一種高表達trpE基因的L-色氨酸高產重組菌株及其應用的制作方法

本發明涉及基因工程及微生物領域，具體涉及一種高表達trpe基因的l-色氨酸高產重組菌株及其應用。本申請要求于2023年10月23日提交的發明專利申請申請號202311382658.9的優先權，其全部內容通過引用并入本文。

背景技術：

1、色氨酸是人類和動物生命活動所必需的氨基酸之一。對人類和動物的生長、發育、代謝起著重要的作用，也被廣泛用于醫藥、食品、飼料。生產方法包括:發酵法、蛋白水解法、化學合成法和酶促轉化法。我國中科院微生物研究所余志華等采用重組dna技術，成功地構建了能夠高效表達用于酶法生產的色氨酸合成酶基因工程菌e.coli，并進行了規模化生產。

2、其中，提高l-色氨酸產量的一種方式為針對色氨酸生產菌株的改造，主要基于基因轉錄水平，即dna轉錄為rna過程改造。主要包括理性改造和非理性改造。非理性改造主要采用物理、化學及生物誘變；理性改造主要對色氨酸代謝途徑中主要關鍵酶、阻遏代謝、轉運蛋白等相關合成基因序列進行敲除或/和過表達，實現對色氨酸產量和轉化率的提升。改造的具體方式包括：提高參與氨基酸生物合成的酶的活性和/或使所產生的l-氨基酸的反饋抑制減弱。

3、鄰氨基苯甲酸合酶(trpe)是色氨酸的重要合成酶，通過對trpe的編碼基因的改造，獲得trpe蛋白的變體，增強trpe蛋白的活性，或者減弱對trpe蛋白的反饋抑制均可提高l-色氨酸的產量。例如cn110438058b公開了一種重組菌株，所述重組菌株是在宿主菌株中trpe基因的編碼核苷酸序列前插入ptac強啟動子，獲得trpe基因表達增強的重組型菌株，提高了l-色氨酸的產量。cn111926002b公開了trpe的突變體及其在產l-色氨酸的基因工程菌中的應用，trpe蛋白中的a63位氨基酸殘基替換為v，解除終產物色氨酸對trpe的反饋抑制，l-色氨酸的產量有明顯提高。

4、目前小rna(srna)分子受到了廣泛關注，小的、未翻譯的rna存在于許多不同的生物體中，從細菌到哺乳動物。這些rna執行多種生物學功能。它們中的許多可以作為轉錄后水平的基因表達調節劑發揮作用，或者通過充當反義rna，通過與靶轉錄物的互補序列結合，或者通過與蛋白質相互作用。其中，小非編碼rna(sncrna)gcvb能夠與trpe基因結合，抑制trpe基因轉錄成mrna，導致l-色氨酸的產量降低。通過對dna的密碼子進行優化，解除小非編碼rna(sncrna)gcvb對trpe基因轉錄后水平的抑制作用，也是一種提高l-色氨酸產量的重要途徑。

5、但目前對于相關基因轉錄后水平的研究較少，更是缺少將其進行產業化應用的案例。

技術實現思路

1、針對現有技術的空缺，本發明針對于trpe基因的密碼子優化，獲得定點突變的色氨酸關鍵合成酶基因trpe(也可稱為trpe*基因)，解除sncrna?gcvb對trpe*基因的抑制，實現trpe*基因的高效表達，獲得高產l-色氨酸重組菌株。

2、本發明采用如下技術方案實現：

3、本發明提供一種trpe*基因，所述trpe*基因為trpe基因突變體，trpe*基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

