一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法

本發明涉及轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全性評價，更具體的說是涉及一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法。

背景技術：

1、在一種新型轉基因植物商業化之前，對非靶標生物的潛在風險評估，特別是對直接或者間接接觸有害食草動物的非靶標生物進行生態風險評估至關重要。在田間，如果非靶標生物對轉基因抗蟲植物產生的各種生態學效應敏感，且其直接以植物材料為食或以食用轉基因植物的獵物為食(暴露)，則非靶標生物可能處于危險之中。因此轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全性一直是研究人員關注的焦點。

2、目前轉基因抗蟲作物bt基因主要有cyt、cry和vip基因，其編碼的蛋白質對某些害蟲具有殺蟲作用，當殺蟲蛋白被敏感的昆蟲攝入時，在特定的生理條件下(ph)會被蛋白水解激活后與腸道受體結合，并導致腸道中毛孔的形成，導致離子平衡紊亂，最終導致昆蟲死亡。這種特異性是基于殺蟲蛋白技術的最關鍵屬性之一。針對轉基因植物表達的殺蟲蛋白對非靶標生物的安全評價已被廣泛開展。

3、目前，關于非靶標生物的安全性大多集中在生物學指標如：存活率、產仔數、體重等特征。但隨著分子、組學和微生物技術的廣泛應用，關于作用方式、特異性、植物時空表達模式和環境檢測等知識指導了轉基因植物對非靶標生物的風險評估。非靶標生物通過直接(直接接觸轉基因植物的花粉、花蜜、代謝物等)或間接(通過取食植食性生物或其他生物殘體)暴露風險，通過進食、消化進入非靶標生物腸道，并在中腸部分對進行消化和吸收。因此，尋找一種針對中腸的高效特異的評價方法非常重要。

4、微生物在自然屆中扮演了至關重要的角色，其與寄主有著相輔相成的關系，它們不僅構成了生物內部微生態平衡的一部分，還對免疫、營養吸收等方面有著積極的作用。腸道微生物則是生物體內最大的微生物群落，正常的腸道微生物群落的組成和作用對于宿主的健康至關重要，在宿主的生長發育、繁殖、消化、免疫以及提高種群適應性等生理功能中發揮了重要作用。因此，腸道微生物可以作為反映和評估生物體健康狀況的重要指標。

5、因此，開發一種針對中腸微生物的安全性評價方法至關重要。

技術實現思路

1、有鑒于此，特提出本發明。

2、本發明的方法不同于利用非靶標生物的先天特征，如發育、存活和繁殖等進行評價的方法。非靶標生物細菌群落對環境因素的敏感性高于宿主的先天特征，可以微觀洞察宿主對環境的適應性變化，因此更具有研究價值。

3、為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

4、本發明實施例一方面提供了一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法，過程包括：

5、1)選取同時期生長在對照植物環境下的非靶標生物、生長在轉基因抗蟲植物環境下的非靶標生物、生長在吡蟲啉處理的對照植物環境下的非靶標生物作為陽性對照；不同的生長環境作為不同的試驗處理，每一個試驗處理的非靶標生物數量不少于30頭；

6、2)解剖生物中腸，對中腸中的dna進行提取，pcr方法測定中腸中細菌的豐度，若轉基因抗蟲植物環境下的非靶標生物中腸的細菌豐度與生長在對照植物環境下的非靶標生物中腸中的細菌豐度無顯著性差異，則轉基因抗蟲植物對非靶標生物無安全性風險。

7、在優選的實施方式中，步驟1)中，所述非靶標生物若為單一植食性生物，收取直接取食對照植物、轉基因抗蟲植物和陽性對照的樣品；所述非靶標生物若為植食性/肉食性生物，在保證正常存活的情況下，收取取食對照植物、轉基因抗蟲植物和陽性對照的樣品；所述非靶標生物若為單一肉食性生物，通過植物-食草動物-非靶標生物三級傳遞收取樣品。

8、在優選的實施方式中，步驟2)中，pcr方法中，引物為通用引物338f/806r，如seqisd?no.1～seq?id?no.2所示。

9、在優選的實施方式中，pcr反應體系為10μl，具體包括：transstart?green?qpcrsupermix酶5μl；10mm正反引物分別為0.5μl；200ng/μl模板dna?1μl；h2o?3μl，模板dna的量為1ng。

10、在優選的實施方式中，pcr采用steponeplustmreal-time?pcr系統，循環條件為95℃3min，然后進行40次兩步pcr循環，條件為95℃5s、60℃30s。

11、在優選的實施方式中，步驟2)中，所述細菌豐度為dna拷貝數。

12、經由上述的技術方案可知，與現有技術相比，本發明提供了一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法，通過解剖同時期生長在常規植物和轉基因抗蟲植物非靶標生物的腸道，檢測中腸微生物群落絕對豐度的差異，來評價轉基因植物對非靶標生物的安全性。本發明建立了一種精準的科學評價方法，更能高效準確的體現轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全性，對完善轉基因作物種植的安全性具有重要意義。

技術特征：

1.一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法，其特征在于，過程包括：

2.根據權利要求1所述的一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法，其特征在于，步驟1)中，所述非靶標生物若為單一植食性生物，收取直接取食對照植物、轉基因抗蟲植物和陽性對照的樣品；所述非靶標生物若為植食性/肉食性生物，在保證正常存活的情況下，收取取食對照植物、轉基因抗蟲植物和陽性對照的樣品；所述非靶標生物若為單一肉食性生物，通過植物-食草動物-非靶標生物三級傳遞收取樣品。

3.根據權利要求1所述的一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法，其特征在于，步驟2)中，pcr方法中，引物為通用引物338f/806r，如seq?isd?no.1～seq?id?no.2所示。

4.根據權利要求3所述的一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法，其特征在于，pcr反應體系為10μl，具體包括：transstart?green?qp?cr?supermix酶5μl；10mm正反引物分別為0.5μl；模板dna?1μl；h2o?3μl。

5.根據權利要求4所述的一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法，其特征在于，模板dna的量為1ng。

6.根據權利要求4所述的一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法，其特征在于，pcr采用steponeplustmreal-time?pcr系統，循環條件為95℃?3min，然后進行40次兩步pcr循環，條件為95℃?5s、60℃30s。

7.根據權利要求1所述的一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法，其特征在于，步驟2)中，所述細菌豐度為dna拷貝數。

技術總結
本發明公開了一種轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全評價方法，涉及轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全性評價技術領域，選取同時期生長在對照植物環境下的非靶標生物、生長在轉基因抗蟲植物環境下的非靶標生物、生長在陽性對照植物環境下的非靶標生物，解剖生物中腸，提取DNA，PCR測定DNA拷貝數，若轉基因抗蟲植物環境下的非靶標生物中腸的細菌豐度與生長在對照植物環境下的非靶標生物中腸中的細菌豐度無顯著性差異，則轉基因抗蟲植物對非靶標生物無安全性風險。本發明建立了一種精準的科學評價方法，更能高效準確的體現轉基因抗蟲植物對非靶標生物的安全性，對完善轉基因作物種植的安全性具有重要意義。

技術研發人員：高雪珂,劉偉嬌,崔金杰,雒珺瑜,張開心,李東陽,姬繼超,朱香鎮,王麗
受保護的技術使用者：中國農業科學院棉花研究所
技術研發日：
技術公布日：2024/10/21