一種廣譜性抗菌肽及其制備方法和應用與流程

本發明涉及生物，具體涉及一種廣譜性抗菌肽及其制備方法和應用。

背景技術：

1、抗菌肽(amps)又稱宿主防御肽，通常是由7～100個氨基酸組成的小分子多肽，廣泛存在于自然界的各種生物中，是生物體天然免疫防御系統的一個重要組成部分。研究顯示，抗菌肽具有多種生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗寄生蟲和抗腫瘤活性等，相比傳統抗生素具有較低的耐藥發生率，被認為是解決細菌耐藥性問題的最佳選擇。

2、抗菌肽作為當前抗菌和抗病毒藥物開發的重要對象，存在以下問題：

3、(1)安全性有限。多數抗菌肽通過破壞細胞膜殺滅微生物，由于膜成分相似，同時也可能破壞人體內的正常細胞，濃度高時出現溶血效應。

4、(2)設計改造難。為使抗菌肽同時具有抑菌效果好、溶血作用低等性質，研究者通常采用氨基酸殘基替換、化學修飾、抗菌肽組合等方式人工設計改造天然抗菌肽。此類設計方法過于依賴于研究者對多肽性質的充足先驗知識，過程繁瑣，成功率低。此類方法中可供改造的多肽序列范圍也受限于已有的amp序列庫，不能直接生成全新的amp序列。

5、隨著人工智能的興起，深度學習模型可以快速學習大量已知藥物的樣本，完成訓練的生成模型可直接采樣生產全新的藥物分子，判別模型可通過預測這些分子的屬性篩選識別出新的潛在成藥對象，有效加快藥物設計進程。專利cn117343148a公開了一種通過人工智能生成模型直接生成的抗菌肽，該抗菌肽具有較低的細胞毒性和溶血活性，但是可抑制的細菌種類有限，在廣譜抗菌方面有一定的限制性。

技術實現思路

1、針對現有技術的不足，本發明旨在利用深度學習模型提供一種兼具蜂毒肽廣譜抗菌活性和使用安全性的抗菌肽。

2、為達此目的，本發明采用如下技術方案：

3、第一個方面，本發明提供了一種廣譜性抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列為gecegnnrpvkkpqprkklprfkkc-nh2。

4、作為一種優選的實施方式，所述抗菌肽抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌。

5、作為一種優選的實施方式，所述革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、綠膿桿菌，所述革蘭氏陽性菌包括金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌，所述真菌包括白色念珠菌。

6、第二個方面，本發明提供了一種廣譜性抗菌肽在化妝品、口腔護理產品中的應用。

7、第三個方面，本發明提供了一種廣譜性抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：

8、s1：基于蜂毒肽ia的氨基酸序列gnnrpvyipqprpphpri-nh2，預測設計得到所述抗菌肽的氨基酸序列；

9、s2：將預測的抗菌肽進行基因合成，并插入在質粒中構建重組質粒；

10、s3：將重組質粒導入大腸桿菌，在含40-60μg/ml?amp的lb平板中涂布并過夜培養，選取優質菌落進行測序確認，獲得重組菌；

11、s4：將重組菌活化，誘導表達，分離純化，收集得到抗菌肽。

12、作為一種優選的實施方式，所述步驟s1中采用深度學習模型抗菌肽預測工具ampeppy設計抗菌肽。

13、作為一種優選的實施方式，對所述步驟s2中預測的抗菌肽進行基因合成，合成堿基序列為：

14、aaggccatggggtgaatgcgaaggtaacaatcgtccggttaaaaaacca?caaccgcgtaaaaaactgccacgtttcaagaaatgctaaaagcttgcgg。

15、作為一種優選的實施方式，所述步驟s2的具體步驟為：將抗菌肽進行基因合成，插入在質粒pet32a(+)中ncoⅰ與hindⅲ酶切位點之間，構建重組質粒，如附圖1所示，即pet32a(+)-(ia-1)重組質粒。

16、作為一種優選的實施方式，所述步驟s3的具體步驟為：將重組質粒pet32a(+)-(ia-1)導入大腸桿菌bl21(de3)，在含有40-60μg/ml?amp(氨芐西林)的lb培養基平板中35-38℃過夜培養，各平板分別挑選3個優質菌落進行測序確認，最終獲得重組菌。

