(一)本發明屬于微生物,具體涉及一株大腸桿菌nh3及其在水解結合態膽紅素為游離態膽紅素中的應用。
背景技術:
0、(二)背景技術
1、牛黃是在黃牛、水牛或耗牛的膽囊、膽管中形成的膽紅素鈣結石,屬于病理性產物。牛黃歷來是一種極其名貴的中藥材,具有清心、豁痰、開竅、涼肝、息風和解毒之功效。我國傳統中藥中,約有100多種中成藥使用了牛黃,如安宮牛黃丸、牛黃清心丸、西黃丸、牛黃上清丸和牛黃解毒丸等。天然牛黃在牛群中的發生頻率僅為0.21%,一般發生于以畜力為養殖目的的老牛病牛體內,所以牛黃資源歷來非常稀缺。隨著全球農業機械化的發展,以畜力為目的養牛越來越少,天然牛黃產量逐年減少。國內牛黃產量已遠遠不能滿足醫藥市場需求,目前,天然牛黃的市場價格每公斤超過150萬元人民幣。2024年7月1日,中國國家藥監局綜合司和海關總署辦公廳發布公開征求《關于允許進口牛黃試點用于中成藥生產有關事項的公告(征求意見稿)》,允許進口牛黃用于中成藥生產。即便如此,國內市場上的天然牛黃仍然供不應求,價格逐年走高。
2、我國在上個世紀70年代成功研制出人工合成牛黃和體外培育牛黃,并廣泛應用于許多中藥配方,但由于這兩種牛黃的成分以及功效與天然牛黃相差甚遠,無法替代天然牛黃。為了克服體外培育牛黃的不足,我國在上世紀80年代就嘗試了人工體內培植牛黃,該技術是通過外科手術,在活牛的膽囊內植入異物,并注射特定的細菌,從而在異物和細菌的刺激下,以植入物為核心逐漸形成牛黃。人工植入異物和菌種只是觸發牛黃形成的開始,體內培植牛黃的形成的環境和過程與天然牛黃相同,因此其成分和功效與天然牛黃接近。人工體內培植牛黃技術不僅能夠解決天然牛黃資源匱乏的問題,還能通過標準化的操作提高牛黃的質量。雖然人工體內培植牛黃技術在上世紀80年代就有推廣,但由于技術不夠成熟、成黃率低和質量不穩定,之后并沒有得到推廣應用。
3、天然牛黃形成是一個比較復雜的化學和物理過程,包括三個階段,即膽汁成分改變導致膽紅素鹽的析出的化學階段、核心框架凝集成形的物理階段和膽汁中析出成分在雛形牛黃上逐層沉積的生長階段。目前普通認為,在膽汁成分改變導致膽紅素鹽析出的化學階段,一些革蘭氏陰性菌,特別是大腸桿菌在膽囊中生長繁殖起到關鍵作用,大腸桿菌釋放的β-葡萄糖醛酸苷酶作用于膽汁中結合態膽紅素(膽紅素二葡萄糖醛酸苷)的糖苷鍵,生成游離態膽紅素和葡萄糖醛酸,游離態膽紅素的羧基與鈣離子結合,形成膽紅素鈣沉淀,再與蛋白質、膽固醇、膽酸等物質反復積聚而形成結石。據此原理,在人工體內培植牛黃過程中,植入高活性β-葡萄糖醛酸苷酶的大腸桿菌,是觸發牛黃形成的關鍵。
4、在以往的體內培植牛黃的操作中,對植入的大腸桿菌要求不高,多數是產酶活性低或耐受膽汁生長差的野生菌株,甚至使用未經分離純化的牛糞濾液,也有使用經過耐受膽汁生長馴化的菌株,但是β-葡萄糖醛酸苷酶活性不高,不能快速有效地將膽汁中結合態膽紅素水解成游離態膽紅素析出而觸發牛黃形成,隨著膽汁流動,植入的大腸桿菌也逐漸減少,致使人工體內培植牛黃失敗。
5、為了解決人工體內培植牛黃中植入牛膽囊中的大腸桿菌β-葡萄糖醛酸苷酶活性不高、膽汁環境耐受性差的問題,需要篩選一種產酶活性高、膽汁耐受性強的新菌株。
技術實現思路
0、(三)
技術實現要素:
1、本發明目的是提供一株β-葡萄糖醛酸苷酶活性高、耐受牛膽汁生長的微生物新菌株—大腸桿菌(escherichia?coli)nh3及其在水解結合態膽紅素為游離態膽紅素中的應用,本發明對從牛糞中分離的大腸桿菌進行誘變育種,提高其產酶活性,并對其做耐受膽汁生長的馴化,得到一株β-葡萄糖醛酸苷酶活性高、耐受膽汁生長性強的大腸桿菌,可以水解牛膽汁中結合態膽紅素為游離態膽紅素,因此既可以用作體外培育牛黃的轉化菌種,也可以用作人工體內培植牛黃的植入菌種。
2、本發明采用的技術方案是:
3、本發明提供一株新的微生物菌株—大腸桿菌(escherichia?coli)nh3,保藏于廣東省微生物菌種保藏中心,保藏編號:gdmcc?no:64862,保藏日期2024年7月11日,地址:廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓;郵編:510075。