4、本發明還提供了所述trpe*基因的構建方法，包括如下步驟：

5、(1)預測sncrna?gcvb的二級結構，及其與trpe基因的堿基序列結合作用位點；

6、(2)根據預測的結合位點，通過密碼子優化定點突變獲得trpe*基因，構建在合適拷貝的表達載體上過表達，驗證trpe*基因。

7、本發明還提供了一種trpe*基因表達框，所述表達框包括啟動子和可操縱地連接在所述啟動子后的編碼序列，所述編碼序列含有trpe*基因。

8、進一步地，所述編碼序列依次含有trpe*基因和gfp基因。

9、本發明還提供了一種重組載體，所述重組載體包含上述的trpe*基因或trpe*基因表達框。進一步地，所述重組載體為質粒載體。

10、本發明還提供了一種重組菌株，所述重組菌株包含上述的trpe*基因、trpe*基因表達框或重組載體。所述重組菌株可以為本領域已知的能夠代謝產生l-色氨酸的微生物；優選地，所述重組菌株為大腸桿菌，更優選大腸桿菌e.coli?mg1655。

11、本發明還提供了所述重組菌株的構建方法，包括如下步驟：

12、s1.1通過pcr擴增所述trpe*基因，得到重組片段，并對質粒載體進行雙酶切，得到線性化質粒載體；

13、s1.2將所述重組片段與線性化質粒載體連接，構建重組質粒；

14、s1.3以所述產l-色氨酸菌株為宿主菌株，將所述重組質粒轉化至宿主菌株，得到所述包含trpe*基因的重組菌株。

15、進一步地，所述步驟s1.3中，所述重組質粒通過電轉轉化至宿主菌株。

16、進一步地，所述步驟s1.1中的pcr擴增所述trpe*基因包括：

17、以公司合成的含有定點突變后的trpe*基因片段為模板，以引物p1和p2進行pcr擴增，獲得長度為1763bp的dna片段，即為trpe*基因；所述引物p1的核苷酸序列如seq?id?no:4所示，所述引物p2的核苷酸序列如seq?id?no:5所示。

18、進一步地，所述pcr擴增按如下方式進行：98℃預變性30s，98℃變性15s，50℃退火15s，以及72℃延伸60s(35個循環)。

19、本發明還提供了所述的trpe*基因、trpe*基因表達框或重組載體在生產l-色氨酸的應用。

20、與現有技術相比，本發明的有益效果至少包括：

21、(1)本發明首次探究了trpe基因轉錄后水平的反饋抑制，并通過trpe基因的密碼子優化，提高了l-色氨酸的的產量，具有產業化價值；

22、(2)本發明對trpe基因的密碼子優化，獲得定點突變的trpe*基因，通過解除sncrna?gcvb對trpe*基因的抑制，實現trpe*基因的高效表達，獲得高產l-色氨酸重組菌株，提供了一種提高l-色氨酸產量的新思路。

技術特征：

1.一種trpe*基因，其特征在于，所述trpe*基因為trpe基因突變體，trpe*基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

2.如權利要求1所述trpe*基因的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

3.一種trpe*基因表達框，其特征在于，所述表達框包括啟動子和可操縱地連接在所述啟動子后的編碼序列，所述編碼序列含有trpe*基因，所述trpe*基因的核苷酸序列如seqid?no:2所示。

4.如權利要求3所述的基因表達框，其特征在于，所述編碼序列依次含有trpe*基因和gfp基因。

5.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體包含權利要求1所述的trpe*基因、或權利要求3或4所述的trpe*基因表達框。

6.一種重組菌株，其特征在于，所述重組菌株包含權利要求1所述的trpe*基因、權利要求3或4所述的trpe*基因表達框、或權利要求5所述的重組載體。

7.如權利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為大腸桿菌e.colimg1655。

8.如權利要求6或7所述的重組菌株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，

10.權利要求1所述的trpe*基因、權利要求3或4所述的trpe*基因表達框、或權利要求5或6所述的重組載體在生產l-色氨酸的應用。

技術總結
本發明針對于trpE基因的密碼子優化，通過定點突變，獲得了色氨酸關鍵合成酶基因trpE*，核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，突變后的trpE*基因解除了sncRNA?GcvB對trpE*基因的抑制，實現trpE*基因的高效表達，從而獲得高產L?色氨酸重組菌株，提供了一種提高L?色氨酸產量的新思路。

技術研發人員：王均成,李斯琦,孫廣玲,馮小凡,張東旭,劉元濤,李學朋,來鳳堂
受保護的技術使用者：新疆阜豐生物科技有限公司
技術研發日：
技術公布日：2024/10/21