17、作為一種優選的實施方式，步驟s4誘導表達的具體步驟為：

18、m1：將重組菌活化，挑取單菌落接種于含40-60μg/ml?amp的lb液體培養基中，35-38℃振蕩培養6-8h，然后按照菌液：培養基體積比1：(80～120)的比例將菌液轉接于新鮮的含40-60μg/ml?amp的lb液體培養基中，35-38℃振蕩培養至od600為0.6～0.8，加入終濃度為0.3-0.7mm的iptg，在16～25℃下過夜誘導表達12-48h；

19、m2：誘導表達后，室溫下將菌體離心，收集菌體沉淀，按照菌體沉淀：裂解液體積比1:(15～30)的比例，往菌體沉淀中加入裂解液，并在冰浴條件下對菌體細胞進行超聲破碎，破碎完成后離心，收集上清液。

20、優選地，所述裂解液組成包括20mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mm?nacl，ph為7.2-7.5。

21、作為一種優選的實施方式，所述步驟s4分離純化的具體步驟為：

22、h1：將步驟m2中收集的上清液用0.2-0.8μm濾膜過濾，得濾液；

23、h2：在冰水浴下，將濾液與ni樹脂按照1：(0.3～1.5)的體積比攪拌混合40-60min，然后將ni樹脂裝入層析柱，先用緩沖液a洗去雜蛋白，再用緩沖液b洗脫，收集洗脫液；

24、h3：向洗脫液中加入終酶活為0.08-0.15u的腸激酶，先在14-18℃下反應10-14h，再在50-70℃條件下反應20-40min，最后在10000-14000rpm下離心10-20min，收集上清液；

25、h4：將上清液置于截留分子量為1kda的超濾離心管中，在3000-5000rpm下離心10-20min；按照截流液：pbs溶液體積比為1:(10～30)的比例，用10-30mm的pbs溶液洗滌截流液，并在3000-5000rpm下離心，重復三次，收集截流液，即為抗菌肽溶液。

26、優選地，所述緩沖液a包含100mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mm?nacl；所述緩沖液b包含500mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mm?nacl。

27、第三個方面，本發明提供了一種如第一和第二方面所述的廣譜性抗菌肽在化妝品、口腔護理產品中的應用。

28、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

29、(1)本發明提供的抗菌肽具有廣譜抗菌活性、熱穩定性和低溶血性；對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、痤瘡丙酸桿菌均具有很好的抑制效果。

30、(2)本發明提供的廣譜性抗菌肽利用深度學習模型篩選預測概率＞95％的抗菌肽進行設計，采用生物工程技術制備得到，具有篩選工作量小，篩選周期短、篩選效率高的特點。

技術特征：

1.一種廣譜性抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列為gecegnnrpvkkpqprkklprfkkc-nh2。

2.根據權利要求1所述廣譜性抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌。

3.根據權利要求2所述廣譜性抗菌肽，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、綠膿桿菌，所述革蘭氏陽性菌包括金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌，所述真菌包括白色念珠菌。

4.一種根據權利要求1-3任一項所述廣譜性抗菌肽在化妝品、口腔護理產品中的應用。

5.一種根據權利要求1-3任一項所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據權利要求5所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述步驟s1中采用深度學習模型抗菌肽預測工具ampeppy設計抗菌肽，所述步驟s2中合成的基因插入在質粒pet32a(+)的ncoⅰ與hindⅲ酶切位點之間，構建重組質粒。

7.根據權利要求5所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述步驟s4誘導表達的具體步驟為：

8.根據權利要求7所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述裂解液a的組成包含20mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mm?nacl，ph為7.2-7.5。

9.根據權利要求7所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述步驟s4分離純化的步驟為：

10.根據權利要求9所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述緩沖液a包含100mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mm?nacl；所述緩沖液b包含500mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mmnacl。

技術總結
本發明公開了一種廣譜性抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列為GECEGNNRPVKKPQPRKKLPRFKKC?NH2。本發明以蜂毒肽為基礎，基于深度學習模型預測設計抗菌肽，得到廣譜抑菌、熱穩定、低溶血性的抗菌肽，對皮膚致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、痤瘡丙酸桿菌具有較好的抑制效果。選擇深度學習模型抗菌肽預測工具amPEPpy預測為AMP氨基酸序列的肽進行篩選，采用生物合成技術，在大腸桿菌中表達、提取純化，減少了篩選的工作量和篩選周期，提高了篩選出廣譜、熱穩定的生物合成抗菌肽的概率。

技術研發人員：韋朝寶,湯杰,賀鳳,薛永永,張啟清,曾颯,倪軍,蔣震,馮海燕
受保護的技術使用者：廣州棟方生物科技股份有限公司
技術研發日：
技術公布日：2024/10/21