4、本發明所述大腸桿菌nh3,是從新鮮牛糞中分離,經過誘變、牛膽汁耐受性馴化得到的優良菌株。所述大腸桿菌nh3的形態特征如下:接種于lb平板培養基上,于37℃培養24h,形成直徑0.3–0.5cm的菌落,菌落圓形,邊緣整齊,乳白色。菌體呈短桿狀,大小約0.5–0.8μm×1.0–2.0μm,革蘭氏染色陰性,不形成芽孢。在麥康凱培養基上菌落呈桃紅色,形態與在lb平板培養基上相似,周圍有膽鹽沉淀環。所述大腸桿菌nh3的16s?rdna的部分核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
5、本發明還提供一種所述大腸桿菌nh3在水解結合態膽紅素為游離態膽紅素中的應用,所述的應用是將大腸桿菌nh3經培養后獲得的菌液,接種于牛膽汁或牛膽粉水溶液中,于37–40℃、100–150r/min振蕩條件下培養15–20h,將牛膽汁或牛膽粉中結合態膽紅素水解為游離態膽紅素。
6、進一步,所述菌液培養方法為:將甘油水溶液凍存的大腸桿菌nh3,按體積分數1%–2%的接種量,接種到lb液體培養基中,35–37℃、150–200r/min搖床中培養12–16h,得到od600=2.36–2.78的菌液。所述的lb液體培養基終濃度組成為:蛋白胨10g/l,酵母浸粉5g/l,nacl?10g/l,溶劑為去離子水,ph?7.0–7.2,121℃高壓蒸汽滅菌20min。所述的甘油水溶液凍存的大腸桿菌nh3,是該菌株在lb液體培養基中,37℃、180r/min培養12–18h后,與體積濃度為40%的甘油水溶液等體積混合,保藏于–80℃冰箱。
7、進一步,大腸桿菌nh3菌液接種于牛膽汁或牛膽粉水溶液的體積接種量是4–6%。所述牛膽粉水溶液質量濃度為5-6%,所述牛膽汁水溶液體積濃度為20-100%。
8、本發明還提供所述大腸桿菌nh3在制備人工體內培植牛黃的微生物菌劑中的應用,所述菌劑釋放的β-葡萄糖醛酸苷酶作用于膽汁中結合態膽紅素的糖苷鍵,生成游離態膽紅素。
9、與現有技術相比,本發明有益效果主要體現在:
10、本發明提供一株大腸桿菌nh3,具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性高、牛膽汁耐受性強的特點。該菌株是從牛糞中分離,經過紫外線、微波和等離子連續誘變,β-葡萄糖醛酸苷酶活性較野生菌株提高了2.75倍,經過牛膽汁耐受性馴化而來,能夠在耐受高濃度膽汁環境,將牛膽汁中結合態膽紅素水解形成游離態膽紅素。該菌株既可以用作體外培育牛黃的轉化菌種,也可以用作人工體內培植牛黃中的植入菌種,克服人工體外培育或體內培植牛黃過程中,菌體在牛膽汁中存活時間短、牛黃形成效率低的問題。
1.大腸桿菌(escherichia?coli)nh3,保藏于廣東省微生物菌種保藏中心,保藏編號:gdmcc?no:64862,保藏日期2024年7月11日,地址:廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓;郵編:510075。
2.一種權利要求1所述大腸桿菌nh3在水解結合態膽紅素為游離態膽紅素中的應用。
3.如權利要求2所述的應用,其特征在于,所述的應用是將大腸桿菌nh3經培養后獲得的菌液,接種于牛膽汁或牛膽粉水溶液中,于37–40℃、100–150r/min振蕩條件下培養15–20h,將牛膽汁或牛膽粉中結合態膽紅素水解為游離態膽紅素。
4.如權利要求3所述的應用,其特征在于,所述菌液培養方法為:將甘油水溶液凍存的大腸桿菌nh3,按體積分數1%–2%的接種量,接種到lb液體培養基中,35–37℃、150–200r/min搖床中培養12–16h,得到od600=2.36–2.78的菌液。
5.如權利要求3所述的應用,其特征在于,大腸桿菌nh3菌液接種于牛膽汁或牛膽粉水溶液的體積接種量是4–6%。
6.如權利要求3所述的應用,其特征在于,所述牛膽粉水溶液質量濃度為5-6%,所述牛膽汁水溶液體積濃度為20-100%。
7.一種權利要求1所述大腸桿菌nh3在制備人工體內培植牛黃的微生物菌劑中的應用。