本發明屬于分子生物學,更具體地,本發明涉及一種檢測dnmt3a基因r882h突變的crrna、試劑盒及方法。
背景技術:
1、急性髓系白血病(acute?myeloid?leukemia,aml)是一類嚴重危害人類健康的異質性血液系統惡性腫瘤,發病率占我國成人白血病首位。dna甲基化轉移酶3a(dnamethyltransferase?3a)位于人類2號染色體短臂2區3帶(2q23),是重要的甲基化轉移酶之一,主要負責基因組dna從頭甲基化。dnmt3a的突變會導致dna的異常甲基化,而dna異常的甲基化將通過影響染色體結構穩定性和dna復制、重組與修復,從而促發腫瘤惡性克隆的發生與快速擴增。
2、有研究表明,dnmt3a突變型在成人aml患者中約占20%,其中60%是r882位點突變,且最常見的是r882h突變,是患者分層治療和預后不良的重要分子生物學標志。另外,與野生型的dnmt3a的aml患者相比,dnmt3a基因突變患者往往為正常核型,因此,檢測dnmt3a基因的突變位點可以作為識別正常核型aml患者的預后指標。
3、目前dnmt3a基因r882h突變的檢測方法中,sanger測序技術是經典方法,但靈敏度較低,檢測低頻率突變時容易出現假陰性;熒光原位雜交技術(fish)和基因芯片等技術操作復雜;而ngs技術雖然可以定性和定量檢測,但是檢測時間長,操作復雜,費用較高,且對于低頻率突變數據量要求高。
4、因此,需要一種低成本、操作簡便、同時具備高靈敏度、高特異性的dnmt3a基因r882h突變的檢測方法。
技術實現思路
1、基于此,本發明的目的在于提供一種檢測dnmt3a基因r882h突變的crrna、試劑盒及方法,利用包括crrna的試劑盒對待測樣本進行檢測,可以高靈敏度、高特異性地區分dnmt3a基因野生型和dnmt3a基因r882h突變型。
2、實現上述發明目的的技術方案包括如下。
3、本發明的第一方面,提供了一種檢測dnmt3a基因r882h突變的crrna,所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。
4、本發明的第二方面,提供了一種檢測dnmt3a基因r882h突變的試劑盒,所述試劑盒包括上述crrna、以及擴增引物,所述擴增引物包括序列如seq?id?no:4所示的正向引物和序列如seq?id?no:5所示的反向引物。
5、本發明的第三方面,提供了一種檢測dnmt3a基因r882h突變的方法,使用上述試劑盒進行檢測,包括以下步驟:使用所述擴增引物分別對待測樣本骨髓穿刺物的基因組dna和健康人基因組dna進行pcr擴增后,對pcr擴增產物進行crispr/cas12酶切反應,再讀取熒光值。
6、在本發明中,基于pcr-crispr/cas12a系統,設計了針對dnmt3a基因r882h突變檢測的crrna,并在crrna上特定位置引入了1個錯配堿基,同時通過在pcr擴增引物的正向引物中引入錯配堿基的方式引入tttv的pam位點,解決靶標突變位點處無pam區問題;在此構思下,利用本發明設計的crrna和pcr擴增引物,對待測樣本骨髓穿刺物進行檢測,可以高靈敏度(最低檢測限可達10copies/μl)、高特異性(可檢出突變頻率為0.1%低豐度突變型樣本)地區分dnmt3a基因野生型和r882h突變型,且本發明的檢測方法成本低,操作簡單。
1.一種檢測dnmt3a基因r882h突變的crrna,其特征在于,所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。
2.一種檢測dnmt3a基因r882h突變的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括權利要求1所述的crrna、以及擴增引物,所述擴增引物包括序列如seq?id?no:4所示的正向引物和序列如seq?id?no:5所示的反向引物。
3.根據權利要求2所述的檢測dnmt3a基因r882h突變的試劑盒,其特征在于,還包括熒光探針,所述熒光探針的核苷酸序列為5~15個隨機堿基,所述熒光探針的5’端標記有熒光基團,所述熒光探針的3’端標記有淬滅基團。
4.根據權利要求3所述的檢測dnmt3a基因r882h突變的試劑盒,其特征在于,所述熒光基團為fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe或texas?red,所述淬滅基團為tamra、dabcyl、mgb、bhq-1、bhq-2或bhq-3。
5.一種檢測dnmt3a基因r882h突變的方法,其特征在于,使用權利要求2~4任一項所述的試劑盒,包括以下步驟:使用所述擴增引物分別對待測樣本骨髓穿刺物的基因組dna和健康人基因組dna進行pcr擴增后,對pcr擴增產物進行crispr/cas12酶切反應,再讀取熒光值。
6.根據權利要求5所述的檢測dnmt3a基因r882h突變的方法,其特征在于,所述pcr擴增的反應體系包括:mastermix?25μl,終濃度均為0.4~0.6μm的正向引物和反向引物,5~20μl模板、無核酸酶水加至50μl。
7.根據權利要求5所述的檢測dnmt3a基因r882h突變的方法,其特征在于,所述pcr擴增的反應程序為:預變性30s;變性10s,退火10s,延伸10s,循環35次。
8.根據權利要求5所述的檢測dnmt3a基因r882h突變的方法,其特征在于,所述crispr/cas12酶切反應的反應體系包括:nebuffer?2μl,終濃度為0.05μm~0.2μm的cas12a,終濃度為0.05μm~0.2μm的crrna,15~25urecombination?rnase?inhibitor,0.25μm~1μm熒光探針,2μl~10μlpcr擴增產物,無核酸酶水加至20μl。
9.根據權利要求5所述的檢測dnmt3a基因r882h突變的方法,其特征在于,所述crispr/cas12酶切反應的反應溫度為37℃±2℃,反應時間為10~30min。
10.根據權利要求5~9任一項所述的檢測dnmt3a基因r882h突變的方法,其特征在于,還包括分析熒光值的步驟,當待測樣本的熒光值與健康人樣本的熒光值相比有顯著性差異時,則待測樣本的dnmt3a基因存在r882h突變。