一種魚類濾泡細胞的培養基配方及其培養方法

本發明涉及細胞生物學，具體涉及一種魚類濾泡細胞的培養基配方及其培養方法。

背景技術：

1、魚類的卵巢由一層薄的上皮組織、卵原細胞和外周包裹著濾泡細胞的卵母細胞組成。濾泡細胞在卵母細胞發育和成熟過程中具有十分重要的作用，因此明確魚類濾泡細胞的基因表達和環境響應，有助于進一步了解魚類的繁殖發育過程，而成功培養濾泡細胞是進行這些研究的基礎和必要條件，但目前暫無關于魚類濾泡細胞的培養方法。

技術實現思路

1、為解決上述問題，本發明提供了一種魚類濾泡細胞的培養基配方及其原代、傳代培養方法，彌補了目前魚類濾泡細胞培養方法的空白。

2、為達到上述目的，本發明采用的具體技術方案如下：

3、第一方面，本發明提供一種魚類濾泡細胞的培養基配方，包括以下組分：m199培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、表皮生長因子(egf)、人體絨膜促性腺激素(hcg)和激活素a(activin?a)。

4、進一步地，所述魚類濾泡細胞的培養基配方中，各組分含量為：10％m199培養基，10％胎牛血清，100u/ml青霉素，0.1mg/ml鏈霉素，5ng/ml表皮生長因子，10iu/ml人體絨膜促性腺激素，40ng/ml激活素a。其中，m199培養基、胎牛血清的含量均為體積分數，青霉素、鏈霉素、egf、hcg、activin?a的體積忽略不計。

5、本發明上述魚類濾泡細胞的培養基配方中，egf、hcg和activin?a組合能夠有效增強濾泡細胞的擴增速度和貼附力。如不添加則會導致濾泡細胞增長緩慢，貼壁后易脫落。

6、第二方面，本發明提供一種魚類濾泡細胞的培養方法，包括以下步驟：

7、s1.取發育至性成熟的雌性魚，對其進行麻醉、消毒和解剖，取出卵巢組織；

8、s2.將卵巢組織置于l-15培養基中，反復吹吸至卵細胞分離，將粘液、結締組織等雜質吸出，保留卵細胞，再加入l-15培養基，重復上述操作，至l-15培養基加入吹打后仍澄清；

9、s3.細胞篩過濾，保留100至400微米大小的pv-mv期的卵細胞(包括卵母細胞和其外周包裹的濾泡細胞)作為待培養細胞；

10、s4.加入上述配方的濾泡細胞培養基，吹打混勻后置于5％co2，28℃細胞培養箱中培養三天，完成原代培養；

11、s5.培養結束將未貼壁卵細胞和培養基吸出，添加濾泡細胞培養基，重新置于5％co2，28℃細胞箱中培養三天；

12、s6.將培養基吸出，pbs清洗細胞并用胰蛋白酶消化；再用含胎牛血清的m199培養基終止消化，離心棄上清，加入濾泡細胞培養基重懸細胞；

13、s7.使用100微米孔徑的細胞篩將細胞懸液過濾，收集過濾后的細胞懸液，并接種到濾泡細胞培養基，置于5％co2，28℃細胞培養箱中培養，實現傳代培養。

14、進一步地，步驟s1中，解剖取卵巢組織的方法為：將待取樣雌性魚從泄殖孔向上沿腹腔剪開至胸鰭下，后將剪開的皮膚和肌肉下拉打開腹腔至內臟團暴露，再取卵巢組織，過程中避免碰觸其他組織。

15、進一步地，步驟s2中，所述l-15培養基預熱至28℃后再使用。

16、進一步地，步驟s5中，培養三天后濾泡細胞貼壁占比達60-70％，此時通過胰蛋白酶消化、100微米細胞篩過濾可將卵母細胞和濾泡細胞分離，得到可傳代的濾泡細胞。

