin?14的表達量顯著下降,因此,對sox-9、cd34、keratin?14的表達量檢測可用于實現慢性難愈合創面的診斷,sox-9、cd34、keratin14可作為慢性難愈合創面的診斷標志物。
3、此外,本發明還提供了一個可定性評價傷口愈合潛能的指標。通過免疫印跡的方法檢測大鼠的慢性難愈合創面模型的皮膚組織中干細胞標志分子(sox-9、cd34、keratin14)的表達水平,來反映大鼠自身傷口愈合的能力,sox-9、cd34、keratin14的表達水平低,則說明傷口愈合難度大,反之,傷口愈合難度小。該評價方法簡便、易操作,生物學特性穩定,具有重要的市場價值和社會價值。
4、對傷口的愈合能力進行評估和預測,有助于合理安排醫療衛生資源和決定適宜治療策略、以及引入輔助治療的時機。對于患者來說,盡早判斷出傷口類型有利于快速得到妥善處理,節省治療支出,早日回歸正常生活。
5、本發明還提供了一種評價藥物對難愈性傷口治療效果的指標。傷口愈合這一過程涉及到免疫細胞、成纖維細胞、干細胞等多種細胞的遷移、增殖和信息交流,是一系列的生物學事件,需要消耗大量的能量。線粒體是能量代謝的中心,為了提供能量,增加線粒體的數量和新陳代謝是至關重要的。通過多種手段對線粒體功能狀態(透射電鏡直接觀察線粒體數量、免疫組織化學定性和定量檢測線粒體標志分子tom20的水平、免疫印跡定量檢測線粒體標志分子tom20的水平)進行評價,來反映藥物促傷口愈合效果,對于靶向線粒體藥物的開發具有指導意義。線粒體功能狀態可在評估藥物對難愈性傷口治療效果中作為檢測靶點應用。
6、本發明以大鼠作為對象,通過stz腹腔注射、燙傷操作和金黃色葡萄球菌感染這四種措施進行難愈性傷口的構建,調整四種措施的實施條件和實施時間,最終獲得大鼠難愈性傷口模型。具有建立周期短,成功率高的特點,且在建模過程中,條件易控制,具有重要的市場價值和社會價值。
7、本發明引入了慢性難愈合創面模型成功與否的評價指標和引入了用線粒體功能狀態評價傷口愈合能力的方法。與現有技術相比,本發明能夠定性地對慢性難愈合創面在診斷、治愈效果等方面做出可靠評價。
1.慢性難愈合創面的診斷標志物,其特征在于,包括sox-9、cd34、keratin?14中的任意一種或多種。
2.如權利要求1所述的慢性難愈合創面的診斷標志物在制備慢性難愈合創面的診斷試劑/試劑盒中的應用,所述慢性難愈合創面的診斷標志物包括sox-9、cd34、keratin?14中的任意一種或多種。
3.如權利要求2所述的應用,其特征在于,所述診斷標志物選自創面區域皮膚組織。
4.一種慢性難愈合創面的診斷試劑,其特征在于,包括用于檢測權利要求1中所述的慢性難愈合創面的診斷標志物的檢測試劑,所述慢性難愈合創面的診斷標志物包括sox-9、cd34、keratin?14中的任意一種或多種。
5.如權利要求4所述的診斷試劑,其特征在于,所述檢測試劑檢測sox-9、cd34、keratin14中的任意一種或多種的基因表達量;
6.如權利要求1所述的慢性難愈合創面的診斷標志物的檢測試劑在制備慢性難愈合創面診斷試劑/試劑盒中的應用;所述慢性難愈合創面的診斷標志物包括sox-9、cd34、keratin?14中的任意一種或多種;
7.一種傷口愈合能力評價標志物,其特征在于,包括sox-9、cd34、keratin?14中的任意一種或多種;檢測sox-9、cd34、keratin?14表達量評價傷口愈合能力。
8.如權利要求7中的標志物,其特征在于,檢測試劑檢測sox-9、cd34、keratin14中任意一種標志物表達量低,則傷口愈合能力強;
9.一種評價藥物對慢性難愈合創面的治療效果的檢測標志物,其特征在于,包括體現傷口區域皮膚組織中線粒體功能狀態的指標,包括線粒體數量、線粒體標志分子tom20中的至少一種。
10.如權利要求9所述的檢測標志物在在評估藥物對慢性難愈合創面治療效果中的應用。