本發明涉及病毒檢測領域,尤其涉及一種基于raa的豬輪狀病毒a群快速檢測方法。
背景技術:
1、豬輪狀毒病(porcine?rotavirus?disease,pord)是由豬輪狀病毒(porcinerotavirus,porv)引起的豬急性腸道傳染病,主要導致仔豬腹瀉、嘔吐、脫水和體內酸堿平衡紊亂等,多發于晚秋、冬季和早春等較冷的季節,發病豬多是8周齡以下的仔豬,尤其是日齡越小的仔豬,發病率和病死率越高。
2、重組酶介導核酸等溫擴增(recombinase-aidamplification,raa)技術是一種新型的核酸檢測方法,通常能夠在37~42℃的恒溫條件下反應30min快速完成擴增。
3、輪狀病毒(rotavirus,rv)基因型和基因群具有復雜的多樣性,根據vp6抗原特性和序列多樣性可以分為12種(rva-rvl),研究發現在豬中檢測到porva、porvb、porvc、porve和porvh,其中porva(輪狀病毒a群)被認為是最常見的與感染性腹瀉相關的輪狀病毒群。目前,porv常見的病原檢測方法主要有pcr、rt-pcr、熒光rt-pcr等,這些方法需高度依賴熒光pcr/pcr儀器等,且檢測靶標多為vp6、vp7等基因,其基因序列變異性較高,因此選擇保守性較高的靶標序列,并結合更為簡易的檢測技術,對porva(輪狀病毒a群)進行快速、便捷和低成本的檢測,在porv的臨床檢測和疫情控制中發揮重要作用。
技術實現思路
1、本發明的目的在于提供提出一種基于raa對輪狀病毒a群進行快速、便捷和低成本的檢測方法。
2、為了實現該目的,本發明的技術方案如下:
3、一種基于raa的豬輪狀病毒a群快速檢測方法,包括如下步驟:
4、1)檢測靶標序列的選擇
5、porv基因組由11個rna片段組成,其病毒粒子編碼6個結構蛋白(vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7)和6個非結構蛋白(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5、nsp6),在6個非結構蛋白中選取nsp4基因中相對保守的utr區域;
6、2)陽性標準品的制備
7、以步驟1)porva的nsp4基因中相對保守區域為模板進行合成,并克隆到載體(puc57?vecter)中,從而得到包含目的片段的重組質粒(puc57-vecter-porva-nsp4);
8、將重組質粒轉化大腸桿菌e.coli?dh5α中培養,擴增重組質粒并提取重組質粒作為陽性標準品,所獲質粒用超微量紫外分光光度計進行質粒濃度測定(85.3±0.4ng/μl),并進行拷貝數計算,并將陽性標準品稀釋,-20℃保存備用;
9、3)設計擴增引物
10、根據步驟1)中nsp4基因中相對保守區域,利用raa引物設計軟件設計3對引物,并經過blast驗證其特異性;
11、將raa引物分成6組,其6組raa引物為f1/r1、f1/r2、f2/r1、f2/r2、f3/r1、f3/r2;
12、4)特異性引物對的篩選
13、將陽性標準品按raa核酸擴增標準進行擴增,擴增結束后用1﹕1氯仿和苯酚混合溶液對擴增產物進行純化,純化后產物通過3%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析,篩選出電泳圖目的條帶明亮且呈現特異性擴增的引物組合;
14、5)porva熒光raa驗證
15、5-1)熒光raa檢測探針的選擇;
16、5-2)熒光raa擴增有效性檢測;
17、5-2)熒光raa擴增特異性檢測。
18、優選的,所述步驟1)中非結構蛋白nsp4基因中相對保守區域為3’utr區域,且區域保守序列片段為171bp。
19、優選的,所述步驟2)中陽性標準品的原濃度按照10×梯度作倍比稀釋,制備成4.50×1010~4.50×100copies/l。
20、優選的,所述步驟4)中的反應體系為buffer-a?25μl、depc水13.5μl、上游引物(10μm)2μl、下游引物(10μm)2μl、buffer-b?2.5μl、陽性標準品5μl,反應條件為39℃擴增20min。
21、優選的,所述步驟5-1)中熒光raa檢測探針的選擇根據步驟4)中引物的篩選結果,針對擴增的目的片段,設計合成1條適用于熒光raa的探針引物,并將各個引物配制成10μm,備用。
22、優選的,所述步驟5-2)熒光raa擴增有效性檢測包括以下步驟
23、以標準質粒作為陽性標準品,添加以被rox標記的探針,按raa核酸擴增熒光型擴增標準進行擴增,將反應混合液充分混勻后,得到的反應體系放入熒光pcr儀,立即進行raa擴增,得到擴增曲線。
24、優選的,所述步驟5-2)的反應體系為buffer-a?25μl、上游引物(10μm)2μl、下游引物(10μm)2μl、探針(10μm)0.6μl、depc水12.9μl、標準質粒5μl、buffer-b?2.5μl,反應條件為39℃擴增20min。
25、本發明的有益效果是:
26、本發明以porv的a群nsp4的3’utr區域為檢測靶標,建立熒光raa檢測技術對豬輪狀病毒a群進行檢測,在porv核酸檢測方面具有高效的擴增、低檢測限、溫度范圍適用性、良好的特異性和重復性等顯著的優勢,在豬的a群輪狀病毒迅速檢測和疫情控制中發揮重要作用。
1.一種基于raa的豬輪狀病毒a群快速檢測方法,其特征在于,包括如下步驟:
2.根據權利要求1所述的一種基于raa的豬輪狀病毒a群快速檢測方法,其特征在于:所述步驟1)中非結構蛋白nsp4基因中相對保守區域為3’utr區域,且區域保守序列片段為171bp。
3.根據權利要求1所述的一種基于raa的豬輪狀病毒a群快速檢測方法,其特征在于:所述步驟2)中陽性標準品的原濃度按照10×梯度作倍比稀釋,制備成4.50×1010~4.50×100copy/l。
4.根據權利要求1所述的一種基于raa的豬輪狀病毒a群快速檢測方法,其特征在于:所述步驟4)中的反應體系為buffer-a?25μl、depc?h2o?13.5μl、上游引物(10μm)2μl、下游引物(10μm)2μl、buffer-b?2.5μl、陽性標準品5μl,反應條件為39℃擴增20min。
5.根據權利要求1所述的一種基于raa的豬輪狀病毒a群快速檢測方法,其特征在于:所述步驟5-1)中熒光raa檢測探針的選擇根據步驟4)中引物的篩選結果,針對擴增的目的片段,設計合成1條適用于熒光raa的探針引物,并將各個引物配制成10μm,備用。
6.根據權利要求1所述的一種基于raa的豬輪狀病毒a群快速檢測方法,其特征在于,所述步驟5-2)熒光raa擴增有效性檢測包括以下步驟
7.根據權利要求6所述的一種基于raa的豬輪狀病毒a群快速檢測方法,其特征在于:所述步驟5-2)的反應體系為buffer-a?25μl、上游引物(10μm)2μl、下游引物(10μm)2μl、探針(10μm)0.6μl、depc水12.9μl、標準質粒5μl、buffer-b?2.5μl,反應條件為39℃擴增20min。