本發明涉及一種酶制劑的制備方法,尤其是一種固定化蛋白質谷氨酰胺酶(pgase)復合微球制劑的制備方法。
背景技術:
1、蛋白中富含谷氨酰胺殘基,它們通過疏水或氫鍵相互作用誘導蛋白質的聚集和沉淀,使其溶解度降低,而低溶解度會影響蛋白質的其他加工特性(如起泡性、乳化性和穩定性等)和消化吸收特性,限制了蛋白在食品產業中的應用。采用物理法和化學法對蛋白質脫酰存在隨機性和安全性低等問題,而酶法脫酰胺則具有安全高效的優點。蛋白質谷氨酰胺酶(pgase)是一種新型食品工業用酶,它具有很好的脫酰胺作用,且只對蛋白質及大分子多肽的谷氨酰胺殘基起作用而不引起蛋白質的交聯和水解,目前已廣泛應用于蛋白的改性。
2、然而,游離的pgase酶易出現團聚和自脫酰胺,導致酶活性低、穩定性差,且價格昂貴、不能重復使用,進而限制了pgase酶在食品工業中應用。酶固定化是提高酶穩定性和使用效率、降低成本的關鍵技術之一,但目前對于pgase酶的固定化研究鮮有報道。此外,對于固定化蛋白酶而言,酶分子和作用底物都是蛋白大分子,由于存在結構變化、位阻效應、分配效應以及擴散限制等,都會導致固定化酶的活力損失,如何提高固定化酶的活力是該技術中的瓶頸難題。
3、我們前期研究發現花粉壁微凝膠可以提高pgase酶的活性,從微觀結構上看,花粉壁微凝膠具有大量微米級孔洞結構,可以為pgase酶的附著提供天然的空間,有效解決了傳質阻力過大或過小的問題;從化學組成上看,花粉壁微凝膠上含有較多的羥基和羧基等基團,可以為pgase酶提供天然的附著位點,避免了復雜的載體修飾可能對酶分子產生的不利影響。基于此,本發明利用花粉壁微凝膠并對其進行改造,獲得價廉、高效的天然生物質固定化pgase酶,從而提高pgase酶的產業應用能力。
技術實現思路
1、本發明的目的是提供一種基于花粉壁微凝膠的復合微球固定化pgase酶(負載pgase酶的花粉壁復合凝膠微球)的制備方法,主要是為了達到方便使用和重復回收的目的,其次是為了進一步提高酶活。
2、為實現上述目的,本發明使用了以下技術方案:
3、一種復合微球固定化蛋白質谷氨酰胺酶的制備方法,包括以下步驟:
4、s1,將向日葵花粉水洗干凈后進行脫脂、堿解,使花粉水合并溶脹形成多孔結構的花粉壁微凝膠;
5、s2,配制海藻酸鈉水溶液,將花粉壁微凝膠與海藻酸鈉水溶液混合,以cacl2為交聯劑制備復合空白微球;
6、s3,用edc/nhs對復合空白微球進行活化;
7、s4,將活化后的復合空白微球加入到蛋白質谷氨酰胺酶溶液中,恒溫搖床震蕩并對溶液進行抽真空處理,過濾,洗滌后得到復合微球固定化蛋白質谷氨酰胺酶。
8、其中,所述海藻酸鈉水溶液的濃度為1-5%(質量),優選3%。
9、其中,所述花粉壁微凝膠與海藻酸鈉水溶液的體積比為0.5-3:1,優選2:1。
10、其中,所述cacl2的濃度為0.5-5%(質量)。
11、其中,所述edc/nhs混合溶液的濃度為0.025-0.25%(質量),優選0.05%,即100g溶液中含edc、nhs各0.05g。
12、其中,所述活化的溫度是20-40℃。
13、其中,所述搖床震蕩的溫度為30-50℃,轉速為100-500rpm,時間為1-5h。
14、優選地,所述搖床震蕩的溫度為35℃,轉速為200rpm,時間為3h。
15、本發明的有益效果是:
16、本發明制備的具有很高的負載量和催化脫酰胺活性,能應用于各種蛋白的改性以提高蛋白的加工特性。在對蛋白進行改性時,將固定化pgase直接加入到配好的蛋白溶液中,操作非常方便,并且能通過離心、過濾等方式對固定化pgase進行重復回收。本發明制備固定化pgase還易于儲藏和運輸,從而更好地滿足使用需求。
17、本發明將花粉壁微凝膠與海藻酸鈉凝膠復配作為微球芯材,克服了花粉壁微凝膠無法交聯固化成型的缺陷,充分利用了海藻酸鈉的凝膠特性提高了pgase的重復使用性,并且所加入的海藻酸鈉不影響花粉壁對pgase的吸附,使產品具有較高的負載率和酶活。本發明使用物理吸附+化學交聯的方式對pgase進行負載,相較常規的包埋工藝或化學交聯工藝具有更高的酶學性能。
18、本發明使用的原材料均為價廉、天然的生物質材料,具有很高的安全性,在蛋白產業應用方面具有很高的潛力。
1.一種復合微球固定化蛋白質谷氨酰胺酶的制備方法,其特征在于包括以下步驟:
2.如權利要求1所述的復合微球固定化蛋白質谷氨酰胺酶的制備方法,其特征在于:所述海藻酸鈉水溶液的濃度為1-5%,優選3%。
3.如權利要求1所述的復合微球固定化蛋白質谷氨酰胺酶的制備方法,其特征在于:所述花粉壁微凝膠與海藻酸鈉水溶液的體積比為0.5-3:1,優選2:1。
4.如權利要求1所述的復合微球固定化蛋白質谷氨酰胺酶的制備方法,其特征在于:所述cacl2的濃度為0.5-5%。
5.如權利要求1所述的復合微球固定化蛋白質谷氨酰胺酶的制備方法,其特征在于:所述edc/nhs混合溶液的濃度為0.025-0.25%,優選0.05%。
6.如權利要求1所述的復合微球固定化蛋白質谷氨酰胺酶的制備方法,其特征在于:所述活化的溫度是20-40℃。
7.如權利要求1所述的復合微球固定化蛋白質谷氨酰胺酶的制備方法,其特征在于:所述搖床震蕩的溫度為30-50℃,轉速為100-500rpm,時間為1-5h。
8.如權利要求7所述的復合微球固定化蛋白質谷氨酰胺酶的制備方法,其特征在于:所述搖床震蕩的溫度為30℃,轉速為200rpm,時間為3h。