雙特異性抗體蛋白的層析純化方法與流程

本申請屬于抗體純化，具體涉及一種雙特異性抗體蛋白的層析純化方法。

背景技術：

1、雙特異性抗體是指能同時特異性結合兩個抗原或抗原表位的人工抗體，雙特異性抗體在自然條件下并不存在，而是通過細胞融合或重組dna技術制備實現的。由于其特異性和雙功能性，現已成為抗體工程領域的研究熱點，在腫瘤治療及自身免疫病等領域中具有廣闊的應用前景。

2、哺乳動物細胞生產的雙抗純化工作是一項復雜的過程，包括捕獲、初步純化和精細純化等多個步驟。細胞培養液中目的蛋白捕獲是一個關鍵步驟，對于有標簽的目的蛋白通常采用親和層析，無標簽的目的蛋白常采用離子交換和疏水層析。這幾種方式都有其缺陷方面，如親和層析填料昂貴，增加成本；離子交換和疏水層析選擇性較差，收率較低，需要大量的工藝開發時間。對于精細純化，保證回收率的同時提高樣品的純度也是純化的難點之一，由于蛋白料液的雜質較多，需要嘗試不同原理的方法組合，并保證過程中樣品的活性的維持。如何指定合理的方案，保證回收率的情況下，提高樣品的純度，是工藝開發的難點。

技術實現思路

1、本申請的目的在于提供一種雙特異性抗體蛋白的層析純化方法，以解決現有技術中雙抗純化存在的填料昂貴、成本高、選擇性差、回收率低的問題。

2、為實現上述目的，本申請采用的一個技術方案是：

3、提供了一種雙特異性抗體蛋白的層析純化方法，包括：

4、在疏水電荷誘導填料上加載第一平衡液，將含有目的蛋白的料液加載在所述疏水電荷誘導填料上，上樣完成后依次在所述疏水電荷誘導填料上加載所述第一平衡液、洗雜液、淋洗液，之后采用第一洗脫液洗脫目的蛋白，得到收集液；

5、將經過所述疏水電荷誘導填料的所述洗雜液和所述淋洗液依次加載在陰離子組件上進行預平衡和平衡，之后將所述收集液加載在所述陰離子組件上，收集流穿液；

6、在羥基磷灰石填料上加載第二平衡液，將所述流穿液加載在所述羥基磷灰石填料上，上樣完成后在所述羥基磷灰石填料上加載所述第二平衡液，之后采用第二洗脫液洗脫目的蛋白，收集得到目的蛋白。

7、在一個或多個實施方式中，所述第一平衡液包括20mm?tris-hac和150mm氯化鈉，所述第一平衡液的ph為7.0，所述在疏水電荷誘導填料上加載第一平衡液的步驟中所述第一平衡液的加載量為大于等于5倍柱體積，所述上樣完成后依次在所述疏水電荷誘導填料上加載所述第一平衡液、洗雜液、淋洗液的步驟中所述第一平衡液的加載量為大于等于5倍柱體積。

8、在一個或多個實施方式中，所述洗雜液包括氯化鈉、鹽酸精氨酸和醋酸醋酸鈉，所述氯化鈉的濃度大于1.0m，所述洗雜液的ph為5.0～5.5，所述洗雜液的加載量為大于等于5倍柱體積。

9、在一個或多個實施方式中，所述洗雜液包括20mm醋酸醋酸鈉、1.3m氯化鈉和0.2m鹽酸精氨酸，所述洗雜液的ph為5.5。

10、在一個或多個實施方式中，所述淋洗液包括醋酸醋酸鈉，所述淋洗液的ph為5.0～5.5，且所述淋洗液不包括氯化鈉，所述淋洗液的加載量為大于等于5倍柱體積。

11、在一個或多個實施方式中，所述第一洗脫液包括醋酸醋酸鈉，所述第一洗脫液的ph為4.0～4.5。

12、在一個或多個實施方式中，所述第二平衡液包括磷酸鹽和氯化鈉，且所述第二平衡液的ph為6.5～7.5，所述在羥基磷灰石填料上加載第二平衡液的步驟中所述第二平衡液的加載量為大于等于3倍柱體積，所述上樣完成后在所述羥基磷灰石填料上加載所述第二平衡液的步驟中所述第二平衡液的加載量為大于等于3倍柱體積。

