本發明屬于動物細胞生物學,尤其涉及一種葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型及其建立方法和應用。
背景技術:
1、近十年來,類器官技術作為一個整體技術領域系統地在生物學、醫學等多個研究學科得以應用,基于其自組織能力,收獲具有誘導形成多功能器官能力的干細胞,可以體外形成結構和功能與體內對應物相似的3d結構。在營養對腸道健康影響領域相關研究中,類器官模型與多個學科交叉應用發揮作用。類器官最顯著的特點是具有強大的自我更新能力,不僅在細胞譜系組成上與腸上皮組織高度相似,其功能特性也與來源組織保持高度一致。
2、目前基于嚙齒類動物、犬等動物模型開展腸道營養生物學的研究已取得重大進展,但依然存在一些技術上的局限性。由于上述動物與人類之間,在解剖結構和生理特性方面存在明確差異而限制了這些模型的應用。例如小鼠模型缺乏代表人類胃腸道疾病的關鍵臨床癥狀和病理變化,從而限制了用小鼠為模型開展臨床營養學研究;犬類由于社會倫理問題,在相關研究中的使用也被廣泛限制。相比較而言,豬與人類有多個共同的特征,例如相似的營養需求、相近的代謝過程、相應的免疫功能,并且豬在胃腸道解剖和生理上表現出與人類相似的結構。因此,豬小腸類器官具有上述體內外研究模型的優勢。
3、雖然,腸道類器官3d培養模型是研究組織成體干細胞生長、分化以及器官形成的新興體外研究系統,是腸道生物學研究領域里程碑式的研究成果,但是該培養方法形成的類器官在一些模擬真實腸道環境的應用中仍然存在一定的不足。這是因為腸道類器官3d培養物由于其腸腔面被包裹在球形結構的腔體內側,阻礙了其與外界環境的接觸,導致對腸道營養健康的研究受阻。此外,3d培養類器官的內腔會積聚來自細胞更新的碎片,其可阻礙注射物質與頂膜的相互作用,從而對整個類器官的培養造成影響。因此,優化培養程序并形成更方便操作的體外類器官應用模型具有一定現實意義,也正是本文所解決的技術問題之一。
4、有研究表明葡聚糖硫酸鈉(dss)在典型的仔豬中持續應用3-15天可誘發結腸炎,dss也可用于豬小腸類器官損傷模型的建立。dss是由蔗糖合成的肝素樣硫酸多糖體,在誘導腸道炎癥中具有重要的作用。化學誘導的腸道炎癥模型是最常用的炎性損傷模型,且dss對腸道屏障的破壞作用已有很多文獻報道,但利用dss誘導建立豬小腸類器官的損傷模型方法目前沒有形成完整體系。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題,本發明提出了一種葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型及其建立方法和應用,本發明提出的小腸類器官2d模型使生物活性物質的功能性研究更加符合真實生理情況,能為高通量的營養素篩選和生物活性物質功能鑒定提供更為簡易、方便的操作,彌補了3d腸道類器官腸腔面無法與培養環境直接接觸,導致對腸道營養與健康相關研究可行性差的問題。
2、為實現上述目的,本發明提供了一種葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型的建立方法,包括以下步驟:
3、(1)基質膠(matrigel)與預冷處理后的pbs以體積比1:20混合,得基質膠溶液;
4、(2)于細胞培養板中依次加入步驟(1)所得基質膠溶液和pbs,第一靜置培養,吸出pbs,得預處理細胞培養板;
5、(3)向步驟(2)所得預處理細胞培養板中再次加入pbs,第二靜置培養,再次吸出pbs,重復3次,得基質膠包被的細胞培養板;
6、(4)豬小腸類器官單細胞懸液加入步驟(3)所得基質膠包被的細胞培養板中,細胞培養,得豬小腸類器官2d培養物;
7、(5)取步驟(4)所得豬小腸類器官2d培養物置于添加葡聚糖硫酸鈉(dss)的培養液中,誘導培養12h,得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型。
8、優選的,步驟(1)中所述預冷處理為在4℃靜置處理12~24h。
9、優選的,步驟(2)中所述細胞培養板為48孔細胞培養板。
10、優選的,步驟(2)中所述基質膠溶液與pbs等體積加入。
11、優選的,步驟(2)中所述第一靜置培養的溫度為37℃,所述第一靜置培養的環境中co2的體積分數為5%,所述第一靜置培養的時間為2h。