17、進一步地，步驟s6中，所述消化的條件為0.25％胰蛋白酶消化8分鐘，消化期間輕敲培養皿至大部分貼壁細胞漂浮。

18、進一步地，步驟s7中，接種的細胞濃度不低于105個活細胞/ml，細胞培養24小時后，即貼壁生長。

19、本發明上述魚類濾泡細胞的培養方法中，以下兩方面較為關鍵：一是培養前進行卵細胞的篩選，因為濾泡細胞在pv、ev和mv期(分別是卵黃蛋白前、早、中期)是處于快速生長期，選取此階段的卵細胞(即未分離的卵母和濾泡細胞整體)作為待培養細胞能夠實現濾泡細胞最大限度的貼壁擴增，pv-mv期細胞的大小在100-400微米之間，因此通過細胞篩過濾進行了篩選；若不進行篩選，會存在大量的pg和lv期細胞，該時期細胞濾泡不會貼壁擴增，同時會占據其他細胞的位置影響體外培養效果。二是解剖方式、取樣方式和清洗過程，這些步驟非常重要，若取樣中攜帶過多雜質，或培養前沒有完全清洗干凈，極易導致污染。

20、本發明具有以下有益效果：

21、1、本發明提出了魚類濾泡細胞的培養基配方，魚類濾泡細胞在該培養基配方中能夠進行高效的體外原代培養和擴增；

22、2、利用上述培養基，結合卵細胞篩選和體外培養步驟優化，成功進行了魚類濾泡細胞的原代和傳代培養，對后續進一步揭示濾泡細胞在魚類卵巢發育和成熟中的作用奠定基礎。

技術特征：

1.一種魚類濾泡細胞的培養基配方，其特征在于，包括以下組分：m199培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、表皮生長因子、人體絨膜促性腺激素和激活素a。

2.根據權利要求1所述的魚類濾泡細胞的培養基配方，其特征在于，各組分含量為：10％m199培養基，10％胎牛血清，100u/ml青霉素，0.1mg/ml鏈霉素，5ng/ml表皮生長因子，10iu/ml人體絨膜促性腺激素，40ng/ml激活素a。

3.一種魚類濾泡細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

4.根據權利要求3所述的魚類濾泡細胞的培養方法，其特征在于，步驟s1中，解剖取卵巢組織的方法為：將待取樣雌性魚從泄殖孔向上沿腹腔剪開至胸鰭下，后將剪開的皮膚和肌肉下拉打開腹腔至內臟團暴露，再取卵巢組織，過程中避免碰觸其他組織。

5.根據權利要求3所述的魚類濾泡細胞的培養方法，其特征在于，步驟s2中，所述l-15培養基預熱至28℃后再使用。

6.根據權利要求3所述的魚類濾泡細胞的培養方法，其特征在于，步驟s5中，培養三天后濾泡細胞貼壁占比達60-70％。

7.根據權利要求3所述的魚類濾泡細胞的培養方法，其特征在于，步驟s6中，所述消化的條件為0.25％胰蛋白酶消化8分鐘，消化期間輕敲培養皿至大部分貼壁細胞漂浮。

8.根據權利要求3所述的魚類濾泡細胞的培養方法，其特征在于，步驟s7中，接種的細胞濃度不低于105個活細胞/ml，細胞培養24小時后，即貼壁生長。

技術總結
本發明屬于細胞生物學技術領域，具體公開了一種魚類濾泡細胞的培養基配方及其培養方法，所述魚類濾泡細胞的培養基配方為：10％M199培養基，10％胎牛血清，100U/mL青霉素，0.1mg/mL鏈霉素，5ng/mL表皮生長因子，10IU/mL人體絨膜促性腺激素，40ng/mL激活素A。本發明提出了魚類濾泡細胞的培養基配方，并用該培養基結合卵細胞篩選和體外培養步驟優化成功進行了魚類濾泡細胞的原代和傳代培養，彌補了目前魚類濾泡細胞培養方法的空白，對后續進一步揭示濾泡細胞在魚類卵巢發育和成熟中的作用奠定基礎。

技術研發人員：袁明哲,張碧玉,王旭波,陳姍,方倩,王若馨,王龍迪
受保護的技術使用者：寧波大學
技術研發日：
技術公布日：2024/10/21