13、在一個或多個實施方式中，所述第二洗脫液包括磷酸鹽和鹽酸精氨酸，且所述第二洗脫液的ph為6.5～7.0，所述鹽酸精氨酸的濃度為1.2～1.8m。

14、在一個或多個實施方式中，所述之后采用第二洗脫液洗脫目的蛋白，收集得到目的蛋白的步驟中所述洗脫為0-100％線性洗脫，所述第二洗脫液的洗脫體積為20倍柱體積，所述收集為uv收集。

15、區別于現有技術，本申請的有益效果是：

16、本申請的層析純化方法通過組合多種層析步驟，能夠在保證產品單體純度的前提，有效提高收率，hcp水平低至3.1ppm，sec-hplc單體純度達到99.2％，同時填料成本低，經濟效益更高。

技術特征：

1.一種雙特異性抗體蛋白的層析純化方法，其特征在于，包括：

2.根據權利要求1所述的層析純化方法，其特征在于，所述第一平衡液包括20mm?tris-hac和150mm氯化鈉，所述第一平衡液的ph為7.0，所述在疏水電荷誘導填料上加載第一平衡液的步驟中所述第一平衡液的加載量為大于等于5倍柱體積，所述上樣完成后依次在所述疏水電荷誘導填料上加載所述第一平衡液、洗雜液、淋洗液的步驟中所述第一平衡液的加載量為大于等于5倍柱體積。

3.根據權利要求1所述的層析純化方法，其特征在于，所述洗雜液包括氯化鈉、鹽酸精氨酸和醋酸醋酸鈉，所述氯化鈉的濃度大于1.0m，所述洗雜液的ph為5.0～5.5，所述洗雜液的加載量為大于等于5倍柱體積。

4.根據權利要求3所述的層析純化方法，其特征在于，所述洗雜液包括20mm醋酸醋酸鈉、1.3m氯化鈉和0.2m鹽酸精氨酸，所述洗雜液的ph為5.5。

5.根據權利要求1所述的層析純化方法，其特征在于，所述淋洗液包括醋酸醋酸鈉，所述淋洗液的ph為5.0～5.5，且所述淋洗液不包括氯化鈉，所述淋洗液的加載量為大于等于5倍柱體積。

6.根據權利要求1所述的層析純化方法，其特征在于，所述第一洗脫液包括醋酸醋酸鈉，所述第一洗脫液的ph為4.0～4.5。

7.根據權利要求1所述的層析純化方法，其特征在于，所述第二平衡液包括磷酸鹽和氯化鈉，且所述第二平衡液的ph為6.5～7.5，所述在羥基磷灰石填料上加載第二平衡液的步驟中所述第二平衡液的加載量為大于等于3倍柱體積，所述上樣完成后在所述羥基磷灰石填料上加載所述第二平衡液的步驟中所述第二平衡液的加載量為大于等于3倍柱體積。

8.根據權利要求1所述的層析純化方法，其特征在于，所述第二洗脫液包括磷酸鹽和鹽酸精氨酸，且所述第二洗脫液的ph為6.5～7.0，所述鹽酸精氨酸的濃度為1.2～1.8m。

9.根據權利要求1所述的層析純化方法，其特征在于，所述之后采用第二洗脫液洗脫目的蛋白，收集得到目的蛋白的步驟中所述洗脫為0-100％線性洗脫，所述第二洗脫液的洗脫體積為20倍柱體積，所述收集為uv收集。

技術總結
本申請公開了一種雙特異性抗體蛋白的層析純化方法，方法包括在疏水電荷誘導填料上加載第一平衡液，將料液加載在疏水電荷誘導填料上，依次加載第一平衡液、洗雜液、淋洗液，洗脫目的蛋白得到收集液；將經過洗雜液和淋洗液依次加載在陰離子組件上進行預平衡和平衡，將收集液加載在陰離子組件上，收集流穿液；在羥基磷灰石填料上加載第二平衡液，將流穿液加載在羥基磷灰石填料上，加載第二平衡液，洗脫目的蛋白。本申請的層析純化方法通過組合多種層析步驟，能夠在保證產品單體純度的前提，有效提高收率，HCP水平低至3.1ppm，SEC?HPLC單體純度達到99.2％，同時填料成本低，經濟效益更高。

技術研發人員：宋明凱,張正亮,朱一翔,潘正驊,陳霖杰,劉青青,曹琬婷
受保護的技術使用者：康日百奧生物科技（蘇州）有限公司
技術研發日：
技術公布日：2024/10/21