一種合成5-羥基色氨酸大腸桿菌MG1655菌株的構建方法

本發明屬于生物工程領域，涉及一種合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法，具體涉及一種合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法、一種合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655的菌株、一種含有5-羥基色氨酸的大腸桿菌培養物及一種合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法的應用。

背景技術：

1、5-羥基色氨酸，是一種氨基酸類物質。它在人體內可作為5-羥色胺的前體物質。一些雙盲研究表明5-htp能夠提高腦部血清素的濃度，改善憂郁癥及促進褪黑素的形成、改善睡眠品質，并抑制食欲，加納籽中含有豐富的5-羥基色氨酸，是制造5-htp的主要天然來源。在美國、英國和加拿大，5-htp被視作膳食補充劑（保健品）銷售。

2、cn?113549588?a?公開了一種大腸桿菌w3110生產5-羥基色氨酸的構建方法，并引入了人源2型色氨酸羥基化酶突變體和四氫蝶呤合成與再生途徑，打通色氨酸胞內羥化反應。

3、cn?115948311?a?公開了一種大腸桿菌w3110生產5-羥基色氨酸的構建方法，應用了一種異源表達活性高、毒性低的色氨酸羥化酶突變體，構建了更加高效的色氨酸羥化途徑；同時通過適度?表?達?異?源?來?源?于?e?x?i?g?u?o?b?a?c?t?e?r?d?i?u?msibiricum的葡萄糖脫氫酶(gdhesi)途徑，構建了nad(p)h再生途徑，最終大幅提高了工程菌株的5-htp產量，并有效降低了中間體l-trp的積累濃度。

4、大腸桿菌k-12?mg1655菌株被認為是一種適合工業生產的宿主菌株，除了具有最佳的代謝網絡外，其還具有較高的生長速度和強大的耐用性，常用于表達外源基因。所以使用代謝網絡清晰的大腸桿菌生產5-羥基色氨酸，對研究5-羥基色氨酸高產關鍵節點，增加5-羥基色氨酸產量，提高其工業價值具有重要意義。

技術實現思路

1、針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法。

2、為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：

3、第一方面，本發明提供一種合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法，所述構建方法包括如下步驟：

4、將ptrc-arogs180f基因替換tyrr基因、ptrc-serah344a/n364a基因替換yghx基因、ptrc-trpes40f基因替換trpe基因。并將基因luz15基因替換tnaa基因。

5、所述ptrc-arogs180f基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述ptrc-serah344a/n364a基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述ptrc-trpes40f基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述luz15基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述tyrr基因的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述yghx基因的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；所述trpe基因的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；所述tnaa基因的核苷酸序列如seq?id?no.8所示。

6、本發明創造性地將ptrc-arogs180f，ptrc-serah344a/n364a，ptrc-trpes40f導入大腸桿菌基因組，強化了前體物質色氨酸的合成，并且導入了與無需輔因子循環系統的luz15羥化酶。最終20ml發酵約50h可以得到約105mg/l5-羥基色氨酸。且該制備方法操作簡單，產量高，易于工業生產。

7、其中luz15為actinomadura?luzonensis來源的基因tryptophan?2,3-dioxygenase。ptrc-arogs180f，ptrc-serah344a/n364a，ptrc-trpes40f來源均為mg1655，后經人工合成得到。

8、第二方面，本發明提供一種合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655的菌株，所述合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655的菌株由權利要求1所述合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法制得。

9、第三方面，本發明提供一種含有5-羥基色氨酸的大腸桿菌培養物，所述培養物采用如下制備方法進行制備，所述制備方法包括：

10、將第一方面中所述合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655的菌株接種于培養基中，在32-40℃、120-200?rpm的條件下培養30-50?h即得。

11、第四方面，本發明提供如第三方面所述的含有5-羥基色氨酸的大腸桿菌培養物，所述培養基中含有na2hpo4、?kh2po4、?nacl、?nh4cl、?酵母提取物、葡萄糖，、檸檬酸、色氨酸、mgso4?.7h2o、?cacl2、?feso4?7h2o、?cucl2?2h2o、?cocl2?6h2o、?mncl2?4h2o、zncl2、na2moo4?2h2o和水。

12、第五方面，本發明提供如第一方面所述的合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法，所述構建方法在制備含5-羥基色氨酸藥品中的應用。

13、相對于現有技術，本發明具有以下有益效果：

14、1．本發明創造性地將ptrc-arogs180f，ptrc-serah344a/n364a，ptrc-trpes40f導入大腸桿菌基因組，強化了前體物質色氨酸的合成，并且導入了與無需輔因子循環系統的luz15羥化酶。最終20ml發酵約50h可以得到約105mg/l5-羥基色氨酸。且該制備方法操作簡單，產量高，易于工業生產。

技術特征：

1.一種合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法，所述構建方法包括如下步驟：

2.所述ptrc-arogs180f基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述ptrc-serah344a/n364a基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述ptrc-trpes40f基因的核苷酸序列如seqid?no.3所示；所述luz15基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述tyrr基因的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述yhgx基因的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；所述trpe基因的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；所述tnaa基因的核苷酸序列如seq?id?no.8所示。

3.如權利要求1所述的合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法，其特征在于，所述將ptrc-arogs180f基因、ptrc-serah344a/n364a基因、ptrc-trpes40f基因和luz15基因插入所述合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的基因組，插入位置分別為大腸桿菌mg1655的tyrr、yhgx、trpe、tnaa處。

4.一種合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655的菌株，其特征在于，所述合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655的菌株由權利要求1所述合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法制得。

5.一種含有5-羥基色氨酸的大腸桿菌培養物，其特征在于，所述培養物采用如下制備方法進行制備，所述制備方法包括：

6.如權利要求4所述的含有5-羥基色氨酸的大腸桿菌培養物，其特征在于，所述培養基中含有na2hpo4、?kh2po4、?nacl、?nh4cl、?酵母提取物、葡萄糖、檸檬酸、色氨酸、mgso4.7h2o、?cacl2、?feso4?7h2o、?cucl2?2h2o、?cocl2?6h2o、?mncl2?4h2o、zncl2、na2moo4?2h2o和水。

7.如權利要求1所述的合成5-羥基色氨酸大腸桿菌mg1655菌株的構建方法在制備含5-羥基色氨酸藥品中的應用。

技術總結
本發明提供一種合成5?羥基色氨酸大腸桿菌MG1655菌株的構建方法，所述構建方法包括如下步驟：將Ptrc?aroGS180F基因替換tyR基因、Ptrc?serAH344A/N364A基因替換yhgX基因、Ptrc?trpES40F基因替換trpE基因。并將基因luz15基因替換tnaA基因。使用本發明所述構建方法制得的重組MG1655?菌株的5?羥基色氨酸產量可達105mg/L。

技術研發人員：宋浩,竇廣進,熊博
受保護的技術使用者：天津大學
技術研發日：
技術公布日：2024/9/9