12、優選的,步驟(3)中所述再次加入pbs的用量與步驟(2)中pbs的用量相同,步驟(3)中所述第二靜置培養的溫度為37℃,所述第二靜置培養的環境中co2的體積分數為5%,所述第二靜置培養的時間為5min。
13、優選的,步驟(4)中所述豬小腸類器官單細胞懸液的濃度為104/ml,所述豬小腸類器官單細胞懸液的用量與步驟(2)中基質膠溶液的用量相同;步驟(4)中所述細胞培養的溫度為37℃,所述細胞培養的環境中co2的體積分數為5%,所述細胞培養的時間為2~4d。
14、優選的,步驟(5)中所述添加葡聚糖硫酸鈉的培養液中葡聚糖硫酸鈉的濃度為100~400μmol/l;步驟(5)中所述誘導培養的溫度為37℃,所述誘導培養的環境中co2的體積分數為5%。
15、優選的,步驟(5)中所述培養液以dmem/f12培養液為基礎,添加fbs和anti-anti。
16、本發明還提供了所述建立方法建立所得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型。
17、本發明還提供了所述建立方法建立所得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型或所述葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型在制備治療、檢測或預測豬小腸炎癥疾病產品中的應用。
18、與現有技術相比,本發明具有如下優點和技術效果:
19、本發明利用細胞2d培養有效減小3d培養過程中由于內腔積聚的碎片阻礙注射物質與頂膜相互作用的影響,提供的小腸類器官2d模型使生物活性物質的功能性研究更加符合真實生理情況,能為高通量的營養素篩選和生物活性物質功能鑒定提供更為簡易、方便的操作,彌補了3d腸道類器官腸腔面無法與培養環境直接接觸,導致對腸道營養與健康相關研究可行性差的問題。提供一種豬小腸類器官2d損傷模型的建立方法,采用matrigel鋪膠法建立豬小腸類器官2d模型,利用葡聚糖硫酸鈉刺激形成豬小腸類器官2d損傷模型。
1.一種葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型的建立方法,其特征在于,包括以下步驟:
2.根據權利要求1所述建立方法,其特征在于,步驟(1)中所述預冷處理為在4℃靜置處理12~24h。
3.根據權利要求1所述建立方法,其特征在于,步驟(2)中所述細胞培養板為48孔細胞培養板。
4.根據權利要求1所述建立方法,其特征在于,步驟(2)中所述基質膠溶液與pbs等體積加入。
5.根據權利要求1所述建立方法,其特征在于,步驟(2)中所述第一靜置培養的溫度為37℃,所述第一靜置培養的環境中co2的體積分數為5%,所述第一靜置培養的時間為2h。
6.根據權利要求1所述建立方法,其特征在于,步驟(3)中所述再次加入pbs的用量與步驟(2)中pbs的用量相同,步驟(3)中所述第二靜置培養的溫度為37℃,所述第二靜置培養的環境中co2的體積分數為5%,所述第二靜置培養的時間為5min。
7.根據權利要求1所述建立方法,其特征在于,步驟(4)中所述豬小腸類器官單細胞懸液的濃度為104/ml,所述豬小腸類器官單細胞懸液的用量與步驟(2)中基質膠溶液的用量相同;步驟(4)中所述細胞培養的溫度為37℃,所述細胞培養的環境中co2的體積分數為5%,所述細胞培養的時間為2~4d。
8.根據權利要求1所述建立方法,其特征在于,步驟(5)中所述添加葡聚糖硫酸鈉的培養液中葡聚糖硫酸鈉的濃度為100~400μmol/l,步驟(5)中所述誘導培養的溫度為37℃,所述誘導培養的環境中co2的體積分數為5%。
9.如權利要求1~8任一項所述建立方法建立所得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型。
10.如權利要求1~8任一項所述建立方法建立所得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型或權利要求9所述葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型在制備治療、檢測或預測豬小腸炎癥疾病產品中的應用。