本發明涉及多發性骨髓瘤檢測,更具體地說是涉及一組用于多發性骨髓瘤個體化診斷的m蛋白完整輕鏈標志物及其應用。
背景技術:
1、多發性骨髓瘤(mm)是一種影響骨髓漿細胞的血癌,骨髓漿細胞產生過量的單克隆免疫球蛋白(ig),也稱為m蛋白。m蛋白對每個患者具有特異性,由重鏈(hc)(通常為igg或伊加同種型)和κ或λ輕鏈(lc)組成。惡性漿細胞有時僅過量產生免疫球蛋白的輕鏈組分,稱為游離輕鏈骨髓瘤。因此,正確監測mm患者血清中的m蛋白對于確定疾病狀態和評估治療療效至關重要。血清蛋白電泳(spep)和免疫固定電泳(ife)是血清中m蛋白定量和表征的最常用檢測方法。然而,臨床常用的,如isatuximab,daratumumab等治療性抗體藥物可通過spep和ife檢測試劑盒檢出,尤其是在iggκ型m蛋白患者中,這可能混淆這些檢測試劑盒的判讀。由于mm的臨床應答是基于m蛋白評估,因此臨床治療性抗體藥物對電泳試驗的干擾可能給予可檢出的假陽性m蛋白,可能導致患者治療應答測定不準確。
2、用于m蛋白鑒定的基于免疫富集偶聯質譜法的方法可提供血清pel和ife的高通量替代方法。最初的方法是基于lc-esi-q-tof-ms,并顯示出比基于凝膠的技術提供更高的分析靈敏度和特異性。隨后,由于需要更高通量的方法用于常規臨床分析,因此開發了另外2種方法:mass-screen和mass-fix(這兩種方法都涉及通過maldi-tof?ms進行還原的總免疫球蛋白免疫富集和總輕鏈(tlc)質量測量,可以目視檢查所得tlc質譜的與m蛋白的存在一致的特征,即在獨特的質荷比(m/z)處的相對較高強度峰。到目前為止,已證明這些方法具有與ife相當的分析靈敏度和與目前推薦的m蛋白篩查試劑盒(pel?eife?erflc)相當的臨床靈敏度。
3、質譜技術基于每個免疫球蛋白具有獨特的氨基酸序列并因此具有獨特的質量的原理。這種患者特異性質量隨時間推移而穩定,可用作疾病生物標志物。運用質譜法檢測m蛋白的方法主要有高效液相色譜與電噴霧質譜聯用(hplc-esi-ms)和基質輔助激光解吸電離飛行時間(maldi-tof)兩種。目前已經發表了兩種基于hplc-esi-ms的方法。第一種方法,基于lc-esi-ms/ms(串聯質譜法)測量來自ig互補決定區(cdr)的克隆型肽作為m蛋白的替代標記物。該方法需要首先獲得患者本人的m蛋白氨基酸序列,使得分析更加復雜和昂貴。患者特異性工作流程是該方法的主要缺點,其需要預先進行樣品分析以從患者的m蛋白cdr中鑒定獨特的肽,而后需要基于使用特定多反應監測(mrm)轉換對獨特肽的分析來開發患者特異性方法。此外,在某些情況下,克隆型肽可能產生不足的信號強度,使得該方法無效。第二種方法稱為“單克隆免疫球蛋白快速精確分子質量(miramm)",是一種基于ig輕鏈(lc)單一同位素質量的非靶向測量。在某些患者中,m蛋白僅以游離輕鏈單克隆蛋白的形式存在。miramm的工作流程比克隆型肽方法更簡單,特別是在樣品制備和數據分析階段。此外,由于工作流程不是m蛋白特異性的,因此其更適合于具有大量患者人群的臨床研究。盡管明確測定m蛋白lc質量需要診斷樣本(具有高m蛋白濃度的血清樣本),但非靶向分析能夠檢測其他單克隆抗體,例如治療性抗體或來自多克隆背景的內源性ig。此外,這種非靶向方法能夠檢測翻譯后修飾,例如糖基化,在一些患者的m蛋白中觀察到。然而,與克隆型肽方法相比,ig多克隆背景對ms信號的影響更大,這可能降低靈敏度,這是miramm方法的缺點。
