用于檢測近平滑念珠菌的引物探針組合及其試劑和試劑盒的制作方法

本發明涉及生物基因，尤其涉及用于檢測近平滑念珠菌的引物探針組合及其試劑和試劑盒。

背景技術：

1、假絲酵母菌，俗稱念珠菌，本屬菌有150多種，其中有11種對人有致病性，其中以白假絲酵母菌為最常見的致病菌。超過95％的ic由以下5種病原菌引起：白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌，其中，白色念珠菌是ic患者最常見的病原菌，占50％-70％。耳念珠菌，是日本2009年發現的一種新病原真菌物種，具有多重耐藥、高致死率、易于傳播以及鑒定困難等特征，被冠以“超級真菌”的稱號。

2、目前真菌傳統的檢測方法采用如直接鏡檢、培養及血清學檢測等，敏感性及特異性不高，檢出率低，報告周期長，難以用于早期檢測。全自動微生物鑒定系統能實現上百種病原真菌的準確鑒定，操作簡單，相對于培養等方法快速(6個小時左右)，但存在設備耗材價格昂貴等缺點。近年來發展起來的質譜方法也面臨設備昂貴問題，同時通量低，無法做到大量樣本同時檢測。

技術實現思路

1、本發明提供用于檢測近平滑念珠菌的引物探針組合及其試劑和試劑盒，以解決檢測樣本是否存在近平滑念珠菌的問題。

2、本發明提供的用于檢測近平滑念珠菌的引物探針組合，包括：組合10；

3、所述組合10包括：引物組10和探針10；所述引物組10的兩項引物序列分別為：如seq?id?no:19和seq?id?no:20所示的核苷酸序列；所述探針10的序列為：如seq?id?no:46所示的核苷酸序列。

4、進一步，本發明所述的引物探針組合，還包括：內標引物組和內標探針；

5、所述內標引物組的兩項引物序列分別為：如seq?id?no:55和seq?id?no:56所示的核苷酸序列；

6、所述內標探針的序列為：如seq?id?no:57所示的核苷酸序列。

7、本發明提供的用于檢測近平滑念珠菌的引物探針試劑，包括：如本發明所述的引物探針組合，以及用于檢測念珠菌的輔料或助劑；

8、所述輔料或助劑的組分包括：三羥甲基氨基甲烷、鎂離子、核糖核酸單體、dna聚合酶和udg酶。

9、本發明提供的試劑盒，包括：如本發明所述的引物探針組合或者如本發明所述的引物探針試劑。

10、進一步，本發明所述的試劑盒，還包括：洗滌液和超聲緩沖液；

11、所述洗滌液的組分包括：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和表面活性劑；其中，表面活性劑包括：聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚乙二醇辛基苯基醚和乙基苯基聚乙二醇；

12、所屬超聲緩沖液的組分包括：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和表面活性劑；表面活性劑包括：聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚乙二醇辛基苯基醚和乙基苯基聚乙二醇。

13、本發明提供的用于檢測近平滑念珠菌的引物探針組合、試劑和試劑盒，特異性強、靈敏度高，最低檢測限可以達到1cfu/pcr反應，整體檢測時間進一步縮短至1.5小時以內。

14、本發明使用保守性好且多拷貝的非its區域作為靶標，采用分子信標探針熔解曲線的方法，并且通過添加內源性內標，對pcr過程進行實時監控。

15、本發明的檢測試劑直接封裝在多孔位卡盒中，配套擴增反應系統一體機進行檢測，實現樣本進結果出，整個流程封閉設計，操作簡便，完全避免氣溶膠污染。

1.用于檢測近平滑念珠菌的引物探針組合，其特征在于，包括：組合10；

2.根據權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，還包括：內標引物組和內標探針；

3.用于檢測近平滑念珠菌的引物探針試劑，其特征在于，包括：如權利要求1或2所述的引物探針組合，以及用于檢測念珠菌的輔料或助劑；

4.試劑盒，其特征在于，包括：如權利要求1或2所述的引物探針組合或者如權利要求3所述的引物探針試劑。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括：洗滌液和超聲緩沖液；