4、maldi-tof?ms在常規篩查和m蛋白監測中非常有意義,因其較spep和ife的檢測限更優,較lc-esi-ms數據收集更快(每個樣品不到1分鐘),成本更低。maldi-tof?ms的臨床效用已在先前的研究中進行了評價。然而,臨床上尚未開發使用maldi-tof?ms檢測血液中m蛋白完整輕鏈(intact-mprotein?light?chain,imlc)的精確分子量實現多發性骨髓瘤患者的精準個體化定性分類的方法,也未從真實世界中發現用于診斷的多發性骨髓瘤疾病診斷標志物。
技術實現思路
1、有鑒于此,特提出本發明。
2、為了實現上述目的,本發明采用如下技術方案:
3、本發明實施例一方面在于提供一種用于檢測多發性骨髓瘤的特定質荷比的m蛋白輕鏈,包括如下任意一個或任意多個組合的分子量的m蛋白完整輕鏈:m/z,[m+h]+為22841.236、21097.850、22880.621、23769.722、23785.734、23770.710、22309.569、23404.634、23686.234、24409.956;或[m+2h]2+為11421.122、10549.429、11440.8145、11885.365、11893.371、11885.859、11155.289、11702.821、11843.621、12205.482。
4、本發明實施例第二方面在于提供特定質荷比的m蛋白輕鏈在制備檢測多發性骨髓瘤的試劑盒中的應用,所述特定質荷比的m蛋白輕鏈為權利要求1所述的m蛋白輕鏈。
5、本發明實施例第三方面在于提供一種檢測多發性骨髓瘤的試劑盒,包括檢測所述的m蛋白輕鏈的物質。
6、本發明實施例第四方面在于提供一種分離所述的m蛋白輕鏈的方法,過程包括:
7、s1:通過免疫親和微球初步捕獲血漿中的m蛋白完整輕鏈;
8、s2:通過10mm?pbs和純水清洗并去除雜質,以純化s1獲得的m蛋白完整輕鏈;
9、s3:對s2獲得的m蛋白完整輕鏈采用50mm?tecp溶液進行m蛋白完整輕鏈的釋放;
10、s3:通過maldi-tof質譜鑒定s3中釋放的富集的m蛋白完整輕鏈,得到該患者獨有的m蛋白完整輕鏈的分子量,并采用高分辨質譜esi-obitrap進行精確分子量校正。
11、本發明根據不同m蛋白的分子量實現對不同多發性骨髓瘤患者的精準個體化定性分類,避免目前臨床m蛋白檢測方法中治療性抗體藥物對m蛋白檢測的干擾。
1.一組用于多發性骨髓瘤個體化診斷的m蛋白完整輕鏈標志物,其特征在于,所述m蛋白輕鏈包括如下任意一個或任意多個組合的分子量的m蛋白完整輕鏈:m/z,[m+h]+為22841.236、21097.850、22880.621、23769.722、23785.734、23770.710、22309.569、23404.634、23686.234、24409.956;或[m+2h]2+為11421.122、10549.429、11440.8145、11885.365、11893.371、11885.859、11155.289、11702.821、11843.621、12205.482。
2.特定質荷比的m蛋白輕鏈在制備檢測多發性骨髓瘤的試劑盒中的應用,其特征在于,所述特定質荷比的m蛋白輕鏈為權利要求1所述的m蛋白輕鏈。
3.一種檢測多發性骨髓瘤的試劑盒,其特征在于,包括檢測權利要求1所述的m蛋白輕鏈的物質。
4.一種分離權利要求1所述的m蛋白輕鏈的方法,其特征在于,過程包括: